Name: Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Scopri come generare mutanti marcato e markerless in cianobatteri Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002. Questo metodo consente manipolazioni genetiche ripetute per la ricerca biotecnologica.

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<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I passi più critici nella generazione di mutanti non contrassegnate sono: 1) un&#39;attenta progettazione plasmide per garantire solo la regione di destinazione è alterata; 2) garantire che i campioni rimangano axeniche, soprattutto quando coltivate su saccarosio; 3) placcatura cellule per la generazione di mutanti marcati trasformato inizialmente su piastre di agar BG11 privi antibiotici, seguita da aggiunta di agar più antibiotici 24 ore successive; 4) la coltura segnato mutanti per 4 giorni interi prima di placcatura...

I cianobatteri sono un phylum evolutivamente antica e diversificata di batteri che si trovano in quasi tutti gli ambienti naturali della Terra. Negli ecosistemi marini sono particolarmente abbondanti e svolgono un ruolo chiave in molti cicli degli elementi nutritivi, che rappresentano circa la metà di fissazione del carbonio 1, la maggior parte dell&#39;azoto fissazione 2 e centinaia di milioni di tonnellate di produzione di idrocarburi 3 negli oceani ogni anno. Cloroplasti, l&#39;organello responsabile per la fotosintesi delle alghe e delle piante eucariotiche, è probabile che si sono evoluti da un cianobatterio che è stato inghiottito da un organismo ospite 4. Cianobatteri sono dimostrati utili organismi modello per lo studio della fotosintesi, trasporto di elettroni 5 e percorsi biochimici, molti dei quali sono conservati nelle piante. Inoltre cianobatteri sono sempre più utilizzati per la produzione di alimenti, biocarburanti 6, elettricità 7 e industriali composti 8, a causa della loro altaghly efficiente conversione di acqua e CO 2 alla biomassa utilizzando l&#39;energia solare 9. Molte specie possono essere coltivate su terreni non coltivabili con sostanze nutritive minime e acqua di mare, il che suggerisce che i cianobatteri potenzialmente potrebbero essere coltivate su larga scala senza compromettere la produzione agricola. Alcune specie sono anche fonti di prodotti naturali, tra cui antifungini, antibatteriche e anti-cancro composti 10,11. La capacità di generare mutanti è la chiave per comprendere la fotosintesi cianobatteri, biochimica e fisiologia, ed essenziale per lo sviluppo di ceppi per uso industriale. La maggior parte degli studi pubblicati generi geneticamente ceppi modificati mediante inserimento di una cassetta di resistenza antibiotica nel sito di interesse. Ciò limita il numero di mutazioni che possono essere introdotte in un ceppo, come solo alcune cassette di resistenza agli antibiotici sono disponibili per l&#39;uso in cianobatteri. I ceppi che contengono geni che conferiscono re antibioticoresistenza non può essere utilizzato per la produzione industriale in vasche aperte, che rischia di essere l&#39;unico mezzo di costo-efficacia per la produzione di biocarburanti e di altri prodotti a basso valore 12. La generazione di mutanti non marcate supera queste limitazioni. mutanti non marcate non contengono DNA estraneo, se non intenzionalmente incluso, e può essere manipolato più volte. Pertanto è possibile generare come molte modifiche in un ceppo lo desideri. Inoltre, gli effetti polari geni a valle del sito di modifica possono essere minimizzati, consentendo la modifica più precisa dell&#39;organismo 13. Per generare ceppi mutanti, plasmidi suicidi contenenti due frammenti di DNA identiche alle regioni nel cromosoma cianobatteri che fiancheggiano il gene da cancellare (definito il 5 &#39;e 3&#39; regioni fiancheggianti) sono prima costruiti. Due geni sono poi inseriti tra le regioni fiancheggianti. Uno di questi codifica una proteina resistenza agli antibiotici; il secondo codifica SACB, che produces levansucrasi, un composto che conferisce sensibilità al saccarosio. Nella prima fase del processo, mutanti marcati, cioè ceppi contenenti alcune DNA estraneo, vengono generati. Il costrutto plasmidico è mescolato con le cellule di cianobatteri e il DNA è occupato naturalmente dall&#39;organismo. I trasformanti sono selezionati dalla crescita su piastre di agar contenenti l&#39;antibiotico appropriato e il genotipo mutante verificata mediante PCR. plasmidi suicidio non può replicare entro il ceppo di interesse. Pertanto eventuali colonie resistenti agli antibiotici risulteranno da un evento di ricombinazione per cui il gene di interesse inserito nel cromosoma. Per generare mutanti non marcati, il mutante contrassegnata viene poi mescolato con un secondo plasmide suicida contenente solo i 5 &#39;e 3&#39; regioni fiancheggianti. Tuttavia, se è necessario l&#39;inserimento di DNA estraneo, un plasmide costituito dal 5 &#39;e 3&#39; delle regioni fiancheggianti con cassette contenenti i geni di interesse inserito tra questi frammenti di DNA, può essere utilizzato. Selection è attraverso la crescita su piastre di agar contenenti saccarosio. Come saccarosio è letale per le cellule quando il prodotto genico SACB è espresso, le uniche cellule che sopravvivono sono quelli in cui si è verificato un secondo evento di ricombinazione, per cui il gene sensibilità saccarosio, oltre al gene di resistenza agli antibiotici, è stato ricombinato fuori cromosoma e sul plasmide. Come conseguenza dello scambio ricombinazione, le regioni fiancheggianti e tutte DNA tra loro sono inseriti nel cromosoma. Abbiamo usato con successo questi metodi per generare mutazioni multiple cromosomiche nello stesso ceppo di Synechocystis sp. PCC6803 (di seguito denominato Synechocystis) 13,14, di introdurre mutazioni puntiformi singoli in un gene di interesse e 13 per l&#39;espressione di cassette geniche. Mentre la generazione di fori non marcati è stata dimostrata prima del nostro lavoro in Synechocystis 15,16, un metodo dettagliato, aiutato dauna presentazione visiva delle fasi critiche, non è a disposizione del pubblico. Abbiamo inoltre applicato lo stesso metodo per la generazione di fori evidenziati in un altro modello cianobatterio, Synechococcus sp. PCC7002 (di seguito denominato Synechococcus). Questo protocollo fornisce una chiara, semplice metodo per la generazione di mutanti e un rapido protocollo per la validazione e la memorizzazione di questi ceppi.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr>acido<td>citrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di ammonio ferrico</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cianocobalamina</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri 90 mm Greiner a tripla ventilazione</td><td></td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &; m filtri</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Palloni conici da 100 ml</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà&nbsp;</td>Kit di purificazione del <td>DNA Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasi di restrizione</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani brodo</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep plasmidico GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo da 14 ml</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &; m perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Lampadine fluorescenti</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron fotobioreattore</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di marcato e markerless mutanti nel modello di cianobatteri specie

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

I cianobatteri sono organismi ecologicamente importanti e potenziali piattaforme per la produzione di biocarburanti e prodotti industriali utili. La manipolazione genetica dei cianobatteri, in particolare di organismi modello come Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002, è uno strumento chiave sia per la ricerca di base che per quella applicata. La generazione di mutanti non marcati, in cui le alterazioni cromosomiche vengono introdotte in un ceppo tramite l'inserimento di una cassetta di resistenza agli antibiotici (un frammento di DNA manipolabile contenente uno o più geni), seguita dalla successiva rimozione di questa cassetta utilizzando un marcatore selezionabile negativo, è una tecnica particolarmente potente. I mutanti non marcati possono essere manipolati geneticamente ripetutamente, consentendo l'introduzione di tutte le alterazioni desiderate in un ceppo. Inoltre, l'assenza di geni che codificano proteine di resistenza agli antibiotici nel ceppo mutato è auspicabile, in quanto evita la possibilità di "fuga" di organismi resistenti agli antibiotici nell'ambiente. Tuttavia, i metodi dettagliati per cicli ripetuti di manipolazione genetica dei cianobatteri non sono ben descritti nella letteratura scientifica. Qui forniamo una descrizione completa di questa tecnica, che abbiamo utilizzato con successo per generare mutanti con delezioni multiple, mutazioni puntiformi singole all'interno di un gene di interesse e inserimento di nuove cassette geniche.

Disegno plasmide è fondamentale per la generazione di successo di entrambi i mutanti marcati e non marcati. Figura 1 è riportato un esempio di plasmide A e B utilizzato per generare una delezione mutanti nei geni Synechocystis cpcC1 e cpcC2 13. In ogni caso le 5 &#39;e 3&#39; regioni fiancheggianti sono circa 900-1.000 bp. regioni fiancheggianti ridotti possono essere utilizzati anche se la più piccola che abbiamo trialed successo è ...

L'introduzione di molteplici alterazioni genomiche nei cianobatteri è uno strumento essenziale nello sviluppo di ceppi per scopi industriali e di ricerca di base. Descriviamo un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica modello Synechocystis sp. PCC6803 e mutanti marcati in Synechococcus sp. PCC7002.

Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica Synechocystis PCC6803 e mutanti marcati nella specie Synechococcus PCC7002. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica cianobatterica. Come ad esempio come introdurre alterazioni cromosomiche in un ceppo.Mediante l'inserimento di un gene di resistenza agli antibiotici, seguito da una successiva rimozione di questa cassetta, utilizzando un marcatore selezionabile negativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ceppi possono essere manipolati geneticamente ripetutamente. Consentendo di introdurre in una varietà il numero di alternanze desiderato.Dopo aver preparato i terreni, i ceppi cianobatterici e i plasmidi, secondo il protocollo di testo. Impostare una nuova coltura inoculando un anello pieno di cellule cianobatteriche, in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura alla luce a 30 gradi Celsius per due o tre giorni, fino a un OD7500, pari a 0,2-0,6.Dopo l'incubazione, centrifugare da uno a due millilitri di coltura a 2.300 g per cinque minuti. Quindi, dopo aver scartato il surnatante, utilizzare il terreno BG11 per lavare i pellet una volta, pipettando delicatamente per risospendere le cellule. Poiché il vortice può comportare la perdita di pili, che sono essenziali per l'assorbimento del DNA.Dopo aver pellettato nuovamente le celle e rimosso il surnatante, aggiungere il terreno BG11 fino a un volume finale di 100 microlitri e trasferire le cellule in un tubo inferiore rotondo da 14 millilitri. Quindi, aggiungere 1 microgrammo di plasmide A precedentemente preparato alle cellule. E picchiettare delicatamente per mescolare.Quindi adagiare le provette orizzontalmente nell'incubatrice a 30 gradi Celsius e incubare per quattro-sei ore. Dopo l'incubazione, distribuire aliquote della miscela di DNA plasmidico per colture cellulari su piastre di agar BG11 senza antibiotici. E incubare a 30 gradi Celsius.Circa 24 ore dopo, preparare una soluzione di agar allo 0,6%, in acqua contenente kanamicina. E lasciarlo raffreddare a 42 gradi Celsius. Quindi aggiungere da 2,5 a tre millilitri ai bordi delle piastre di coltura e inclinare la piastra, in modo che la soluzione formi uno strato di agar superiore uniforme sulla superficie.Incubare le piastre per circa sette giorni affinché le colonie siano visibili. Quindi dividere una nuova piastra di agar BG11 più kanamicina in sei settori. E usa uno stuzzicadenti smussato per striare le singole colonie.Per eseguire la PCR, per confermare il knockout marcato, trasferire una piccola quantità di cellule in una provetta contenente 50 microlitri di acqua e circa 20 perle di vetro da 425 a 600 micrometri. Agitare le cellule e le perle a circa 2.000 giri/min per cinque minuti, prima di centrifugare a 15.700 g per cinque minuti. Quindi utilizzare cinque microlitri di surnatante per preparare reazioni PCR da 50 microlitri con preliminari di tack DNA.Per convalidare i mutanti, dopo aver progettato i primer secondo il protocollo di testo, il prodotto amplificato utilizzando il seguente programma e includere un controllo wild-type. Attraverso gelelektroforeses, verificare il genotipo dei trasformanti knockout. Mostra una banda di circa quattro coppie di kilobasi e manca la banda wild-type.Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. Se è ancora presente una banda wild-type, striare nuovamente il ceppo sulla piastra fresca e ripetere la PCR. Ripetere il processo di convalida fino a quando il mutante non è segregato e non si osserva alcuna banda wild-type nella reazione PCR.Per una varietà che mostra un marcato profilo mutante, rimasticare su una piastra nuova per utilizzarla per generare un knockout non marcato. Per generare mutanti di Synechocystis non marcati, impostare una nuova coltura del knockout marcato inoculando l'ansa piena di cellule in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura per due o tre giorni fino a e OD750, pari a 0,2 a 0,6.Centrifugare 10 millilitri di coltura a 2.300 g per cinque minuti e scartare il surnatante. Quindi usa BG11 medium per lavare delicatamente le cellule. Dopo aver aggiunto BG11 a un volume finale di 200 microlitri e aver trasferito le cellule in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri, aggiungere 1 microgrammo di DNA plasmidico B alle cellule e picchiettare delicatamente per mescolare.Quindi adagiare le provette orizzontalmente nell'incubatrice e incubare per quattro-sei ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,8 millilitri di terreno BG11 e incubare i campioni per un totale di quattro giorni con agitazione. Questo è un tempo sufficiente per consentire la ricombinazione nelle copie cromosomiche multiple.Piastra 50, 10 e 1 microlitro di aliquote della coltura trasformata su BG11 più piastre di agar saccarosio al 5% e incuba per circa sette giorni per generare singole colonie. Successivamente, usando uno stuzzicadenti smussato, schiudi da 30 a 50 singole colonie su piastre BG11 più kanamicina. Quindi applicare il patch su BG11 più il 5% di saccarosio.Le colonie che crescono su BG11 più saccarosio, ma non su piastre con kanamicina, sono potenziali knockout non marcati. È probabile che le colonie che crescono su entrambe le piastre siano resistenti al saccarosio a causa di una mutazione nel gene sacB. Seguendo il metodo PCR, dimostrato in precedenza in questo video, verificare i knockout non marcati, che produrranno una banda di gel corrispondente alla dimensione del tipo selvatico meno la regione eliminata.Se il ceppo mostra un profilo mutante non marcato, allora rimasticalo con agar BG11 fresco senza antibiotici. Per conservare i ceppi a lungo termine, allestire una nuova coltura del ceppo inoculando un anello pieno di cellule in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura per tre o quattro giorni fino a un OD750 pari a 0,4 a 0,7.Dopo aver utilizzato BG11 per lavare le celle una volta, risospendere il pellet in circa due millilitri di BG11. Aggiungere 0,8 millilitri di cellule concentrate in una provetta. Quindi aggiungere 0,2 millilitri di glicerolo sterilizzato con filtro all'80%.In un'altra provetta, aggiungere 0,93 millilitri di cellule concentrate e 0,07 millilitri di DMSO. Conservare entrambe le provette a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per ravvivare i ceppi, rimuovere il tubo e utilizzare uno stuzzicadenti smussato per raschiare alcune cellule su una piastra di agar senza antibiotici.Quindi utilizzare un anello sterile per striare normalmente. Questa figura mostra esempi di plasmidi A e B utilizzati per generare mutanti di delezione. In ogni caso, le cinque regioni prime e tre prime planking sono approssimativamente 900 a 1.000 coppie di basi.Il plasmide B può anche contenere una cassetta genica tra le regioni fiancheggianti di circa una coppia di kilobasi prime e tre prime. O una versione modificata della sequenza genica nativa. Dopo la trasformazione con il plasmide A, diverse centinaia di colonie appariranno su una piastra dopo sette-10 giorni.Se i geni non sono essenziali e i mutanti dimostrano una crescita, simile al ceppo wild-type, allora tutti i cromosomi dovrebbero contenere una copia npt1/sacB inserita in sequenza, come determinato tramite PCR. Se i geni non sono essenziali e i mutanti crescono lentamente, sono necessari diversi cicli di ri-streaking con concentrazioni crescenti di kanamicina per ottenere un mutante marcato segregato. Se dopo la ri-streaking, non si ottiene un mutante marcato, il gene è probabilmente essenziale per la sopravvivenza.La maggior parte delle singole colonie, ottenute dalla trasformazione con il plasmide B, saranno sensibili alla kanamicina e resistenti al saccarosio. Come dimostrato qui, l'amplificazione PCR della regione bersaglio in queste colonie, mostra che quasi il 100% del profilo mutante non marcato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in ore per un periodo di sei settimane se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di utilizzare la tecnica sterile. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la misurazione della produzione di ossigeno o la spettrometria di massa gascromatografica per rispondere a ulteriori domande, come la misurazione dei tassi fotosintetici o della produzione di metaboliti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica cianobatterica.Esplorare i processi biochimici e fisiologici chiave in questo phylum e i ceppi di sviluppo per scopi industriali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare knockout non marcati nelle specie di Synechococcus PCC6803.

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