Name: Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Scopri come generare mutanti marcato e markerless in cianobatteri Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002. Questo metodo consente manipolazioni genetiche ripetute per la ricerca biotecnologica.

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<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I passi più critici nella generazione di mutanti non contrassegnate sono: 1) un&#39;attenta progettazione plasmide per garantire solo la regione di destinazione è alterata; 2) garantire che i campioni rimangano axeniche, soprattutto quando coltivate su saccarosio; 3) placcatura cellule per la generazione di mutanti marcati trasformato inizialmente su piastre di agar BG11 privi antibiotici, seguita da aggiunta di agar più antibiotici 24 ore successive; 4) la coltura segnato mutanti per 4 giorni interi prima di placcatura...

I cianobatteri sono un phylum evolutivamente antica e diversificata di batteri che si trovano in quasi tutti gli ambienti naturali della Terra. Negli ecosistemi marini sono particolarmente abbondanti e svolgono un ruolo chiave in molti cicli degli elementi nutritivi, che rappresentano circa la metà di fissazione del carbonio 1, la maggior parte dell&#39;azoto fissazione 2 e centinaia di milioni di tonnellate di produzione di idrocarburi 3 negli oceani ogni anno. Cloroplasti, l&#39;organello responsabile per la fotosintesi delle alghe e delle piante eucariotiche, è probabile che si sono evoluti da un cianobatterio che è stato inghiottito da un organismo ospite 4. Cianobatteri sono dimostrati utili organismi modello per lo studio della fotosintesi, trasporto di elettroni 5 e percorsi biochimici, molti dei quali sono conservati nelle piante. Inoltre cianobatteri sono sempre più utilizzati per la produzione di alimenti, biocarburanti 6, elettricità 7 e industriali composti 8, a causa della loro altaghly efficiente conversione di acqua e CO 2 alla biomassa utilizzando l&#39;energia solare 9. Molte specie possono essere coltivate su terreni non coltivabili con sostanze nutritive minime e acqua di mare, il che suggerisce che i cianobatteri potenzialmente potrebbero essere coltivate su larga scala senza compromettere la produzione agricola. Alcune specie sono anche fonti di prodotti naturali, tra cui antifungini, antibatteriche e anti-cancro composti 10,11. La capacità di generare mutanti è la chiave per comprendere la fotosintesi cianobatteri, biochimica e fisiologia, ed essenziale per lo sviluppo di ceppi per uso industriale. La maggior parte degli studi pubblicati generi geneticamente ceppi modificati mediante inserimento di una cassetta di resistenza antibiotica nel sito di interesse. Ciò limita il numero di mutazioni che possono essere introdotte in un ceppo, come solo alcune cassette di resistenza agli antibiotici sono disponibili per l&#39;uso in cianobatteri. I ceppi che contengono geni che conferiscono re antibioticoresistenza non può essere utilizzato per la produzione industriale in vasche aperte, che rischia di essere l&#39;unico mezzo di costo-efficacia per la produzione di biocarburanti e di altri prodotti a basso valore 12. La generazione di mutanti non marcate supera queste limitazioni. mutanti non marcate non contengono DNA estraneo, se non intenzionalmente incluso, e può essere manipolato più volte. Pertanto è possibile generare come molte modifiche in un ceppo lo desideri. Inoltre, gli effetti polari geni a valle del sito di modifica possono essere minimizzati, consentendo la modifica più precisa dell&#39;organismo 13. Per generare ceppi mutanti, plasmidi suicidi contenenti due frammenti di DNA identiche alle regioni nel cromosoma cianobatteri che fiancheggiano il gene da cancellare (definito il 5 &#39;e 3&#39; regioni fiancheggianti) sono prima costruiti. Due geni sono poi inseriti tra le regioni fiancheggianti. Uno di questi codifica una proteina resistenza agli antibiotici; il secondo codifica SACB, che produces levansucrasi, un composto che conferisce sensibilità al saccarosio. Nella prima fase del processo, mutanti marcati, cioè ceppi contenenti alcune DNA estraneo, vengono generati. Il costrutto plasmidico è mescolato con le cellule di cianobatteri e il DNA è occupato naturalmente dall&#39;organismo. I trasformanti sono selezionati dalla crescita su piastre di agar contenenti l&#39;antibiotico appropriato e il genotipo mutante verificata mediante PCR. plasmidi suicidio non può replicare entro il ceppo di interesse. Pertanto eventuali colonie resistenti agli antibiotici risulteranno da un evento di ricombinazione per cui il gene di interesse inserito nel cromosoma. Per generare mutanti non marcati, il mutante contrassegnata viene poi mescolato con un secondo plasmide suicida contenente solo i 5 &#39;e 3&#39; regioni fiancheggianti. Tuttavia, se è necessario l&#39;inserimento di DNA estraneo, un plasmide costituito dal 5 &#39;e 3&#39; delle regioni fiancheggianti con cassette contenenti i geni di interesse inserito tra questi frammenti di DNA, può essere utilizzato. Selection è attraverso la crescita su piastre di agar contenenti saccarosio. Come saccarosio è letale per le cellule quando il prodotto genico SACB è espresso, le uniche cellule che sopravvivono sono quelli in cui si è verificato un secondo evento di ricombinazione, per cui il gene sensibilità saccarosio, oltre al gene di resistenza agli antibiotici, è stato ricombinato fuori cromosoma e sul plasmide. Come conseguenza dello scambio ricombinazione, le regioni fiancheggianti e tutte DNA tra loro sono inseriti nel cromosoma. Abbiamo usato con successo questi metodi per generare mutazioni multiple cromosomiche nello stesso ceppo di Synechocystis sp. PCC6803 (di seguito denominato Synechocystis) 13,14, di introdurre mutazioni puntiformi singoli in un gene di interesse e 13 per l&#39;espressione di cassette geniche. Mentre la generazione di fori non marcati è stata dimostrata prima del nostro lavoro in Synechocystis 15,16, un metodo dettagliato, aiutato dauna presentazione visiva delle fasi critiche, non è a disposizione del pubblico. Abbiamo inoltre applicato lo stesso metodo per la generazione di fori evidenziati in un altro modello cianobatterio, Synechococcus sp. PCC7002 (di seguito denominato Synechococcus). Questo protocollo fornisce una chiara, semplice metodo per la generazione di mutanti e un rapido protocollo per la validazione e la memorizzazione di questi ceppi.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr>acido<td>citrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di ammonio ferrico</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cianocobalamina</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri 90 mm Greiner a tripla ventilazione</td><td></td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &; m filtri</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Palloni conici da 100 ml</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà&nbsp;</td>Kit di purificazione del <td>DNA Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasi di restrizione</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani brodo</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep plasmidico GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo da 14 ml</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &; m perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Lampadine fluorescenti</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron fotobioreattore</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di marcato e markerless mutanti nel modello di cianobatteri specie

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

I cianobatteri sono organismi ecologicamente importanti e potenziali piattaforme per la produzione di biocarburanti e prodotti industriali utili. La manipolazione genetica dei cianobatteri, in particolare di organismi modello come Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002, è uno strumento chiave sia per la ricerca di base che per quella applicata. La generazione di mutanti non marcati, in cui le alterazioni cromosomiche vengono introdotte in un ceppo tramite l'inserimento di una cassetta di resistenza agli antibiotici (un frammento di DNA manipolabile contenente uno o più geni), seguita dalla successiva rimozione di questa cassetta utilizzando un marcatore selezionabile negativo, è una tecnica particolarmente potente. I mutanti non marcati possono essere manipolati geneticamente ripetutamente, consentendo l'introduzione di tutte le alterazioni desiderate in un ceppo. Inoltre, l'assenza di geni che codificano proteine di resistenza agli antibiotici nel ceppo mutato è auspicabile, in quanto evita la possibilità di "fuga" di organismi resistenti agli antibiotici nell'ambiente. Tuttavia, i metodi dettagliati per cicli ripetuti di manipolazione genetica dei cianobatteri non sono ben descritti nella letteratura scientifica. Qui forniamo una descrizione completa di questa tecnica, che abbiamo utilizzato con successo per generare mutanti con delezioni multiple, mutazioni puntiformi singole all'interno di un gene di interesse e inserimento di nuove cassette geniche.

Disegno plasmide è fondamentale per la generazione di successo di entrambi i mutanti marcati e non marcati. Figura 1 è riportato un esempio di plasmide A e B utilizzato per generare una delezione mutanti nei geni Synechocystis cpcC1 e cpcC2 13. In ogni caso le 5 &#39;e 3&#39; regioni fiancheggianti sono circa 900-1.000 bp. regioni fiancheggianti ridotti possono essere utilizzati anche se la più piccola che abbiamo trialed successo è ...

L'introduzione di molteplici alterazioni genomiche nei cianobatteri è uno strumento essenziale nello sviluppo di ceppi per scopi industriali e di ricerca di base. Descriviamo un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica modello Synechocystis sp. PCC6803 e mutanti marcati in Synechococcus sp. PCC7002.

Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica Synechocystis PCC6803 e mutanti marcati nella specie Synechococcus PCC7002. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica cianobatterica. Come ad esempio come introdurre alterazioni cromosomiche in un ceppo.Mediante l'inserimento di un gene di resistenza agli antibiotici, seguito da una successiva rimozione di questa cassetta, utilizzando un marcatore selezionabile negativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ceppi possono essere manipolati geneticamente ripetutamente. Consentendo di introdurre in una varietà il numero di alternanze desiderato.Dopo aver preparato i terreni, i ceppi cianobatterici e i plasmidi, secondo il protocollo di testo. Impostare una nuova coltura inoculando un anello pieno di cellule cianobatteriche, in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura alla luce a 30 gradi Celsius per due o tre giorni, fino a un OD7500, pari a 0,2-0,6.Dopo l'incubazione, centrifugare da uno a due millilitri di coltura a 2.300 g per cinque minuti. Quindi, dopo aver scartato il surna

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Fonte: Weber, N., et al., Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Questo video descrive una procedura per eseguire la trasformazione naturale in cianobatteri filamentosi utilizzando il DNA plasmidico per ottenere un'espressione stabile di GFP e resistenza agli antibiotici attraverso la ricombinazione omologa.

Trasformazione naturale ed espressione della GFP nel cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Generazione di mutanti marcati e privi di marcatori in specie cianobatteriche modello. J. Vis. Exp. (2016)Il video mostra un metodo per generare mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri. Il protocollo inizia con la coltura dei cianobatteri, seguita dalle fasi di centrifugazione e lavaggio che preservano i pili superficiali. Viene quindi introdotto un plasmide che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici affiancato da sequenze omologhe. Durante...

Generazione di mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri tramite ricombinazione omologa

I mutanti letali sensibili alla temperatura (ts) sono strumenti preziosi per identificare e analizzare le funzioni essenziali. Qui descriviamo i metodi per generare e classificare i mutanti letali ts ad alto rendimento.

High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in<em&gt; Reinhardtii Chlamydomonas</em

Presentiamo qui i ricercatori per avviare phenotyping per il genere di batteri Streptomycesfarmacologicamente importante protocolli per il debuttante.

Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Questo protocollo utilizza promotori-reporter fluorescenti, microscopia a cellule vive e estrazione di inclusione individuale in un approccio genetico diretto in avanti per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo della Chlamydia trachomatis.

Approccio genetico in avanti a cellule vive per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo nella chlamydia trachomatis

Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso che è stato isolato dalle piscine rocciose marine. Questo articolo descrive l'isolamento dei filamenti da fonti naturali, l'estrazione del DNA, il sequenziamento del genoma, la trasformazione naturale, l'espressione di sfGFP, la crioconservazione e i metodi di motilità.

Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna

Questo protocollo fornisce una linea guida completa per l'impostazione e il monitoraggio quantitativo delle co-colture, compresi i cianobatteri fotoautotrofi secernenti zucchero e i lieviti eterotrofi.

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

Utilizzando la stimolazione elettrica ad alta frequenza, il sequestro-simile può essere indotta...

Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila</em

Scopri come generare mutanti marcato e markerless in cianobatteri Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002. Questo metodo consente manipolazioni genetiche ripetute per la ricerca biotecnologica.

Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

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