Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica Synechocystis PCC6803 e mutanti marcati nella specie Synechococcus PCC7002. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica cianobatterica. Come ad esempio come introdurre alterazioni cromosomiche in un ceppo.

Mediante l'inserimento di un gene di resistenza agli antibiotici, seguito da una successiva rimozione di questa cassetta, utilizzando un marcatore selezionabile negativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ceppi possono essere manipolati geneticamente ripetutamente. Consentendo di introdurre in una varietà il numero di alternanze desiderato.

Dopo aver preparato i terreni, i ceppi cianobatterici e i plasmidi, secondo il protocollo di testo. Impostare una nuova coltura inoculando un anello pieno di cellule cianobatteriche, in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura alla luce a 30 gradi Celsius per due o tre giorni, fino a un OD7500, pari a 0,2-0,6.

Dopo l'incubazione, centrifugare da uno a due millilitri di coltura a 2.300 g per cinque minuti. Quindi, dopo aver scartato il surnatante, utilizzare il terreno BG11 per lavare i pellet una volta, pipettando delicatamente per risospendere le cellule. Poiché il vortice può comportare la perdita di pili, che sono essenziali per l'assorbimento del DNA.

Dopo aver pellettato nuovamente le celle e rimosso il surnatante, aggiungere il terreno BG11 fino a un volume finale di 100 microlitri e trasferire le cellule in un tubo inferiore rotondo da 14 millilitri. Quindi, aggiungere 1 microgrammo di plasmide A precedentemente preparato alle cellule. E picchiettare delicatamente per mescolare.

Quindi adagiare le provette orizzontalmente nell'incubatrice a 30 gradi Celsius e incubare per quattro-sei ore. Dopo l'incubazione, distribuire aliquote della miscela di DNA plasmidico per colture cellulari su piastre di agar BG11 senza antibiotici. E incubare a 30 gradi Celsius.

Circa 24 ore dopo, preparare una soluzione di agar allo 0,6%, in acqua contenente kanamicina. E lasciarlo raffreddare a 42 gradi Celsius. Quindi aggiungere da 2,5 a tre millilitri ai bordi delle piastre di coltura e inclinare la piastra, in modo che la soluzione formi uno strato di agar superiore uniforme sulla superficie.

Incubare le piastre per circa sette giorni affinché le colonie siano visibili. Quindi dividere una nuova piastra di agar BG11 più kanamicina in sei settori. E usa uno stuzzicadenti smussato per striare le singole colonie.

Per eseguire la PCR, per confermare il knockout marcato, trasferire una piccola quantità di cellule in una provetta contenente 50 microlitri di acqua e circa 20 perle di vetro da 425 a 600 micrometri. Agitare le cellule e le perle a circa 2.000 giri/min per cinque minuti, prima di centrifugare a 15.700 g per cinque minuti. Quindi utilizzare cinque microlitri di surnatante per preparare reazioni PCR da 50 microlitri con preliminari di tack DNA.

Per convalidare i mutanti, dopo aver progettato i primer secondo il protocollo di testo, il prodotto amplificato utilizzando il seguente programma e includere un controllo wild-type. Attraverso gelelektroforeses, verificare il genotipo dei trasformanti knockout. Mostra una banda di circa quattro coppie di kilobasi e manca la banda wild-type.

Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. Se è ancora presente una banda wild-type, striare nuovamente il ceppo sulla piastra fresca e ripetere la PCR. Ripetere il processo di convalida fino a quando il mutante non è segregato e non si osserva alcuna banda wild-type nella reazione PCR.

Per una varietà che mostra un marcato profilo mutante, rimasticare su una piastra nuova per utilizzarla per generare un knockout non marcato. Per generare mutanti di Synechocystis non marcati, impostare una nuova coltura del knockout marcato inoculando l'ansa piena di cellule in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura per due o tre giorni fino a e OD750, pari a 0,2 a 0,6.

Centrifugare 10 millilitri di coltura a 2.300 g per cinque minuti e scartare il surnatante. Quindi usa BG11 medium per lavare delicatamente le cellule. Dopo aver aggiunto BG11 a un volume finale di 200 microlitri e aver trasferito le cellule in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri, aggiungere 1 microgrammo di DNA plasmidico B alle cellule e picchiettare delicatamente per mescolare.

Quindi adagiare le provette orizzontalmente nell'incubatrice e incubare per quattro-sei ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,8 millilitri di terreno BG11 e incubare i campioni per un totale di quattro giorni con agitazione. Questo è un tempo sufficiente per consentire la ricombinazione nelle copie cromosomiche multiple.

Piastra 50, 10 e 1 microlitro di aliquote della coltura trasformata su BG11 più piastre di agar saccarosio al 5% e incuba per circa sette giorni per generare singole colonie. Successivamente, usando uno stuzzicadenti smussato, schiudi da 30 a 50 singole colonie su piastre BG11 più kanamicina. Quindi applicare il patch su BG11 più il 5% di saccarosio.

Le colonie che crescono su BG11 più saccarosio, ma non su piastre con kanamicina, sono potenziali knockout non marcati. È probabile che le colonie che crescono su entrambe le piastre siano resistenti al saccarosio a causa di una mutazione nel gene sacB. Seguendo il metodo PCR, dimostrato in precedenza in questo video, verificare i knockout non marcati, che produrranno una banda di gel corrispondente alla dimensione del tipo selvatico meno la regione eliminata.

Se il ceppo mostra un profilo mutante non marcato, allora rimasticalo con agar BG11 fresco senza antibiotici. Per conservare i ceppi a lungo termine, allestire una nuova coltura del ceppo inoculando un anello pieno di cellule in 30-50 millilitri di terreno BG11. Coltiva la coltura per tre o quattro giorni fino a un OD750 pari a 0,4 a 0,7.

Dopo aver utilizzato BG11 per lavare le celle una volta, risospendere il pellet in circa due millilitri di BG11. Aggiungere 0,8 millilitri di cellule concentrate in una provetta. Quindi aggiungere 0,2 millilitri di glicerolo sterilizzato con filtro all'80%.

In un'altra provetta, aggiungere 0,93 millilitri di cellule concentrate e 0,07 millilitri di DMSO. Conservare entrambe le provette a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per ravvivare i ceppi, rimuovere il tubo e utilizzare uno stuzzicadenti smussato per raschiare alcune cellule su una piastra di agar senza antibiotici.

Quindi utilizzare un anello sterile per striare normalmente. Questa figura mostra esempi di plasmidi A e B utilizzati per generare mutanti di delezione. In ogni caso, le cinque regioni prime e tre prime planking sono approssimativamente 900 a 1.000 coppie di basi.

Il plasmide B può anche contenere una cassetta genica tra le regioni fiancheggianti di circa una coppia di kilobasi prime e tre prime. O una versione modificata della sequenza genica nativa. Dopo la trasformazione con il plasmide A, diverse centinaia di colonie appariranno su una piastra dopo sette-10 giorni.

Se i geni non sono essenziali e i mutanti dimostrano una crescita, simile al ceppo wild-type, allora tutti i cromosomi dovrebbero contenere una copia npt1/sacB inserita in sequenza, come determinato tramite PCR. Se i geni non sono essenziali e i mutanti crescono lentamente, sono necessari diversi cicli di ri-streaking con concentrazioni crescenti di kanamicina per ottenere un mutante marcato segregato. Se dopo la ri-streaking, non si ottiene un mutante marcato, il gene è probabilmente essenziale per la sopravvivenza.

La maggior parte delle singole colonie, ottenute dalla trasformazione con il plasmide B, saranno sensibili alla kanamicina e resistenti al saccarosio. Come dimostrato qui, l'amplificazione PCR della regione bersaglio in queste colonie, mostra che quasi il 100% del profilo mutante non marcato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in ore per un periodo di sei settimane se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di utilizzare la tecnica sterile. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la misurazione della produzione di ossigeno o la spettrometria di massa gascromatografica per rispondere a ulteriori domande, come la misurazione dei tassi fotosintetici o della produzione di metaboliti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica cianobatterica.

Esplorare i processi biochimici e fisiologici chiave in questo phylum e i ceppi di sviluppo per scopi industriali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare knockout non marcati nelle specie di Synechococcus PCC6803.