Un approccio per migliorare l'allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di migliorare l'allineamento degli assoni e la mielinizzazione dei neuroni gangliari della radice dorsale utilizzando un sistema di coltura cellulare statico e pre-allungato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria del tessuto nervoso, come l'allineamento degli assoni e la crescita dello spessore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo metodo pre-allungato non solo migliora l'allineamento degli assoni, ma promuove anche la mielinizzazione.

Per iniziare questa procedura, versare la miscela di base e agente indurente in un piatto di coltura tissutale. Tenere la miscela di gel sotto vuoto per 20 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Quindi mettere la miscela di gel in forno a 60 gradi Celsius per l'indurimento notturno.

Dopo che la membrana PDMS si è indurita, trattare la superficie con plasma di ossigeno nel sistema di pulizia e incisione al plasma per tre minuti. Successivamente, tagliare un pezzo di membrana rettangolare dal piatto. Fissarlo su un telaio elastico con il lato trattato con l'ossigeno rivolto verso l'alto.

Quindi posizionare il telaio su un tavolino di allungamento e allungarlo uniformemente ruotando la manopola sul tavolino fino a raggiungere il 10% di allungamento nell'asse più lungo. Quindi, fissa l'allungamento stringendo le viti sul telaio. Successivamente, rimuovi il telaio dal palco.

Assicurarsi che la superficie della membrana sia asciutta e priva di polvere prima di posizionare una camera di silicone sulla membrana. Lasciare che il lato adesivo della camera si attacchi saldamente alla membrana. Quindi sterilizzare la superficie con UV per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere un millilitro di PLL alla superficie PDMS nella camera entro sei ore dal trattamento al plasma. Successivamente, incubarlo per due ore a 37 gradi Celsius prima di seminare i neuroni DRG per migliorare l'adesione cellulare. In questa fase, prepara il terreno di coltura standard per i neuroni DRG.

Prima dell'isolamento, sterilizzare in autoclave l'apparecchiatura di isolamento e filtrare i reagenti. Aggiungere cinque millilitri di tampone isolante in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra sul ghiaccio. Quindi preparare 10 millilitri di terreno di dissociazione aggiungendo un millilitro di collagenasi A a nove millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05%.

Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micrometri e metterla sul ghiaccio. Successivamente, sacrifica da 10 a 12 ratti SD di cinque o sette giorni e taglia via la pelle sovrastante il midollo spinale dalla parte posteriore di ciascuno. Rimuovere il tessuto in eccesso intorno alla colonna vertebrale.

Sotto una lente d'ingrandimento chirurgica, fai la prima incisione dal collo, quindi fai un taglio lungo la colonna vertebrale su entrambi i lati con le forbici. Staccare la colonna vertebrale dal corpo del cucciolo e rimuovere i muscoli in eccesso. Quindi taglia lungo l'asse lungo della colonna vertebrale e usa una pinzetta per aprire completamente la colonna vertebrale per estrarre il midollo spinale.

Quindi, rimuovi il ganglio dalla tasca ossea. Taglia le radici nervose e trasferisci i gangli nel tampone di isolamento ghiacciato. Raccogli circa 10-16 DRG da entrambi i lati.

Ripetere la procedura di dissezione per il resto dei cuccioli. A questo punto, trasferire i DRG con tampone di isolamento in una provetta sterile da 15 millilitri. Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo della provetta e rimuovere delicatamente il tampone di isolamento sulla parte superiore.

Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di dissociazione nel tubo. Incubare i tessuti sezionati nel mezzo di dissociazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora, agitando la provetta ogni 5-10 minuti. Dopo la dissociazione chimica, centrifugare i gangli a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura standard e agitarlo. Successivamente, centrifugare nuovamente le cellule dissociate. Quindi rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 12 millilitri di terreno di coltura standard e agitarlo.

Prima di seminare le cellule, rimuovere la soluzione PLL dalla camera. Sciacquare la superficie del PDMS con acqua sterile e asciugarla all'aria. Dopo aver risospeso le celle, lasciare riposare la sospensione per uno o due minuti per consentire ai detriti di depositarsi sul fondo del tubo.

Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di sospensione cellulare in ciascuna camera allungata e incubarla a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Per eliminare le cellule gliali in un giorno in vitro, aggiungere 10 microlitri o 15 microlitri della soluzione madre della miscela FDU-U a ciascun pozzetto. Dopo sette ore, sostituire questo terreno con un terreno di coltura standard fresco e posizionare il dispositivo di coltura pre-stirato in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2.

Durante il periodo di coltura cellulare, cambiare il terreno ogni due giorni sostituendo metà del terreno esaurito con un terreno fresco. In questa procedura, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule di Schwann e aggiungere cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% nel pallone. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% per due o tre minuti.

Controllare le cellule al microscopio ottico utilizzando un obiettivo 10X per vedere se si sollevano dal pallone. Quindi aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura alle cellule nel pallone e mescolare. Successivamente, aggiungere la sospensione cellulare a una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 20 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in sette millilitri di terreno di coltura DRG standard. Successivamente, trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri. Mescolarlo con 10 microlitri di blu di Tripano e poi contare il numero di cellule con un emocitometro utilizzando un obiettivo 10X.

Aggiungere il terreno di crescita DRG per diluire la sospensione cellulare a 5.000 cellule per millilitro. Quindi, rimuovere 0,5 millilitri di terreno dalla coltura DRG nella camera allungata e aggiungere 0,5 millilitri di sospensione cellulare di Schwann alla coltura DRG. Coltivare le cellule per una settimana a 37 gradi Celsius al 5% di CO2.

Cambiare il terreno ogni due giorni sostituendo metà del terreno esaurito con un terreno di coltura standard fresco. Dopo la coltura sulle superfici tese e non tese per due settimane, le cellule di Schwann purificate sono state aggiunte alla camera e coltivate per un'altra settimana. Qui è mostrata la colorazione della tubulina beta-III per gli assoni sulla superficie allungata.

E questa è la sovrapposizione di tubulina beta-III e colorazione P0 sulla superficie allungata, suggerendo che le cellule di Schwann sono attaccate e probabilmente mielinizziano gli assoni. Questa immagine mostra la colorazione della tubulina beta-III per gli assoni sulla superficie non tesa. E la sovrapposizione di tubulina beta-III e colorazione P0 sulla superficie non tesa suggerisce che le cellule di Schwann non sono attaccate agli assoni.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere la membrana PDMS piana e di spessore omogeneo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire atomizzatori come i microcanali pre-stirati per rispondere a ulteriori domande come la lente degli assoni e la migrazione delle cellule di Schwann.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare il ruolo dell'anisotropia di superficie sulla rigenerazione nervosa nel midollo spinale e nel nervo sciatico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'allineamento e la mielinizzazione degli assoni utilizzando un dispositivo pre-allungato.