Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare le interazioni proteiche dell'RNA da estratti cellulari utilizzando un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica. Ciò si ottiene preparando prima un estratto proteico da cellule o tessuti in una fase separata, una sonda di RNA radiomarcata specifica per gene viene sintetizzata e purificata. L'estratto proteico viene quindi miscelato con la sonda di RNA marcata per consentire la formazione di specifici complessi proteici di RNA.

Infine, il prodotto di reazione viene caricato su un gel di poliacrilammide non denaturante e analizzato mediante elettroforesi, la sonda di RNA libera viene separata dai complessi proteici dell'RNA in virtù della sua più rapida mobilità. Il test di spostamento della mobilità elettroforetica è ampiamente utilizzato per analizzare le interazioni tra le proteine dell'RNA. Abbiamo potuto analizzare il legame delle proteine regolatrici del ferro, IRP uno e IRP due al loro elemento RNA bersaglio.

Ma il metodo può essere applicato anche per lo studio di altre proteine leganti l'RNA, dimostrando che questa procedura sarà eseguita dal Dr.Kain, ricercatore associato filippino nel mio laboratorio, e dalla Dr.Nicole Wilkinson, una borsista post-dottorato per far aderire le cellule coltivate in piatti. Lavare le celle due volte con PBS ghiacciato, quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato e raccogliere le cellule con un raschietto di plastica. Trasferire la sospensione a cellule libere in una provetta da centrifuga fresca da 1,5 millilitri.

Posizionare la provetta in una microcentrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius. Centrifugare a bassa velocità per cinque minuti e aspirare il surnante. Le celle appariranno come una pallina bianca sul fondo del tubo.

Per ogni 10 milioni di cellule raccolte, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi citoplasmatica ghiacciato. Allentare il pellet cellulare pipettandolo più volte su e giù, quindi incubare la sospensione su ghiaccio per 20 minuti. Questo solubilizzerà la membrana cellulare e rilascerà tutto il contenuto citosolico nel tampone.

Per isolare la frazione citosolica solubilizzata, far girare la provetta alla massima velocità per 10 minuti in una centrifuga a quattro gradi Celsius, trasferire la stecca chiarificata in una nuova provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio e gettare il pellet. Successivamente, determinare la concentrazione proteica totale dell'estratto citoplasmatico risultante utilizzando il saggio di Bradford. Aliquotare l'estratto citoplasmatico risultante in provette più piccole e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'uso per produrre estratti citoplasmatici da tessuti freschi.

Inizia il processo di raccolta adagiando l'animale soppresso su un tappetino pulito su una tavola da dissezione. Apri l'addome con le forbici. Rimuovere il fegato e la milza usando forbici e pinze.

Sciacquare ogni fazzoletto in circa 50 millilitri di PBS ghiacciato per prevenire la degradazione dei tessuti. Tagliare immediatamente i fazzoletti in piccoli pezzi di circa uno o due millimetri cubi con un bisturi senza indugio. Metti i fazzoletti in una provetta criogenica fresca e fai scattare a scatto.

Congelare un campione in azoto liquido. Conserva i fazzoletti congelati a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari. Iniziare a produrre l'estratto citoplasmatico trasferendo il campione di tessuto precedentemente congelato in una provetta da due millilitri con fondo piatto contenente da 250 a 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciata.

Posizionare la punta di un omogeneizzatore di tessuti nella provetta e accendere l'apparecchio a media potenza. Dopo 10 secondi di omogeneizzazione, posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio per 20 minuti per evitare la denaturazione delle proteine. Per isolare la frazione citosolica, far girare la provetta alla massima velocità per 10 minuti in una centrifuga a quattro gradi Celsius, trasferire il surnatante chiarificato in una nuova provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio e scartare il pellet.

Determinare la concentrazione proteica totale dell'estratto citoplasmatico risultante utilizzando il saggio di Bradford. Immergere l'estratto citoplasmatico risultante in provette più piccole e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Prima di proseguire con il protocollo, allestisci un banco da lavoro a prova di radiazioni completo di contatore Geiger con schermo in plexiglass.

Eseguire etichette per monitor citometrici su camici da laboratorio e contenitori di rifiuti specifici per radiazioni e non sharpp. A partire da un plasmide di DNA delinearizzato contenente un elemento di risposta al ferro clonato. Come modello, impostare una reazione di trascrizione dell'RNA in vitro da 20 microlitri mescolando il tampone di reazione modello, i nucleotidi parzialmente radioattivi e l'RNA polimerasi con una pipetta a temperatura ambiente.

Per avviare la sintesi dell'RNA, incubare il campione a 40 gradi Celsius per un'ora. Terminare la reazione di trascrizione in vitro aggiungendo un microlitro di EDTA 0,5 molare pH 8,0. Miscelare l'EDTA pipettando su e giù.

Ora usa un protocollo standard di precipitazione dell'alcol per purificare il prodotto a base di RNA. Per iniziare, aggiungere 10 microlitri di TRNA e 82,5 microlitri di acetato di sodio a tre molari a pH 5,2 alla miscela e al vortice post-sintesi. Per mescolare, il TRNA fungerà da vettore di precipitazione e aumenterà la resa finale dell'RNA per precipitare l'RNA.

Aggiungere 273 microlitri di etanolo dal 95 al 100% e mescolare a vortice. Lasciare procedere la reazione di precipitazione lasciando la provetta sul banco per 10 minuti a temperatura ambiente per isolare l'RNA, far girare la provetta in una centrifuga a temperatura ambiente alla massima velocità per 10 minuti. Con una pipetta, scartare con cura il surnatante e non disturbare il pellet.

L'RNA precipitato può esistere come una piccola pallina bianca vicino al fondo del tubo o può essere invisibile ad occhio nudo. Lavare il pellet aggiungendo da 100 a 500 microlitri di etanolo al 70%. Far girare il campione alla massima velocità per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi decantare il naceto con il coperchio.

Aprire e asciugare il pellet di RNA lasciando la provetta aperta sul banco per 10-15 minuti. Ricostituire l'RNA solido radiomarcato aggiungendo 100 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quantificare l'entità dell'incorporazione di nucleotidi radioattivi posizionando la soluzione di RNA in un contatore di sterilizzazione liquido Eloqua.

La sonda RNA marcata via radio viene convertita in tubi più piccoli e conservata a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è necessaria. Le aliquote congelate possono essere utilizzate per un massimo di tre settimane prima di iniziare il test di spostamento della mobilità elettroforetica, preparare un gel standard di acrilammide non denaturante al 6% di almeno 16 per 16 centimetri di dimensioni per facilitare volumi di campione maggiori per corsia. E per migliorare la stabilità meccanica di un gel di queste dimensioni.

Utilizzare distanziatori e pettini in vetro di almeno un millimetro di spessore. Per iniziare il test di spostamento della mobilità elettroforetica, scongelare il lisato citoplasmatico precedentemente congelato e le sonde di RNA radiomarcate sugli occhi per la componente proteica dell'esperimento. Diluire 25 microgrammi di estratto citoplasmatico con il tampone di lisi citoplasmatica fino a un volume totale finale di 10 microlitri.

Quando necessario, aggiungere un microlitro di due soluzioni stock alla miscela e conservare il campione proteico in ghiaccio. Per il componente RNA, diluire la sonda di RNA radiomarcata in acqua priva di nucleasi fino a 200.000 conteggi al minuto per microlitro di calore per naturalizzare l'RNA a 95 gradi Celsius per un minuto e raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per almeno cinque minuti. Per avviare la reazione di legame dell'RNA proteico, aggiungere un microlitro di sonda di RNA radiomarcata all'estratto proteico e lasciare che il legame avvenga per 20 minuti a temperatura ambiente.

Per aumentare la specificità del test di spostamento della mobilità elettroforetica, aggiungere un microlitro di stock di eparina alla reazione. Se le sonde di RNA radiomarcate sono più lunghe di 60 nucleotidi, aggiungere un ulteriore microlitro di RNA T uno. Lasciare che la reazione di legame continui per altri 10 minuti a temperatura ambiente per migliorare ulteriormente la specificità e consentire una migliore separazione del complesso proteico dell'RNA.

Aggiungere tre microlitri di tampone di caricamento e pipettare su e giù per mescolare. Quindi caricare l'intera reazione sul gel di acrilammide al 6% e far funzionare il gel a cinque volt per centimetro per 60 minuti. Assicurarsi di coprire l'apparecchio con un'adeguata schermatura dalle radiazioni.

Smontare l'apparecchio in gel e trasferire il gel su una carta da filtro grande. Asciugare il gel utilizzando un apparecchio sottovuoto per l'essiccazione del gel in una stanza buia. Posiziona la combinazione di gel e carta da filtro sopra un pezzo.

Pellicola dopo l'esposizione, sviluppare e asciugare la pellicola all'aria. Il tempo di esposizione ottimale può variare da un'ora a una notte. Si può valutare la capacità di legame ferro-dipendente di I RRP 1 e I RRP 2 alle sonde IRE radioattive in cellule di coltura tissutale con contenuto di ferro variabile.

Pertanto, l'attività di legame di IRE è indotta in cellule deplete di ferro precedentemente trattate con la deferoxammina K successiva. Al contrario, l'attività di legame di IRE è soppressa in cellule caricate con ferro precedentemente trattate con emano in celle caricate con ferro. L'attività di legame IRE di I RRP 1 viene persa in seguito all'assemblaggio di un cluster di ferro zolfo mentre I RRP 2 subisce degradazione ferro-dipendente.

Il cluster di cellule di ferro di IRP uno può essere distrutto mediante trattamento di estratti cellulari con il 2% di due me, che consente di monitorare la sua attività di legame IRE dormiente. L'attività di I RRP due non viene recuperata da due me. In questo prossimo esperimento, le attività di legame IRE di I RRP uno e IRP due in funzione della concentrazione cellulare di ferro sono valutate nel contesto di tessuti epatici freschi di topi selvatici di tipo I RRP uno knockout e I RRP due knockout.

Qui i dati mostrano che l'alimentazione di topi con una dieta ricca di ferro nota per aumentare il carico di ferro epatico promuove una riduzione delle attività di legame IRE di I RRP uno e IRP due negli estratti di fegato di topi wild type. I rrp due complessi IRE sono distorti dalla presenza di I RRP uno. Sono facilmente visualizzabili negli estratti di fegato di topi knockout I RRP one.

Qui la dieta ricca di ferro porta alla completa inattivazione dell'IRP due. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare le interazioni delle proteine dell'RNA mediante il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica. Ricorda che la qualità della sonda a RNA è fondamentale per il successo.