Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

L'obiettivo generale di questo saggio è rilevare le interazioni proteina-DNA utilizzando sonde non radioattive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia molecolare e della biochimica, come ad esempio la determinazione della sequenza di DNA bersaglio delle proteine. Il principale vantaggio di questa tecnica è che rappresenta un'alternativa semplice, sicura e risparmiatrice di tempo rispetto all'uso di sonde radioattive.

Per iniziare questa procedura, preparare un gel nativo di poliacrilamide al cinque percento contenente TBE (tris borato EDTA) 0,5x e il 2,5% di glicerolo, utilizzando un sistema per gel proteici mini. Per preparare 30 millilitri di soluzione di gel per quattro gel, mescolare acqua distillata, TBE, persolfato di ammonio, TEMED, acrilamide bis e glicerolo. Versare immediatamente la soluzione del gel.

Dopo la polimerizzazione, avvolgere i gel in pellicola trasparente precedentemente inumidita con TBE 0,5x e conservarli a quattro gradi Celsius. Successivamente, progettare un oligonucleotide lungo di circa 51 mer. Progettare oligonucleotidi corti complementari di circa 14 mer con modifica mediante colorante fluorescente a infrarossi al termine cinque prime.

Una volta preparati gli oligonucleotidi, risospendeteli in tampone Tris-EDTA 1x fino a una concentrazione finale di 100 micromolare. Per l'appaiamento, mescolate 0,6 microlitri di oligonucleotide corto marcatore al capo cinque prime, 1,2 microlitri di oligonucleotide lungo e 28,2 microlitri di tampone Tris-EDTA cloruro di sodio in un tubo da 1,5 millilitro. Collocate il tubo in acqua bollente per cinque minuti, quindi spegnete la sorgente di calore e lasciate raffreddare l'acqua con gli oligonucleotidi appaiati durante la notte al buio.

Per ottenere sonde di DNA a doppio filamento, mescolare 30 microlitri di oligonucleotidi ricongiunti con DNTP, buffer Klenow, marcatore colorimetrico Klenow a estremità cinque prime e acqua bidistillata in un tubo PCR da 0,2 millilitri. Incubare la miscela per 60 minuti a 37 gradi Celsius in un termociclatore. Successivamente, aggiungere 3,4 microlitri di EDTA 0,5 molar per arrestare la reazione e inattivare termicamente a 75 gradi Celsius per 20 minuti nel termociclatore.

In seguito, diluire le sonde marcate con tampone Tris-EDTA cloruro di sodio fino a una concentrazione finale di 0,1 micromolare. Conservare gli oligonucleotidi a meno 20 gradi Celsius al buio fino al momento dell'uso. Per preparare sonde non marcate, mescolare 20 microlitri di oligonucleotide lungo, 20 microlitri di oligonucleotide Long R e 60 microlitri di tampone Tris-EDTA cloruro di sodio in un tubo da 1,5 millilitri.

Posizionare il tubo in acqua bollente per cinque minuti, quindi spegnere la sorgente di calore e lasciare raffreddare l'acqua con gli oligonucleotidi ricottati durante la notte. Preparare un millilitro di tampone di legame 5x mescolando Tris HCl, cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di magnesio, EDTA, DTT, BSA e acqua bidistillata. Prima di impostare le reazioni di legame, eseguire una pre-correzione del gel di poliacrilamide nativo al 5% in TBE 0,5x e glicerolo al 2,5% per rimuovere ogni traccia di persolfato di ammonio a 80 volt per 30 minuti fino a un'ora, oppure fino a quando la corrente non varia più nel tempo.

Successivamente, mescolare quattro microlitri di tampone di legame 5x, da 80 a 200 nanogrammi di proteina A purificata, un microlitro di sonda coniugata con colorante 0,1 micromolare e acqua bidistillata. Incubare la miscela a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, caricare tutta la reazione di legame su un gel ed eseguire l'elettroforesi a 10 volt per centimetro fino alla distanza desiderata.

Coprire l'apparato elettroforetico con alluminio per mantenere il gel al buio il più possibile. Pulire il piano dello scanner di un sistema di imaging a infrarossi con acqua distillata. Asciugare e posizionare le lastre di vetro contenenti il gel sul piano dello scanner.

Aprire il software di imaging a infrarossi e fare clic sulla scheda Acquisisci. Per piastre più spesse, utilizzare le impostazioni di 700 per il canale, auto per l'intensità, 84 micrometri per la risoluzione, media per la qualità e 3,5 millimetri per l'offset del fuoco. Selezionare l'area occupata dal gel sullo scanner.

Infine, fare clic su Avvia per iniziare la scansione. Il progresso dell'elettroforesi può essere visualizzato con il colorante di carico Orange G, mentre il blu di bromofenolo viene rilevato durante la scansione e pertanto interferisce con l'analisi dell'immagine. L'aggiunta di dI-dC alla reazione di legame ha abolito il legame tra la proteina purificata 6xHis-SOX-2 e le sonde di DNA marcate con il colorante al quinto primo estremo.

Il sonda fredda mutante per LIM-4 e SOX-2, con mutazione nel sito di legame di LIM-4, è efficiente quanto la sonda fredda di tipo selvaggio nel competere con la sonda marcata con colorante fluorescente infrarosso per il legame con 6xHis-SOX-2. Tuttavia, l'efficienza di competizione della sonda fredda doppia mutante per LIM-4 e SOX-2, con mutazione nel sito di legame di SOX-2, è molto inferiore rispetto alla sonda fredda di tipo selvaggio nel legame con 6xHis-SOX-2. Saggi di supershift del complesso DNA-SOX-2 mediante epitopi 6xHis e flag hanno prodotto una banda DNA-SOX-2 supershiftata.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore se viene effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le sonde a infrarossi al buio. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la modifica del genoma con CRISPR cas9 possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come l'importanza di una particolare sequenza di legame al DNA.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biochimica per esplorare le interazioni proteina-DNA in vari organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare le interazioni proteina-DNA utilizzando etichette del DNA non radioattive. Non dimenticare che lavorare con acrilamide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.