Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

L'obiettivo generale di questo test è quello di rilevare le interazioni proteina-DNA utilizzando sonde non radioattive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia molecolare e della biochimica, come la determinazione della sequenza bersaglio del DNA delle proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un'alternativa facile, sicura e che fa risparmiare tempo all'uso di sonde radioattive.

Per iniziare questa procedura, preparare un gel di poliacrilammide nativo al cinque percento contenente 0,5 volte tris borato EDTA o TBE e glicerolo al 2,5% utilizzando un sistema di mini gel proteico. Per preparare 30 millilitri di soluzione gel per quattro gel, mescolare acqua distillata, TBE, persolfato di ammonio, TEMED, acrilammide bis e glicerolo. Passare immediatamente la soluzione in gel.

Dopo la polimerizzazione, avvolgere i gel in un involucro di plastica trasparente pre-bagnato con 0,5x TBE e conservarli a quattro gradi Celsius. Successivamente, progettare un oligonucleotide lungo per circa 51 mer. Progettare oligonucleotidi corti complementari per circa 14 mers con modifica del colorante fluorescente a infrarossi ai cinque terminali principali.

Una volta preparati gli oligonucleotidi, risospenderli in 1x tampone Tris-EDTA fino a una concentrazione finale di 100 micromolari. Per la ricottura, mescolare 0,6 microlitri di oligonucleotide corto con colorante di prima qualità, 1,2 microlitri di oligonucleotide lungo e 28,2 microlitri di tampone Tris-EDTA di cloruro di sodio in una provetta da 1,5 millilitri. Metti la provetta in acqua bollente per cinque minuti, quindi spegni la fonte di calore e lascia raffreddare l'acqua con gli oligonucleotidi ricotti per una notte al buio.

Per realizzare sonde di DNA a doppio filamento, mescolare 30 microlitri di oligonucleotidi ricotti con DNTP, tampone Klenow, tag colorante Klenow five prime e acqua distillata doppia in una provetta PCR da 0,2 millilitri. Incubare la miscela per 60 minuti a 37 gradi Celsius in una macchina per PCR. Quindi, aggiungere 3,4 microlitri di EDTA 0,5 molari per fermare la reazione e inattivare il calore a 75 gradi Celsius per 20 minuti nella macchina PCR.

Successivamente, diluire le sonde riempite con tampone Tris-EDTA di cloruro di sodio a una concentrazione finale di 0,1 micromolare. Conservare gli oligonucleotidi a meno 20 gradi Celsius al buio fino al momento dell'uso. Per preparare le sonde non marcate, mescolare 20 microlitri di oligonucleotide lungo, 20 microlitri di oligonucleotide Long R e 60 microlitri di tampone Tris-EDTA di cloruro di sodio in una provetta da 1,5 millilitri.

Mettere il tubo in acqua bollente per cinque minuti, quindi spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare l'acqua con gli oligo ricotti per una notte. Preparare un millilitro di tampone legante 5x mescolando Tris HCl, cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di magnesio, EDTA, DTT, BSA e acqua distillata doppia. Prima di impostare le reazioni di legame, eseguire preventivamente il gel di poliacrilammide nativo al 5% in TBE 0,5x e glicerolo al 2,5% per rimuovere tutte le tracce di persolfato di ammonio a 80 volt per 30 minuti a un'ora, o fino a quando la corrente non varia più nel tempo.

Successivamente, mescola quattro microlitri di tampone legante 5x, da 80 a 200 nanogrammi di proteina A purificata, un microlitro di sonda coniugata con colorante micromolare da 0,1 e acqua a doppia distillazione. Incubare la miscela a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, caricare tutta la reazione di legame sul gel e far scorrere il gel a 10 volt per centimetro alla distanza desiderata.

Coprire l'apparato del gel con alluminio per mantenere il gel al buio il più possibile. Pulire il piano dello scanner di un sistema di imaging a infrarossi con acqua distillata. Asciugare le lastre di vetro contenenti il gel e posizionarle sul piano dello scanner.

Aprire il software di imaging a infrarossi e fare clic sulla scheda Acquisisci. Per le lastre più spesse, utilizzare le impostazioni di 700 per il canale, auto per l'intensità, 84 micrometri per la risoluzione, medio per la qualità e 3,5 millimetri per l'offset della messa a fuoco. Selezionare l'area occupata dal gel sullo scanner.

Infine, fai clic su Avvia per iniziare la scansione. L'andamento dell'elettroforesi può essere visualizzato con il colorante di caricamento Orange G, mentre il blu di bromofenolo viene rilevato durante la scansione e quindi interferisce con l'analisi delle immagini. L'aggiunta di dI-dC alla reazione di legame ha abolito il legame del 6xHis-SOX-2 purificato con le cinque sonde di DNA a colorante primario.

Il mutante LIM-4 e la sonda fredda SOX-2 mutata nel sito di legame LIM-4 sono efficienti quanto la sonda fredda di tipo selvaggio in competizione con la sonda marcata con colorante fluorescente a infrarossi per il legame a 6xHis-SOX-2. Tuttavia, l'efficienza di competizione della sonda fredda mutante LIM-4 e SOX-2 mutata nel sito di legame SOX-2 è molto inferiore rispetto alla sonda fredda wild type per il legame a 6xHis-SOX-2. I saggi supershift del complesso di DNA SOX-2 utilizzando epitopi 6xHis e flag hanno portato a una banda di DNA SOX-2 supershiftata.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di tenere le sonde a infrarossi al buio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'editing del genoma CRISPR cas9 per rispondere a ulteriori domande come l'importanza di una particolare sequenza di legame del DNA.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biochimica per esplorare le interazioni proteina-DNA in vari organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare le interazioni proteina-DNA utilizzando etichette di DNA non radioattivo. Non dimenticare che lavorare con l'acrilammide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i dispositivi di protezione individuale.