JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Prelevare una piastra a più pozzetti contenente batteri patogeni geneticamente modificati cresciuti con diversi composti di prova, insieme a controlli negativi.
I batteri trasportano un plasmide con un gene che codifica per la proteina fluorescente verde o GFP.
Il promotore del gene è attivato da una proteina che risponde alle concentrazioni intracellulari cicliche di-GMP o c-di-GMP.
Posizionare la piastra in un lettore di piastre.
Utilizzare il controllo negativo, che emette la massima fluorescenza a causa dell'assenza di un inibitore c-di-GMP, per regolare le impostazioni per una misurazione ottimale del segnale di fluorescenza.
Se un composto in esame inibisce la formazione di c-di-GMP, il livello intracellulare di c-di-GMP diminuisce.
Livelli ridotti di c-di-GMP innescano un cambiamento conformazionale nella proteina, portando alla repressione del promotore e a una bassa espressione di GFP, che si traduce in una diminuzione della fluorescenza.
Misurare la fluorescenza e analizzare i dati per identificare i composti in esame che modulano i livelli intracellulari di c-di-GMP nei batteri patogeni.
Circa 30 minuti prima della misurazione spettrofotometrica, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius per evitare la formazione di condensa. Rimuovere delicatamente la guarnizione del coperchio permeabile all'aria dalla piastra prima della lettura.
Quindi, misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri con un'impostazione di 10 flash per pozzetto e un tempo di assestamento di 0,2 secondi. Prima di misurare la fluorescenza, effettuare una regolazione automatica del guadagno e della focale in base al pozzetto di controllo negativo A24 e impostare il valore target del guadagno al 75%.
Seleziona la regolazione della messa a fuoco e un canale A sulla destra della finestra. Misurare la fluorescenza dal reporter GFP a un'eccitazione massima di 485 nanometri e un'emissione massima di 520 nanometri, con un'impostazione di 10 flash per pozzetto e un tempo di assestamento di 0,2 secondi.
Raccogli i dati da tutte le lastre esaminate. Le letture dei dati vengono salvate automaticamente come standard dal software di controllo del lettore di piastre.
Per analizzare i dati, visualizzare le letture facendo clic sull'icona Mars all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica. Recupera i dati facendo doppio clic sul numero di targa di interesse per accedere ai dati per l'analisi.
Valutare l'uniformità e la riproducibilità del test utilizzando una robusta analisi Z prime.
Quindi, calcolare la percentuale di inibizione della crescita e valutare la percentuale di inibizione del livello intracellulare di c-di-GMP come dettagliato nel protocollo di testo.