كيفية دراسة بدروم غشاء تصلب بمثابة الزناد البيوفيزيائية في سرطان البروستاتا وعلوم الأمراض الأخرى ذات الصلة العمر أو الأمراض الاستقلابية

الهدف العام من هذا النموذج هو استقصاء كيف يمكن لصلابة وسماكة الغشاء القاعدي، الناتجة عن التعرض لمنتجات الارتباط السكري المتقدم، أن تعدل سلوك الخلايا الغازية بما يتوافق مع المراحل المبكرة والمتقدمة من سرطان البروستاتا النقيلي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الأمراض المرتبطة بالعمر، مثل كيفية مساهمة زيادة صلابة وسماكة الغشاء القاعدي في تطور السرطان، وكذلك الاضطرابات الأيضية مثل مرض السكري.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر طريقة بسيطة لمحاكاة مستوى الصلابة المقاس في أورام البروستاتا البشرية في السياق السريري. وتمتد آثار هذه التقنية إلى علاج وتشخيص سرطان البروستاتا من خلال تحسين فهمنا لكيفية تعزيز صلابة الغشاء القاعدي للتغيرات الجزيئية والخلوية. وقد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، نظراً لأن النموذج متعدد التخصصات.

يجمع هذا البحث بين تقنيات من مجالات الكيمياء والفيزياء والأحياء. وقد تبلورت الفكرة الأولية لهذه الطريقة عندما افترضنا أن صلابة الغشاء القاعدي في غدة البروستاتا يمكن أن تعزز السلوك الغازي المستحدث في الخلايا الظهارية المتحولة المعروفة. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، نظراً للحاجة إلى وصف الخطوات المتداخلة بين التخصصات المختلفة.

تتضمن العملية ربط الغشاء القاعدي تشابكيًا، يليه زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. ابدأ بتجهيز سطح مستوٍ من الثلج، واستخدمه لتبريد شريحة زجاجية ذات ثماني حجيرات حتى تصل درجة حرارتها إلى 4 °C. بعد ذلك، اقطع طرف رأس ماصة سعة 200 µL، وقم بتبريد الرأس أيضًا إلى 4 °C.

بعد التبريد، ضع الطرف على أداة ماصة ذات سعة 200 µL. واستخدمها لنقل 40 µL من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي المبرد بالثلج إلى كل بئر من آبار الشريحة الزجاجية المبردة ذات الثماني غرف. ثم ضع شريحة الغرف عند 37 °C لمدة 30 دقيقة لتحفيز بلمرة الغشاء القاعدي.

أغلق باب الحاضنة بعناية فائقة لتجنب زعزعة الغشاء القاعدي المعاد تكوينه والسائل. بعد مرور 30 دقيقة بالضبط، أضف 250 µL من محلول جليكول ألدهيد المُحضّر لتغطية الغشاء القاعدي المعاد تكوينه والمبلمر. بعد ذلك، قم بإعداد ضابط سلبي عن طريق إضافة 250 µL من PDS المعقم إلى هلام غشاء قاعدي طبيعي معاد تكوينه.

وقم أيضاً بتحضير مجموعتين ضابطتين إضافيتين عن طريق إضافة إما 50 millimolar من sodium cyanoborohydride، أو 250 millimolar من aminoguanidine إلى محلول glycolaldehyde قبل إضافته إلى هلام الغشاء القاعدي. ثم، يتم تحضين الهلام عند 37 °C لمدة ست ساعات لإنتاج هلام شبه صلب، أو لمدة 14 ساعة لإنتاج هلام صلب.

بعد انتهاء فترة الحضن، أزل المحاليل بعناية من الهلامات وأضف 250 µL من glycine ethyl ester بتركيز 1 M إلى كل هلام. ثم يتم حضنها عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. اغسل كل هلام 10 مرات باستخدام 500 µL من PBS لإزالة جميع آثار محلول glycolaldehyde و glycine ethyl ester.

ثم أضف 400 µL من PBS لمنع الجفاف واحضن هلامات الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها طوال الليل عند 37 °C. وعندما تكون مستعداً للمتابعة، قم بإزالة PBS من هلامات الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها، وأضف 250 µL من الماء المقطر مرتين والمبرد بالثلج إلى كل بئر. احضن الهلامات عند 4 °C لمدة تتراوح بين 16 إلى 24 ساعة لضمان تسييل المصفوفة تماماً.

بعد ذلك، يتم نقل الغشاء القاعدي المسال إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر، وقياس الانبعاث الفلوري للمحلول باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ثم يتم طرد المحلول مركزياً وإزالة السائل الطافي الناتج. يُعاد تعليق الراسب في 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على 20 مليجرام لكل ملليلتر من بروميد السيانوجين و70% حمض الفورميك.

يُحضَن العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استخدم حقنة تستخدم لمرة واحدة سعة 1 ml لنقل هلام الغشاء القاعدي المعاد تعليقه إلى كاسيت دياليز (dialysis cassette) بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 3.5 kDa. اغمر الكاسيت في دورق زجاجي سعة 500 ml يحتوي على 500 ml من الماء المقطر مرتين.

وقم بتحريك الماء باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. اترك هذا التجهيز طوال الليل في درجة حرارة 4 °C لإزالة جميع آثار بروميد السيانوجين وحمض الفورميك. استخدم حقنة بلاستيكية ذات استعمال واحد سعتها 1 mL لنقل المحلول الذي خضع لعملية الديلزة من الكاسيت إلى أنبوب سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، يتم تحليل المحلول عن طريق تشغيله على هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12%. يتم صبغ الهلام بصبغة الفضة لتصور النمط الكهربائي لببتيدات مصفوفة بروميد السيانوجين. وبدءًا من هلامات الغشاء القاعدي المغطاة بـ PBS، يتم شطف الهلام مرتين إضافيتين، باستخدام 300 microliters من PBS الذي يحتوي على 0.1 millimoles من كلوريد الكالسيوم.

و0.5 millimoles من كلوريد المغنيسيوم. لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم إزالة PBS وإضافة 300 µL من 4%paraformaldehyde لتغطية كل هلام غشائي قاعدي معاد تشكيله.

تُحضن الهلامات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت مكونات الغشاء القاعدي المعاد تشكيله. بعد ذلك، يُزال المثبت ويُضاف 300 µL من محلول إخماد يحتوي على 75 millimoles من كلوريد الأمونيوم و0.5 millimoles من كلوريد المغنيسيوم. يُحضن المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يُزال المحلول وتُكرر عملية الشطف أربع مرات أخرى.

بعد عملية الشطف النهائية، أضف 300 µL من منظم التألق المناعي إلى هلامات الغشاء القاعدي المعاد تكوينها لمنع التفاعلات غير النوعية. حضّن الهلامات في المحلول لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة. بعد ذلك، قم بإزالة منظم حجب التألق المناعي.

ثم أضف 300 µL من الجسم المضاد الأولي المخفف في محلول الحجز. يتم تحضين هلامات الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها عند درجة حرارة 4 °C لمدة 16 ساعة. وفي اليوم التالي، يتم إزالة الجسم المضاد الأولي وغسل الهلامات ثلاث مرات باستخدام 300 µL من محلول التألق المناعي.

رجّ الهلامات في درجة حرارة الغرفة على منصة رجّ لمدة 10 دقائق بعد كل إضافة للمحلول المنظم. ثم أزل المحلول المنظم وأضف 300 µL من الأجسام المضادة الثانوية الموّسمة فلوروسنتياً، والمخففة في محلول الحجب. ضع العينات على منصة رجّ، واحضن الهلامات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية. اشطف العينة في محلول منظم للفلورة المناعية، متبوعاً بـ PBS، ثم قم بتثبيت العينات ومعالجتها لإزالة التوهج للمرة الثانية. وأخيراً، قم بتثبيت الهلامات واستخدم المجهر لتحليل تكوين الحزم الكثيفة.

لتكوين عشيقات الغدة البروستاتية، يتم تخفيف 5,000 من خلايا RWPE-1 في 300 microliters من وسط KSFM الكامل، المضاف إليه 2% من محلول الغشاء القاعدي. أما بالنسبة لتجمعات خلايا ورم البروستاتا، فيتم تخفيف 2,500 من خلايا PC3 في 300 microliters من وسط استزراع RPMI-1640، المضاف إليه 2% من محلول الغشاء القاعدي. وبعد تحضين هلامات الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها طوال الليل في PBS، يتم شطفها مرتين باستخدام 500 microliters من وسط الاستزراع.

قبل استزراع الخلايا، قم باستزراع الخلايا برفق على أغشية القاعدة المعاد تشكيلها والمصلبة بنواتج الغلوزة النهائية الطبيعية والمتقدمة. ثم ضع المزارع بعناية في الحاضنة لضمان التوزيع المتساوي للعنيبات والكريات المتنامية.

بالنسبة للخلايا المكونة للعنيبات، يتم تغيير الوسط كل يومين بوسط استزراع جديد يحتوي على 2% من محلول الغشاء القاعدي، وذلك لضمان حصول الخلايا على عوامل النمو اللازمة للتوازن الطبيعي للعنيبات. وبعد ستة أيام من الاستزراع، تشكل الخلايا الظهارية للبروستاتا عنيبات على الغشاء القاعدي الأصلي المعاد تشكيله.

وتنتظم في شكل كرويات موحدة من الخلايا الظهارية. وتمتلك هذه العنيبات أيضًا خصائص الخلايا الظهارية في القنوات (PECs) عالية التنظيم، مع قطبية تمتد من الطرف القمي إلى القاعدي، وفراغ لوميني مرئي. وعند زراعتها لمدة ستة أيام على الغشاء المقسّى، تظهر الخلايا بنية متفككة.

وتتحول من الشكل الكروي إلى الشكل المضلع. وبالإضافة إلى ذلك، تكون هذه العنيبات غير منظمة للغاية، وقد فقدت قطبيتها القمية القاعدية، مع وجود مساحة لومينية صغيرة أو منعدمة.

ينطبق هذا الأمر أيضاً على الخلايا المشتقة من غدة بروستات مصابة بتضخم البروستاتا الحميد. وعند قياس خلايا ورم البروستاتا، وُجد أن الخلايا كانت أطول على الغشاء القاعدي المعاد تشكيله والصلب، كما أنها هاجرت بشكل أسرع وأظهرت زيادة في استمرارية الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمذجة تأثيرات صلابة الغشاء القاعدي على سلوك الخلايا الظهارية والخلايا الورمية.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه يتم تحفيز المستوى المطلوب من صلابة الغشاء القاعدي، وتتشكل الأسناخ (acini) أو الكريات شبه الاصطناعية (s-spheroids) الفردية بشكل سليم. بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال علم الأورام لاستكشاف تحفيز غزو الخلايا السرطانية بواسطة صلابة الغشاء القاعدي في غدة البروستاتا. وبناءً على هذا البروتوكول، يمكن إجراء طرق أخرى، مثل اللطخة المناعية (immunoblotting) لمحلل الخلايا، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بمسار التأشير الذي يتم تعديله بواسطة صلابة الغشاء القاعدي.

لا تنسَ أن العمل باستخدام سيانوبوروهيدريد الصوديوم، وبروميد السيانوجين، وحمض الفورميك قد يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند تنفيذ هذا الإجراء، مثل ارتداء معطف المختبر، والقفازات، وواقي الوجه، وجهاز التنفس أثناء العمل داخل خزانة استخلاص الغازات.