Name: High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri la trasformazione ad alto rendimento di Saccharomyces cerevisiae con librerie di plasmidi per identificare modificatori genetici di fenotipi di tossicità. Questo metodo automatizzato consente screening sistematici su larga scala.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro per la SLA Packard ricerca presso la Johns Hopkins (ADG), Premio New Innovator un direttore NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Rita Allen Foundation Scholar Award. ADP è uno studioso Pew nel Scienze Biomediche, sostenuto dal Pew Charitable Trusts.

1. I preparativi per la trasformazione del lievito Questo protocollo è progettato per una decina di piastre a 96 pozzetti, ma può essere scalato verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Abbiamo scoperto che questo protocollo non funziona bene per più di venti piastre a 96 pozzetti per ogni turno di trasformazione. La procedura di trasformazione intera (dal punto I.3) dura circa otto ore. <ol><li> Aliquota 5-10μL di DNA plasmidico (100 ng / mL) dalla libreria lievito FLEXGene ORF in ciascun pozzetto di un fondo rotondo a 96 pozzetti con il gestore RapidPlate Biorobot liquido. Luogo scoperto piastre a 96 pozzetti in cappa aspirante da banco pulito durante la notte ad asciugare. Abbiamo trovato efficienze trasformazione simile con il CEN e plasmidi di lievito 2μ. </li><li> Inoculare lievito 200 ml di peptone destrosio (YPD) media (10 g / l estratto di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di glucosio) con ceppo query in un pallone di Erlenmeyer 500mL sconcertato. Incubare una notte a 30 ° C con agitazione (200 giri). Se necessario, terreni selettivi possono essere utilizzati anche per queste colture starter. </li><li> La mattina seguente, diluire lo sforzo query per OD 600 = 0.1 in 2L di YPD. Agitare per 4-6 ore a 30 ° C (200 rpm) fino a quando la cultura arriva OD 600 = 0,8-1,0. Per una crescita ottimale, crescono due culture 1L in separato 2,8 fiaschi L sconcertato. Se necessario, terreni selettivi può anche essere usato al posto di YPD. </li></ol> 2. Lievito di trasformazione <ol><li> Celle di raccolta per centrifugazione. Riempite quattro tubi monouso 225ml conica con la cultura lievito e far girare a 3000rpm (~ 1800 xg) per 5 minuti in centrifuga da tavolo (Eppendorf 5810R). Eliminare il surnatante e ripetere fino a quando tutte le cellule vengono raccolte. </li><li> Lavare le cellule in 200 ml di distillato in autoclave H 2 O. Risospendere il pellet cellulare agitazione o vortex. Combina le cellule in una provetta conica 225ml. Spin a 3000rpm per 5 minuti. Rimuovere il surnatante. </li><li> Preparare la soluzione 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 in autoclave acqua distillata). Lavare le cellule in 0.1MLiOAc/1XTE 100 ml. Spin a 3000rpm per 5 minuti. Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Scuotere e / o vortice di assicurare pellet è completamente risospeso. </li><li> Incubare con agitazione a 30 ° C per 30 minuti (200 giri). </li><li> Aggiungi β-mercaptoetanolo per 0,1 M. Incubare con agitazione a 30 ° C per 30 minuti (200 giri). Nota: questo passaggio può essere omesso se si utilizza ceppi di lievito che sono sensibili alle β-mercaptoetanolo. Abbiamo scoperto che questo passaggio non è essenziale per la trasformazione di successo, ma lo fa migliorare l'efficienza di trasformazione. </li><li> Fate bollire 2 ml di DNA sonicato sperma di salmone (10 mg) per 15 minuti, raffreddare e poi su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 2 ml di DNA dello sperma di salmone bollito alla miscela di cellule. Attenzione: può formare un precipitato dopo l'aggiunta del DNA dello sperma di salmone alla miscela di cellule. Utilizzando un Pipetman e 200 microlitri punta, rimuovere con attenzione l'eventuale precipitato che si forma, perché questo potrebbe interferire con pipettaggio a valle. </li><li> 50μL aliquota di miscela di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti utilizzando il Rapidplate BioRobot (può anche usare pipetta multicanale). Non mescolare. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitare. </li><li> Preparare 200 ml di 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml del 50% PEG-3350, DMSO 20 mL, 20 mL LiOAc 1M). Preparare la soluzione immediatamente prima dell'uso. </li><li> Aggiungere 125μL di PEG / LioAc / DMSO soluzione a ciascun pozzetto. Mix di aspirare e dispensare sospensione cellulare otto volte con RapidPlate. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitare. </li><li> Scossa di calore le cellule a 42 ° C per 15 minuti in un incubatore a secco. Non impilare piatti. Nota: Abbiamo trovato che questo passo shock termico non è essenziale per la trasformazione di successo. Per alcuni ceppi di lievito (per esempio, i mutanti sensibili alla temperatura), shock termico è deleteria. Abbiamo già ridotto il tempo shock termico a un minuto e sono stati in grado di trasformare con successo un ceppo di lievito portatori di una mutazione sensibile ypt1 temperatura con questo protocollo. </li><li> Spin piastre a 2500rpm (ca. 1100 xg) per 5 minuti, utilizzando adattatori centrifuga per accogliere piastre da 96 pozzetti. Rimuovere la soluzione PEG da piastre invertendo oltre secchio dei rifiuti. Blot piastra capovolta su carta assorbente per eliminare il liquido residuo (cellule resterà sul fondo dei pozzi). </li><li> Lavare le cellule con l'aggiunta di 200μL di terreno minimo (ad esempio, SD /-Ura) in ciascun pozzetto con RapidPlate. </li><li> Spin piastre a 2500rpm per 5 minuti e rimuovere sopranatante invertendo secchio dei rifiuti più e assorbente su carta assorbente. </li><li> Aggiungere 200μL di terreno minimo (ad esempio, SD /-Ura) in ciascun pozzetto con RapidPlate. </li><li> Incubare a 30 ° C per 2 giorni senza agitare. Dopo 2 giorni, piccole colonie di cellule dovrebbero iniziare a modulo in fondo di ogni successo trasformato bene. </li></ol> 3. Spotting test <ol><li> Dispensare 200μL di raffinosio mezzi di comunicazione basati minimo (ad esempio SRaf /-Ura) in ciascun pozzetto diun nuovo fondo piatto piastra da 96 pozzetti. </li><li> Mescolare ciascun pozzetto della piastra di trasformazione da aspirare e dispensare sospensione cellulare otto volte con Rapidplate. </li><li> Inoculare le piastre con SRaf 5μL di miscela di cellule dalla piastra di trasformazione. </li><li> Incubare a 30 ° C per un giorno. Piccole colonie dovrebbero essere presenti nella parte inferiore di ogni bene dopo un giorno. </li><li> Colonie Spot su SD /-Ura e SGal /-Ura piastre in cappuccio. Sterilizzare 96-bullone replicatore (Frogger) mediante esposizione alla fiamma. Mescolare colonie con Frogger prima spotting su piastre selettive dei media. Dopo spotting, permettono piastre ad asciugare cappuccio per 5-10 minuti. </li><li> Incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. </li></ol> Piastre di fotografia con fotocamera digitale, e confrontare visivamente la crescita di colonie su SGal /-Ura piastre di trovare colonie in cui tossicità ceppo query è migliorato (una crescita più lenta / colonie meno densa) o soppressa (la crescita più veloce / più dense colonie). 4. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Sovraespressione schermo lievito plasmide per identificare soppressori ed esaltatori di TDP-43 tossicità. TDP-43 è una proteina umana che è stato implicato nella patogenesi della sclerosi laterale amiotrofica (malattia di Lou Gehrig). Aggregati citoplasmatici di TDP-43 si accumulano nel cervello e neuroni del midollo spinale di pazienti affetti da SLA 17. Esprimendo TDP-43 nei risultati lievito cellule aggregazione e citotossicità 18. Abbiamo utilizzato questo sistema modello per definire i meccanismi di TDP-43 tossicità 19,20. Presenti sono degli esempi rappresentativo di piatti dal nostro lievito TDP-43 schermo modificatore di tossicità. Queste lastre visualizzare colonie con un sistema integrato di galattosio-inducibile TDP-43 plasmide e anche trasformato con i plasmidi della libreria FLEXGene espressione ORF. La piastra a sinistra contiene glucosio, che reprime l'espressione di TDP-43 o il plasmidi FLEXGene. La piastra di destra contiene galattosio, che induce l'espressione di TDP-43 e la ORF in plasmidi FLEXGene. La freccia verde indica una colonia trasformato con un plasmide che sopprime la tossicità di TDP-43. La freccia rossa indica una colonia trasformato con un plasmide che esalta la tossicità di TDP-43.

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<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui vi presentiamo un protocollo per eseguire un elevato throughput schermo plasmide sovraespressione nel lievito. Questo approccio permette di screening rapido e imparziale per modificatori genetici di molti diversi fenotipi cellulari. Usando questo approccio, un ricercatore può schermo una porzione significativa del genoma del lievito in una questione di settimane. Questo approccio imparziale consente inoltre l&#39;identificazione di modifica, che non possono essere previste in base ai risultati precedenti. Abbiamo us...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 bullone replicatore (Frogger) </td><td> V &amp; P scientifico </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF Biblioteca </td><td> Istituto di Proteomica, Harvard Medical School </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da tavolo </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500mL fiasco sconcertato </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2.8L triplo sconcertato Fernbach fiasco </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> 100μL Rapidplate puntali </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200μL Rapidplate puntali </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

high-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Il lievito, Saccharomyces cerevisiae, è un sistema potente modello per la definizione di meccanismi fondamentali di molti importanti processi cellulari, tra cui quelle con rilevanza diretta per la malattia umana. A causa della sua breve tempo di generazione e ben caratterizzati genoma, uno dei principali vantaggi sperimentale del sistema modello lievito è la capacità di eseguire schermi genetico per identificare i geni e le vie che sono coinvolti in un dato processo. Nel corso degli ultimi 30 anni tale schermi genetici sono stati utilizzati per spiegare il ciclo cellulare, via secretoria, e molti altri aspetti altamente conservato della biologia delle cellule eucariotiche 1-5. Negli ultimi anni, diverse biblioteche genoma dei ceppi di lievito e plasmidi sono stati generati 6-10. Queste raccolte permettono ora per l&#39;interrogatorio sistematico della funzione del gene utilizzando guadagno e la perdita di funzione approcci 11-16. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di un high-throughput protocollo di lievito di trasformazione con un robot di gestione dei liquidi per eseguire uno schermo plasmide iperespressione, utilizzando una libreria di 5.500 schierati plasmidi lievito. Abbiamo utilizzato questi schermi per identificare i modificatori genetici di tossicità associata con l&#39;accumulo di proteine ​​umane di aggregazione a rischio di malattie neurodegenerative. I metodi presentati qui sono facilmente adattabili allo studio di altri fenotipi cellulari di interesse.

Qui si descrive uno schermo plasmide sovraespressione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Utilizzando una libreria schierate plasmide e un elevato throughput protocollo di trasformazione di lievito con un robot di manipolazione dei liquidi.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

Il lievito a gemmazione, Saccharomyces cerevisiae, è un potente sistema modello per definire i meccanismi fondamentali di molti importanti processi cellulari, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare cellule di lievito con una libreria di plasmidi di DNA. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una quantità adeguata di cellule di lievito. Le cellule di lievito vengono quindi trattate con acetato di litio per renderle competenti alla trasformazione del DNA.Successivamente, trasformare le cellule e competenti mescolandole con il DNA. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella selezione e nell'analisi dei trasformanti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano gli effetti del DNA plasmidico sui fenotipi del lievito mediante saggi di spotting del lievito e/o microscopia.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti, come le trasformazioni standard di lieviti, è che consente la trasformazione di un elevato numero di plasmidi diversi in cellule di lievito in modo automatizzato. Questo protocollo di trasformazione del lievito ad alto rendimento è progettato per 10 piastre da 96 pozzetti, ma può essere adeguato in scala maggiore o minore secondo necessità. Per esperimenti su larga scala, la chiave del successo consiste nel mantenere organizzate tutte le piastre e i reagenti.Una volta iniziato l'esperimento, per evitare confusione, in questo protocollo verrà utilizzato un manipolatore automatico di piastre in formato rapido. Per iniziare, aliquotare da cinque a dieci microlitri di DNA plasmidico da un'ampia libreria di plasmidi di lievito in ciascun pozzetto di piastre rotonde da 96 pozzetti con fondo piatto. Posizionare le piastre da 96 pozzetti, scoperte, all'interno di una cappa sterile per tutta la notte per farle asciugare.In seguito inoculare 200 millilitri di terreno YPD (yeast peptide dextrose) con un ceppo in esame in un matraccio Lin Meyer baffled da 500 millilitri e incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Al mattino seguente, diluire il ceppo in esame fino a un OD 600 di 0,1 in due litri di terreno YPD per una crescita ottimale. Coltivare colture fino a un litro in flaconi baffled separati da 2,8 litri.Agitare i flaconi per quattro-sei ore a 30 gradi Celsius fino a quando le colture raggiungono un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0. Quando la coltura di lievito ha raggiunto un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Riempire quattro provette coniche monouso da 225 millilitri con la coltura e centrifugare a 3000 giri al minuto per cinque minuti in una centrifuga da banco.Versare il soprannatante S da ogni provetta. Aggiungere ulteriore coltura alle stesse provette e centrifugare nuovamente, ripetendo secondo necessità fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. Lavare ogni pellet cellulare con 50 millilitri di acqua distillata autoclavata e risospendere mediante vortex. Unire le cellule in un unico tubo conico da 225 millilitri e centrifugare a 3000 giri al minuto per cinque minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante S, lavare le cellule con 100 millilitri di soluzione di acetato di litio. Centrifugare nuovamente a 3000 giri al minuto per cinque minuti.Rimuovere il SNA e risospendere il pellet cellulare in 70 millilitri di soluzione di acetato di litio. Eseguire un vortex ad alta velocità per circa 30 secondi fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Incubare sotto agitazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti.Successivamente, aggiungere beta-me-capto-etanolo fino a una concentrazione di 0,1 M e incubare sotto agitazione a 30 gradi Celsius per altri 30 minuti. Al termine dell'incubazione di 30 minuti, aggiungere due millilitri di DNA di sperma di salmone bollito e raffreddato alla miscela cellulare. Versare la miscela cellulare in una piastra monocolonna autoclavabile, quindi rimuovere qualsiasi precipitato che si forma poiché potrebbe interferire con le successive operazioni di pipettaggio.Utilizzando il biobot rapid plate, aliquotare 50 microlitri di miscela cellulare in ciascun pozzetto delle quattro piastre a 96 pozzetti precedentemente preparate contenenti DNA plasmidico. Non mescolare. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitazione, mentre le cellule sono in incubazione.Preparare 200 millilitri di soluzione di acetato di litio PEG DMSO. Mescolare 160 millilitri di PEG 33 al 50%, 20 millilitri di DMSO e 20 millilitri di acetato di litio 1 M. È fondamentale preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.Aggiungere 125 microlitri di soluzione di acetato di PEG e litio in DMSO a ciascuno. Mescolare bene aspirando e dispensando la sospensione cellulare otto volte. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitazione.Successivamente, sottoporre le cellule a shock termico a 42 gradi Celsius per 15 minuti in un incubatore asciutto; non impilare le piastre dopo lo shock termico, centrifugare le piastre utilizzando adattatori per centrifuga che accolgano piastre a 96 pozzetti. Dopo la centrifugazione, rimuovere la soluzione di PEG capovolgendo le piastre sopra un contenitore per rifiuti. Quindi asciugare le piastre capovolte tamponandole con carta assorbente.Per rimuovere il liquido residuo, le cellule rimarranno sul fondo delle pozzette. Lavare le cellule aggiungendo 200 microlitri di mezzo minimo in ciascuna. Centrifugare nuovamente le piastre.Rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra su un contenitore per rifiuti e tamponando con carta assorbente. Aggiungere 200 microlitri di terreno minimo in ogni pozzetto con una pipetta multicanale e incubare rapidamente la piastra a 30 gradi Celsius per due giorni senza agitazione. Dopo due giorni, piccole colonie di cellule dovrebbero iniziare a formarsi sul fondo di ciascun pozzetto in cui la trasformazione è avvenuta con successo.Per preparare il saggio di spalmatura, aggiungere prima 200 microlitri di terreno minimo a base di OSE in ogni pozzetto di una nuova piastra piatta da 96 pozzetti. Successivamente, mescolare ogni pozzetto della piastra di trasformazione aspirando e dispensando la sospensione cellulare otto volte con una pipetta multicanale rapida.Inoculare ogni pozzetto della piastra con raffinosio con cinque microlitri di miscela cellulare dalla piastra di trasformazione, incubare a 30 gradi Celsius per un giorno. Il giorno successivo, dovrebbero essere presenti piccole colonie sul fondo di ciascun pozzetto.Eseguire il saggio di spotting nella cappa, sterilizzando un portapiastra da 96 pozzetti, un replicatore o un frogger mediante fiammatura. Mescolare le colonie con un frogger e quindi depositarle su piastre di terreno selettivo. Dopo il prelievo, lasciare asciugare le piastre nella cappa per cinque-dieci minuti.Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. Qui sono mostrati risultati rappresentativi di uno screening dell'iperespressione di plasmidi di lievito per identificare soppressori e potenziatori della tossicità di TDP-43. TDP-43 è una proteina umana implicata nella patogenesi della sclerosi laterale amiotrofica o malattia di Lou Gehrig; l'espressione di TDP-43 in cellule di lievito provoca aggregazione e citotossicità.Queste piastre mostrano colonie con un plasmide di T DP 43 induttibile da galattosio, che sono state inoltre trasformate con plasmidi della libreria di espressione ORF del gene flessibile. Le colonie appaiono di colore rosso perché il ceppo presenta casualmente una mutazione che determina l'accumulo di un pigmento rosso. La piastra a sinistra contiene glucosio, che reprime l'espressione di T DP 43 o dei plasmidi del gene flessibile.La piastra a destra contiene galattosio, che induce l'espressione di TDP 43 e delle O Fs nei plasmidi del gene flex. La freccia verde indica una colonia trasformata con un plasmide che sopprime la tossicità di TDP 43, come indicato da una crescita più rapida e colonie più dense. La freccia rossa indica una colonia trasformata con un plasmide che aumenta la tossicità di TDP 43, come indicato da una crescita più lenta e colonie meno dense.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasformare una libreria di evasione di DNA plasmatici da cellule.

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