High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare cellule di lievito con una libreria di plasmidi di DNA. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una quantità adeguata di cellule di lievito. Le cellule di lievito vengono quindi trattate con acetato di litio per renderle competenti alla trasformazione del DNA.

Successivamente, trasformare le cellule e competenti mescolandole con il DNA. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella selezione e nell'analisi dei trasformanti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano gli effetti del DNA plasmidico sui fenotipi del lievito mediante saggi di spotting del lievito e/o microscopia.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti, come le trasformazioni standard di lieviti, è che consente la trasformazione di un elevato numero di plasmidi diversi in cellule di lievito in modo automatizzato. Questo protocollo di trasformazione del lievito ad alto rendimento è progettato per 10 piastre da 96 pozzetti, ma può essere adeguato in scala maggiore o minore secondo necessità. Per esperimenti su larga scala, la chiave del successo consiste nel mantenere organizzate tutte le piastre e i reagenti.

Una volta iniziato l'esperimento, per evitare confusione, in questo protocollo verrà utilizzato un manipolatore automatico di piastre in formato rapido. Per iniziare, aliquotare da cinque a dieci microlitri di DNA plasmidico da un'ampia libreria di plasmidi di lievito in ciascun pozzetto di piastre rotonde da 96 pozzetti con fondo piatto. Posizionare le piastre da 96 pozzetti, scoperte, all'interno di una cappa sterile per tutta la notte per farle asciugare.

In seguito inoculare 200 millilitri di terreno YPD (yeast peptide dextrose) con un ceppo in esame in un matraccio Lin Meyer baffled da 500 millilitri e incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Al mattino seguente, diluire il ceppo in esame fino a un OD 600 di 0,1 in due litri di terreno YPD per una crescita ottimale. Coltivare colture fino a un litro in flaconi baffled separati da 2,8 litri.

Agitare i flaconi per quattro-sei ore a 30 gradi Celsius fino a quando le colture raggiungono un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0. Quando la coltura di lievito ha raggiunto un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Riempire quattro provette coniche monouso da 225 millilitri con la coltura e centrifugare a 3000 giri al minuto per cinque minuti in una centrifuga da banco.

Versare il soprannatante S da ogni provetta. Aggiungere ulteriore coltura alle stesse provette e centrifugare nuovamente, ripetendo secondo necessità fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. Lavare ogni pellet cellulare con 50 millilitri di acqua distillata autoclavata e risospendere mediante vortex.

Unire le cellule in un unico tubo conico da 225 millilitri e centrifugare a 3000 giri al minuto per cinque minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante S, lavare le cellule con 100 millilitri di soluzione di acetato di litio. Centrifugare nuovamente a 3000 giri al minuto per cinque minuti.

Rimuovere il SNA e risospendere il pellet cellulare in 70 millilitri di soluzione di acetato di litio. Eseguire un vortex ad alta velocità per circa 30 secondi fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Incubare sotto agitazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, aggiungere beta-me-capto-etanolo fino a una concentrazione di 0,1 M e incubare sotto agitazione a 30 gradi Celsius per altri 30 minuti. Al termine dell'incubazione di 30 minuti, aggiungere due millilitri di DNA di sperma di salmone bollito e raffreddato alla miscela cellulare. Versare la miscela cellulare in una piastra monocolonna autoclavabile, quindi rimuovere qualsiasi precipitato che si forma poiché potrebbe interferire con le successive operazioni di pipettaggio.

Utilizzando il biobot rapid plate, aliquotare 50 microlitri di miscela cellulare in ciascun pozzetto delle quattro piastre a 96 pozzetti precedentemente preparate contenenti DNA plasmidico. Non mescolare. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitazione, mentre le cellule sono in incubazione.

Preparare 200 millilitri di soluzione di acetato di litio PEG DMSO. Mescolare 160 millilitri di PEG 33 al 50%, 20 millilitri di DMSO e 20 millilitri di acetato di litio 1 M. È fondamentale preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.

Aggiungere 125 microlitri di soluzione di acetato di PEG e litio in DMSO a ciascuno. Mescolare bene aspirando e dispensando la sospensione cellulare otto volte. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitazione.

Successivamente, sottoporre le cellule a shock termico a 42 gradi Celsius per 15 minuti in un incubatore asciutto; non impilare le piastre dopo lo shock termico, centrifugare le piastre utilizzando adattatori per centrifuga che accolgano piastre a 96 pozzetti. Dopo la centrifugazione, rimuovere la soluzione di PEG capovolgendo le piastre sopra un contenitore per rifiuti. Quindi asciugare le piastre capovolte tamponandole con carta assorbente.

Per rimuovere il liquido residuo, le cellule rimarranno sul fondo delle pozzette. Lavare le cellule aggiungendo 200 microlitri di mezzo minimo in ciascuna. Centrifugare nuovamente le piastre.

Rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra su un contenitore per rifiuti e tamponando con carta assorbente. Aggiungere 200 microlitri di terreno minimo in ogni pozzetto con una pipetta multicanale e incubare rapidamente la piastra a 30 gradi Celsius per due giorni senza agitazione. Dopo due giorni, piccole colonie di cellule dovrebbero iniziare a formarsi sul fondo di ciascun pozzetto in cui la trasformazione è avvenuta con successo.

Per preparare il saggio di spalmatura, aggiungere prima 200 microlitri di terreno minimo a base di OSE in ogni pozzetto di una nuova piastra piatta da 96 pozzetti. Successivamente, mescolare ogni pozzetto della piastra di trasformazione aspirando e dispensando la sospensione cellulare otto volte con una pipetta multicanale rapida.

Inoculare ogni pozzetto della piastra con raffinosio con cinque microlitri di miscela cellulare dalla piastra di trasformazione, incubare a 30 gradi Celsius per un giorno. Il giorno successivo, dovrebbero essere presenti piccole colonie sul fondo di ciascun pozzetto.

Eseguire il saggio di spotting nella cappa, sterilizzando un portapiastra da 96 pozzetti, un replicatore o un frogger mediante fiammatura. Mescolare le colonie con un frogger e quindi depositarle su piastre di terreno selettivo. Dopo il prelievo, lasciare asciugare le piastre nella cappa per cinque-dieci minuti.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. Qui sono mostrati risultati rappresentativi di uno screening dell'iperespressione di plasmidi di lievito per identificare soppressori e potenziatori della tossicità di TDP-43. TDP-43 è una proteina umana implicata nella patogenesi della sclerosi laterale amiotrofica o malattia di Lou Gehrig; l'espressione di TDP-43 in cellule di lievito provoca aggregazione e citotossicità.

Queste piastre mostrano colonie con un plasmide di T DP 43 induttibile da galattosio, che sono state inoltre trasformate con plasmidi della libreria di espressione ORF del gene flessibile. Le colonie appaiono di colore rosso perché il ceppo presenta casualmente una mutazione che determina l'accumulo di un pigmento rosso. La piastra a sinistra contiene glucosio, che reprime l'espressione di T DP 43 o dei plasmidi del gene flessibile.

La piastra a destra contiene galattosio, che induce l'espressione di TDP 43 e delle O Fs nei plasmidi del gene flex. La freccia verde indica una colonia trasformata con un plasmide che sopprime la tossicità di TDP 43, come indicato da una crescita più rapida e colonie più dense. La freccia rossa indica una colonia trasformata con un plasmide che aumenta la tossicità di TDP 43, come indicato da una crescita più lenta e colonie meno dense.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasformare una libreria di evasione di DNA plasmatici da cellule.