High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare le cellule di lievito con una libreria di array di DNA plasmatico. Ciò si ottiene coltivando prima una quantità adeguata di cellule di lievito. Le cellule di lievito vengono quindi trattate con acetato di litio per renderle competenti per la trasformazione del DNA.

Successivamente, trasforma le cellule e competenti mescolandole con il DNA. La fase finale della procedura consiste nel selezionare e analizzare i trasformanti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano gli effetti del DNA plasmatico sui fenotipi del lievito attraverso saggi di spotting del lievito e/o microscopia.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti, come le trasformazioni standard del lievito, è che consente la trasformazione di un gran numero di plasmidi diversi in cellule di lievito in modo automatizzato. Questo protocollo di trasformazione del lievito ad alta produttività è progettato per piastre da 10 96 pozzetti, ma può essere scalato di conseguenza. Per gli esperimenti su larga scala, la chiave del successo è mantenere organizzate tutte le piastre e i reagenti.

Una volta che l'esperimento è in corso per evitare confusione, in questo protocollo verrà utilizzato un gestore di liquidi a piastre rapide biobot Per iniziare l'aliquota, da cinque a 10 microlitri di DNA plasmatico da una libreria di plasmidi di lievito array in ciascun pozzetto del round. Piastre inferiori a 96 pozzetti. Posizionare le piastre da 96 pozzetti scoperte all'interno di una cappa da banco pulita per una notte ad asciugare.

Successivamente, inoculare 200 millilitri di peptide di lievito, destrosio o terreno YPD con un ceppo di query in un pallone di Lin Meyer da 500 millilitri, incubato per una notte a 30 gradi Celsius con agitazione la mattina seguente. Diluire il ceppo di query a un OD 600 di 0,1 in due litri di terreno YPD per una crescita ottimale. Coltiva fino a un litro di colture in fiasche deflettori separate da 2,8 litri.

Agitare i flaconi per quattro-sei ore a 30 gradi Celsius fino a quando le colture raggiungono un OD 600 da 0,8 a 1,0. Quando la coltura del lievito ha raggiunto un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Riempi quattro provette coniche monouso da 225 millilitri con la coltura e centrifuga a 3000 giri/min per cinque minuti in una centrifuga da tavolo.

Versare il surnatante S da ogni tubo. Aggiungere altra coltura alle stesse provette e centrifugare di nuovo, ripetendo se necessario fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. Lavare ogni pellet cellulare in 50 millilitri di acqua distillata in autoclave e Resus spende per vortex.

Combina le celle in un tubo conico da duecentoventicinque millilitri e gira a 3000 giri/min per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante S, lavare le celle in cento millilitri di soluzione di acetato di litio. Girare di nuovo a 3000 giri/min per cinque minuti.

Rimuovere l'SNA e risospendere il pellet cellulare in 70 millilitri di soluzione di acetato di litio. Agitare ad alta velocità per circa 30 secondi fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Incubare agitando a 30 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, aggiungere beta me capto etanolo a 0,1 molari incubare agitando a 30 gradi Celsius per altri 30 minuti. Dopo l'incubazione di 30 minuti, aggiungere due millilitri di DNA di sperma di salmone bollito e refrigerato alla miscela di cellule. Versare la miscela di cellule in una piastra a pozzetto singolo autoclavabile, quindi rimuovere l'eventuale precipitato che si forma in quanto ciò potrebbe interferire con il pipettaggio a valle.

Utilizzando la piastra rapida biobot, aliquotare 50 microlitri di miscela cellulare in ciascun pozzetto dei quattro precedentemente preparati. Le piastre da 96 pozzetti contenenti DNA plasmatico non si mescolano. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitare mentre le cellule sono in incubazione.

Preparare 200 millilitri di soluzione di acetato di litio PEG DMSO. Combina 160 millilitri di PEG 33 al 50%, 50, 20 millilitri di DMSO e 20 millilitri di un molare di acetato di litio. È importante che questa soluzione sia preparata appena prima dell'uso.

Aggiungere 125 microlitri di soluzione PEG di acetato di litio DMSO a ciascuno. Mescolare bene aspirando ed erogando la sospensione cellulare otto volte. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitare.

Quindi, shock termico delle celle a 42 gradi Celsius per 15 minuti In un'incubatrice asciutta, non impilare le piastre dopo lo shock termico, centrifugare le piastre utilizzando adattatori per centrifuga per ospitare le piastre a 96 pozzetti. Dopo la centrifugazione, rimuovere la soluzione PEG capovolgendo le piastre su un secchio per rifiuti. Quindi tamponare i piatti capovolti su carta assorbente.

Per rimuovere il liquido residuo, le celle rimarranno sul fondo dei pozzetti. Sciacquare le cellule aggiungendo 200 microlitri di terreno minimo a ciascuna. Bene, gira di nuovo i piatti.

Rimuovere il surnatante capovolgendolo su un secchio per rifiuti e tamponando su carta assorbente. Aggiungere 200 microlitri di terreno minimo a ciascun pozzetto con una piastra rapida, incubare a 30 gradi Celsius per due giorni senza agitare. Dopo due giorni, piccole colonie di cellule dovrebbero iniziare a formarsi sul fondo di ogni trasformato con successo.

Per prepararsi al test di Spatting, erogare prima 200 microlitri di terreno minimo a base di OSE in ciascun pozzetto di un nuovo appartamento. Piastra inferiore a 96 pozzetti. Prossimo. Miscelare ogni pozzetto della piastra di trasformazione aspirando ed erogando la sospensione cellulare otto volte con una piastra rapida.

Inoculare ogni pozzetto della piastra di raffinosio con cinque microlitri di miscela cellulare dalla piastra di trasformazione, incubare a 30 gradi Celsius per un giorno. Il giorno seguente. Piccole colonie dovrebbero essere presenti nella parte inferiore di ciascuna.

Eseguire bene il test di spotting nella cappa, sterilizzare un bullone 96, un replicatore o un frogger mediante fiammatura. Mescola le colonie con un frogger e poi individua le colonie su piastre di terreno selettive. Dopo la maculatura, lasciare asciugare le piastre nella cappa per cinque-10 minuti.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. Ecco i risultati rappresentativi di uno screening di sovraespressione del plasmide di lievito per identificare soppressori e potenziatori di TDP 43.Tossicità. La TDP 43 è una proteina umana che è stata implicata nella patogenesi di una sclerosi laterale miotrofica o malattia di Lou Gehrig che esprime la TDP 43 nelle cellule di lievito con conseguente aggregazione e citotossicità.

Queste piastre mostrano colonie con un plasmide T DP 43 integrato inducibile al galattosio, che sono state anche trasformate con plasmidi dalla libreria di espressione ORF del gene flex. Le colonie qui appaiono di colore rosso perché il ceppo ha una mutazione che provoca l'accumulo di un pigmento rosso. La piastra a sinistra contiene glucosio, che reprime l'espressione di T DP 43 o dei plasmidi del gene flex.

La piastra a destra contiene galattosio, che induce l'espressione di TDP 43 e O Fs nei plasmidi del gene flex. La punta di freccia verde indica una colonia trasformata con un plasmide che sopprime la tossicità del TDP 43 come indicato da una crescita più rapida e da colonie più dense. La punta di freccia rossa indica una colonia trasformata con un plasmide che aumenta la tossicità del TDP 43 come indicato da una crescita più lenta e da colonie meno dense.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasformare una libreria di DNA plasmatico de cellule.