misurazione In Vitro Attività ATPasi per enzimatica Caratterizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di quantificare l'attività ATPasica in vitro di proteine purificate per la caratterizzazione funzionale. Questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare nuove ATPasi putative, valutare i potenziali attivatori o inibitori efficaci e per determinare il contributo di particolari domini o residui all'attività dell'ATPasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice e sensibile per misurare l'attività dell'ATPasi in vitro e può essere facilmente ottimizzato.

Preparare le scorte di tutti i reagenti necessari per l'incubazione con proteine purificate come indicato nel protocollo di testo. Premiscelare 100 millimolari di cloruro di magnesio e 100 millimolari di ATP in un rapporto uno a uno appena prima di impostare la reazione di idrolisi dell'ATP. Preparare ed etichettare provette da 1,5 millilitri per la raccolta dei campioni a intervalli regolari durante la reazione.

Preparare le provette per raccogliere i campioni a volte zero e a volte a ore di 15, 30, 45 e 60 minuti. Aggiungere 245 microlitri di tampone HNG 1x a ciascuna provetta per diluire i campioni raccolti dalle reazioni di idrolisi dell'ATP a una diluizione da uno a 50. Successivamente, preparare un bagno di ghiaccio secco ed etanolo per congelare rapidamente i campioni per fermare la reazione.

In un secchiello per il ghiaccio di gomma o in un altro contenitore sicuro, aggiungi diversi pezzi di ghiaccio secco e versa con cura una quantità di etanolo dal 70% al 100% per coprire il ghiaccio secco. Diluire la proteina purificata in un tampone 1X HNG e mantenerla in ghiaccio. Impostare le reazioni di idrolisi dell'ATP nelle provette da 0,5 millilitri preparate aggiungendo un volume d'acqua precalcolato per raggiungere un volume di reazione finale di 30 microlitri.

Seguito da sei microlitri di 5X HNG o altro tampone, tre microlitri di miscela di ATP di cloruro di magnesio da 100 millimolari e proteine da 0,25 a cinque micromolari. Incubare una condizione di controllo negativo solo tampone in cui non viene aggiunta alcuna proteina. Quindi, rimuovere cinque microlitri dalla reazione a volte zero.

Quindi diluire l'aliquota da uno a 50 nella provetta preparata da 1,5 millilitri contenente 245 microlitri di tampone HNG. Congelare immediatamente il campione nel bagno di etanolo con ghiaccio secco. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per consentire l'idrolisi dell'ATP per un'ora.

Ad ogni intervallo, rimuovere aliquote di cinque microlitri dalla reazione e aggiungerle alle provette del campione etichettate contenenti tampone HNG come prima. Al termine della reazione di idrolisi dell'ATP, spostare i campioni diluiti in un congelatore a 80 gradi Celsius per la conservazione. Per assicurarsi che tutti i campioni siano completamente congelati, attendere almeno 10 minuti prima di procedere.

Scongelare i campioni diluiti contenenti aliquote della reazione di idrolisi dell'ATP da ciascun punto temporale a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una piastra a 96 pozzetti contenente campioni e standard di fosfato. In una provetta da 0,5 millilitri diluire lo standard di fosfato da 800 micromolari a 40 micromolari aggiungendo 5,5 microlitri di standard a 104,5 microlitri di tampone HNG.

Mescolare bene e aggiungere 100 microlitri di questo standard di fosfato da 40 micromolari al pozzetto A1 della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di tampone HNG ai pozzetti da B1 a H1 per diluizioni seriali uno a uno dello standard del fosfato. Rimuovere 50 microlitri di fosfato 40 micromolare dal pozzetto A1, aggiungerlo ai 50 microlitri di tampone di saggio nel pozzetto B1 e mescolare.

Quindi rimuovere 50 microlitri dal pozzetto B1 e aggiungerlo al pozzetto C1, continuando le diluizioni attraverso il pozzetto G1. Scartare 50 microlitri dal pozzetto G1 dopo la miscelazione per assicurarsi che ogni pozzetto abbia lo stesso volume. Il pozzo H1 dovrebbe contenere solo tampone per creare uno standard di fosfato da 40 a zero micromolare. Quindi, aggiungere 50 microlitri di ciascun campione in duplicato alla piastra.

Aggiungete campioni dallo stesso punto temporale nelle colonne verticalmente e da punti temporali diversi orizzontalmente. Ciò consente di ottenere fino a otto campioni e cinque punti temporali per piastra. Utilizzare una pipetta sterile per rimuovere una quantità sufficiente di reagente per la rilevazione del fosfato di meliptato, verde malachite, per aggiungere 100 microlitri a ciascuno dei pozzetti contenenti campioni e standard.

Aggiungere il reagente di rilevamento a una piastra per facilitare il pipettaggio utilizzando una pipetta multicanale. Non versare il reagente di rilevamento direttamente nella capsula poiché è probabile che si verifichi una contaminazione da fosfati. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di reagente per la rilevazione del fosfato a ciascun pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù un numero costante di volte senza introdurre bolle, lavorando in ordine dall'ultimo punto temporale al primo punto temporale.

Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 25 minuti o secondo le indicazioni del produttore. Per quantificare i risultati, leggere l'assorbanza dei campioni a 650 nanometri utilizzando un lettore di micro piastre ad assorbanza. Vengono mostrati risultati rappresentativi delle ATPasi cinetiche ed endpoint, in cui l'attività delle forme wild type e mutanti della secrezione di tipo due ATPasi/EPSE è determinata in presenza e assenza di una cardiolipina stimolante.

Qui sono mostrati i risultati di un'ATPasi cinetica stimolata con cardiolipina, che dimostra il rilascio lineare di fosfato nel tempo per EPSE wild type e un doppio mutante di lisina, con albumina sierica bovina che funge da controllo negativo. Questi dati possono essere rappresentati come la quantità di fosfato rilasciata al minuto divisa per la concentrazione proteica al fine di quantificare e confrontare l'attività dell'ATPasi di ciascuna proteina. I dati indicano che due residui di lisina, K417 e K419, contribuiscono all'attività ATPasi stimolata dalla cardiolipina dell'EPSE.

Il confronto dell'attività ATPasica delle stesse proteine senza cardiolipina-stimolazione mostra che questi due residui di lisina non contribuiscono alla bassa attività basale dell'EPSE, ma piuttosto alla capacità della proteina di essere stimolata dalla cardiolipina. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come quantificare in modo rapido e accurato l'attività dell'ATPasi delle proteine purificate. Durante il tentativo di eseguire questa procedura è importante considerare la sensibilità del reagente di rilevamento del fosfato.

Per evitare la contaminazione da fosfati, si consiglia di utilizzare articoli in plastica monouso e acqua ultrapura e di eseguire l'esclusione dimensionale o la cromatografia a scambio ionico dopo la purificazione delle proteine.