Specie determinazione e la quantificazione in miscele Utilizzando MRM Spettrometria di massa dei peptidi applicata per l'autenticazione a base di carne

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare la spettrometria di massa con monitoraggio a reazione multipla per identificare e quantificare le specie presenti nelle miscele di carne cruda da utilizzare come strumento per il rilevamento delle frodi alimentari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'integrità alimentare, come la conferma delle specie presenti in prodotti come salsicce o hamburger. Il nostro approccio si basa sulla spettrometria di massa della componente proteica.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può dare un risultato rapido e quantitativo. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che le proteine conosciute con lo stesso nome e specie diverse sono in realtà abbastanza diverse da fornire l'identificazione della specie, ma abbastanza simili da consentire la quantificazione. Denaturare termicamente le mioglobine di riferimento purificate riscaldando il campione in un blocco caldo a 95 gradi Celsius per 30 minuti.

Raffreddare il campione per circa 15 minuti fino a raggiungere la temperatura ambiente. Quindi aggiungere 30 milligrammi di urea per migliorare la digestione e mescolare. Aggiungere una soluzione di tripsina al campione in un rapporto da uno a 30 tra enzima e substrato in peso.

Quindi mescolare con un leggero vortice e lasciarlo proteolizzare per una notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, desalinizzare il campione post-proteolisi diluendo prima il campione da uno a due volumi con acqua. Attivare una cartuccia polimerica a fase inversa riempita con 30 milligrammi di materiale in fase inversa aggiungendo un millilitro di metanolo.

Quindi equilibrare la cartuccia aggiungendo un millilitro di acido formico all'uno per cento. Caricare il campione sulla cartuccia per gravità. Ora lavare con un millilitro di metanolo al cinque per cento contenente l'uno per cento di acido formico.

Eluire i peptidi con un millilitro di acqua acetonitrilica in provette di microcentrofugo da due millilitri riempite con cinque microlitri di DMSO. Quindi rimuovere il solvente sotto vuoto a 50 gradi Celsius utilizzando un evaporatore centrifugo per 120 minuti. Quindi risciogliere il residuo in 250 microlitri di acqua acetonitrile.

Trasferire la soluzione in una fiala di autocampionatore a basso volume. Individua le sequenze di mioglobina per i diversi incontri nel database UniProt. Inserisci le sequenze di mioglobina nella casella di destinazione del software di previsione dei peptidi e delle transizioni.

Se necessario, passa il mouse su un peptide per visualizzare il suo elenco di frammenti. Dopo aver inserito le preferenze come descritto nel protocollo di testo, fare clic su Esporta e selezionare Elenco transizioni per creare un foglio di calcolo contenente le transizioni e i parametri MRM generati. Impostazione di un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC a gradiente binario con un autocampionatore e una colonna HPLC con guscio centrale C18 collegata a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo operante in modalità elettrospray positivo con rilevamento MRM.

Nella sezione di modifica dei parametri del software di raccolta dati per spettrometria di massa per cromatografia liquida, selezionare il tipo di scansione come MRM e la polarità come positiva. Inserire i valori Q1, Q3, tempo, ID, DP e CE per le transizioni create nel foglio di calcolo e salvare il metodo di acquisizione. Dopo aver impostato i parametri del metodo come descritto nel protocollo di testo, accedere al software di raccolta dati, fare clic su Acquisisci e selezionare Equilibra.

Nella casella che si apre, selezionare il metodo di acquisizione richiesto per iniziare l'equalizzazione dello strumento. Quindi mettere le fiale di campione in un rack nell'autocampionatore. Fare clic su File e selezionare Nuovo, seguito da Batch di acquisizione.

Nel nome del campione inserire l'identità di ciascuno dei campioni da analizzare. Vedere il protocollo di testo per i dettagli su come visualizzare i dati acquisiti. Usa una carne che è stata precedentemente congelata e poi macinata in polvere.

Preparare una gamma di miscele di carne pesando le rispettive quantità di carne in provette da centrifuga di plastica da 15 millilitri. Aggiungere quattro millilitri di tampone di estrazione alla polvere di carne. Dopo aver agitato per 30 secondi, estrarre su un agitatore da laboratorio a temperatura ambiente per due ore a 250 cicli al minuto.

Trasferire due millilitri di estratto in una provetta da microcentrifuga da due millilitri e centrifugare per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 17.000 G.Trasferire 200 microlitri di aliquote di surnatante in provette da centrifuga da due millilitri. Asciugare i campioni utilizzando un evaporatore centrifugo prima di determinare la concentrazione proteica dei campioni come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire la proteolisi delle miscele di carne, risciogliere il residuo essiccato in un millilitro di soluzione di bicarbonato di ammonio 25 millimolare.

Mescolare bene con il vortice ed eseguire la proteosi come prima. Quindi impostare ed eseguire LCMS in modo simile utilizzando Gestione record di messaggistica pianificata. Visualizza il cromatogramma completo nel software di visualizzazione dei dati.

Visualizza a turno gli ioni estratti per ogni set di transizioni. Verificare visivamente che ogni cluster contenga il numero richiesto di picchi a campana al tempo di ritenzione previsto. Confermando così l'esistenza del peptide selezionato.

Quindi, fare doppio clic su Procedura guidata di quantificazione nella barra di navigazione. Nella finestra Seleziona campioni, creare un set di quantificazione selezionando un singolo file di dati. Quindi selezionare uno o più campioni disponibili.

Selezionare Avanti per visualizzare le impostazioni selezionate e la casella di query. Lasciare le impostazioni predefinite e selezionare Avanti per visualizzare Seleziona metodo. Dalla casella a discesa Metodo, seleziona il file del metodo di integrazione, infine seleziona Fine.

Salva la tabella dei risultati, esportala come file di testo e aprila in un foglio di calcolo per rivedere i dati come descritto nel protocollo di testo. Questa figura mostra le transizioni MRM più intense per il cavallo ottenute da una miscela dell'uno per cento in peso per peso con carne bovina. Al contrario, la linea rossa mostra la transizione dalla carne bovina quando non è presente alcun cavallo.

Questo è un grafico della quantità misurata rispetto a quella preparata di cavallo nella carne bovina espressa come rapporti. Il grafico mostra chiaramente come il metodo possa essere utilizzato per effettuare misurazioni quantitative. Una volta padroneggiato e quando si utilizza l'elaborazione in batch, la produttività con questo metodo può raggiungere fino a 20 campioni ogni 24 ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare una proteina adatta per l'analisi dell'estrazione. La mioglobina è un buon candidato per esaminare le specie di carne rossa perché è abbondante, solubile in acqua e stabile al calore. Questa procedura può essere estesa ad altre specie da identificare e quantificare contemporaneamente.

Il numero massimo è limitato solo dalla velocità di scansione della spettrometria di massa. Questa tecnica sta aprendo la strada ai ricercatori per l'utilizzo del pepto fingerprinting in aree come la protezione dei consumatori e del marchio.