Name: Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Impara la tecnica SISCAPA per la quantificazione di peptidi mediante arricchimento immunoaffinità e spettrometria di massa. Questo metodo automatizzato con particelle magnetiche offre elevata efficienza e multiplexing per la ricerca biologica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato finanziato dalla Clinica Tecnologia NSC proteomica Assessment Center (CPTAC) concedere (# U24 CA126476), così come una sovvenzione da parte dell&#39;industria dell&#39;intrattenimento Foundation (FEI) e la ricerca delle donne FEI Fondo cancro al Consorzio seno Discovery Cancro biomarcatori, e generosi doni dal Keck Foundation, la Fondazione Canarie, e il Paul G. Allen Family Foundation.

Procedura sperimentale: Il test richiede peptidi sintetici e di anticorpi anti-peptide. Peptidi selezionato dovrebbe essere univoco per la proteina di interesse, contengono tra 8 e 22 amminoacidi, e non hanno conosciuto modificazioni post-traduzionali. Residui di metionina sono generalmente evitate ed i peptidi contenenti dibasico aminoacidi (es. KK, KR, RR) sono indesiderabili. Per questa tecnica, è comune utilizzare peptidi isotopo stabile etichettati come standard interni, incorporando pesante (13 C e 15 N) etichettati aminoacidi al C-terminale del peptide (cioè K o R etichettati). Il protocollo che segue descrive un test sviluppato per misurare il peptide GDSLAYGLR dal osteopontina proteina del mouse, utilizzando anticorpi anti-peptide ottenuto da Epitomics Inc. (Burlingame, CA) e peptidi sintetici dal New England Peptide (Gardner, MA). Il protocollo si compone di tre fasi principali (Figura 1): 1) la digestione della tripsina della miscela proteica complessa, 2) Arricchimento dei peptidi 3) Analisi mediante spettrometria di massa. Sarà dimostrato su un campione di plasma umano a spillo con la proteina osteopontina mouse. 1. Tripsina digestione enzimatica e pulizia <ol><li> Scongelare aliquota 10 microlitri plasma pulito in ghiaccio umido. </li><li> Determinare la concentrazione totale delle proteine ​​con il saggio BCA e centrifugare il campione per rimuovere eventuali particelle solide in sospensione. </li><li> Pipettare un'aliquota 10 microlitri dal suo tubo di stoccaggio a un piatto di 1000 ml Deepwell e coprire con pellicola in grado di perforare-. </li><li> Aggiungere 20 ml di 9M fresca urea / 30mm ditiotreitolo (DTT) (finale 6M concentrazione di urea / 20 mM DTT) per ogni campione. </li><li> Incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 3 ml di fresca 500 Iodoacetamide mM (finale IAM 50mm) per ogni campione. </li><li> Incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 257 ml di 100 mM Tris (pH 8) (urea diluisce a ~ 0.6M). </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione madre tripsina (1 mg / mL; per 1:50 enzima: rapporto di substrato). </li><li> Incubare a 37 ° C durante la notte (12-16 ore). </li><li> Aggiungere 3 ml di acido formico pulito (concentrazione finale di 1%). </li><li> Aggiungi standard di isotopi stabili (standard vengono aggiunti se si esegue un test multiplex, di solito si tratta di 10 L contenente 50-100 fmol di standard peptide isotopi marcati). </li><li> Lavare la piastra cartuccia Oasis bene con 500 microlitri di 0.1% di acido formico in 80% acetonitrile, scartando la flow-through. Ripetere questa operazione 3 volte. </li><li> Equilibrare la piastra della cartuccia con l'aggiunta di 500 microlitri di 0.1% di acido formico in acqua, ed eliminare la flow-through. Ripetere questa operazione 4 volte. </li><li> Carico campioni digerire alla piastra della cartuccia e regolare il vuoto in modo che il flusso è molto lento. </li><li> Lavare con 500 microlitri di 0.1% di acido formico in acqua, ed eliminare flow-through. Ripetere questa operazione 3 volte. </li><li> Peptidi eluire con l'aggiunta di 2 x 500 microlitri di 0.1% di acido formico in 80% acetonitrile in 1000 ml profondi pozzetti (non scartare la flow-through). </li><li> Liofilizzare (o speedvac) l'eluato a secchezza. (Liofilizzazione è il metodo preferito) </li><li> Ricostituire secca peptidi aggiungendo 50 microlitri di PBS + 0,03% CHAPS. </li></ol> 2. Peptide immunoaffinità arricchimento <ol><li> Trasferire il campione standard di Kingfisher Piastre a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 1 anticorpi mg e 1,5 microlitri proteina-G perle rivestito magnetiche per bersaglio (è facoltativo crosslink l'anticorpo ai talloni prima dell'aggiunta). Garantire perle sono ben sospesa agitazione o vortex. </li><li> Coprire la piastra con un foglio. </li><li> Incubare per una notte (12-16 ore) con dolci cadendo per assicurare perle sono sospesi. </li><li> Centrifugare piastra a 32 xg per 5 secondi per rimuovere il liquido dalla superficie del foglio. </li><li> Togliere il coperchio di alluminio. </li><li> Lavaggio e l'eluizione delle perline può essere eseguita manualmente o in modo automatico. Questa procedura descrive le operazioni automatizzate su una piattaforma Kingfisher. </li><li> Lavare le perle 2 volte con 200 ul PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto a lavaggio). </li><li> Lavare le perle 1 volta con 200 microlitri diluizione 1:10 di PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto). </li><li> I peptidi sono eluiti in 25 uL del 5% di acido acetico + 0,03% CHAPS. </li><li> Posizionare la piastra eluizione su un magnete e trasferire l'eluato sino ad una piastra da 96 pozzetti, facendo attenzione a non trasferire le perline avanzi. </li><li> Coprire la piastra con un tappeto di tenuta. </li><li> La piastra contenente l'eluato viene consegnato allo spettrometro di massa a triplo quadrapole per l'analisi. </li></ol> 3. Analisi per il monitoraggio di reazione multipla - spettrometria di massa <ol><li> Transizioni per SRM / MRM analisi possono essere selezionati e ottimizzati infondendo un 1 picomole soluzione per microlitro di peptide standard nel 30% di acido formico acetonitrile/0.1% nello spettrometro di massa a 0,5 microlitri / min. Una volta a spruzzo sia stabile, raccogliere un MS / MS dello spettro. </li><li> Le transizioni sono selezionati dalla MS / MS dello spettro, individuando three gli ioni frammento abbondante in una regione dello spettro con poco rumore. Per moltiplicare carica ioni peptide, la y-ion frammenti rilevati a m / z&gt; precursore m / z sono di solito i migliori per SRM / MRM sviluppo di analisi. Figura 2 mostra la MS / MS dello spettro e ioni di transizione selezionata 476,3&gt; 508,3, 579,3 , 692,4 (transizioni per il pesante isotopo stabile non standard di 481,3&gt; 518,3, 589,3, 702,4 indicato) per il GDSLAYGLR peptide. </li><li> A seconda della marca e del modello dello spettrometro di massa utilizzato, ci sono più parametri che possono essere ottimizzate per ogni transizione. Qui, abbiamo ottimizzato l'energia di collisione di ogni transizione selezionata dalla rampa l'energia di collisione e il monitoraggio del livello di segnale. Una energia di collisione di 25 è stato utilizzato per ogni transizione. </li><li> In breve, una configurazione tipica per SRM / MRM analisi è la seguente: Fase mobile (A) 0,1% acido formico; (B) Acetonitrile 90% / 0,1% di acido formico, 0,3 x 5 millimetri colonna trappola C18, 75 ID micron x 15 cm C18 colonna analitica (Reprosil-Pur C18 AQ, 120 A poro °). Il volume di iniezione è 10 L e il campione viene caricato per 5 minuti a 3% B ad un flusso totale 3 ml / min ed eluita con un gradiente lineare 3-45% B a 300 - 400 Nl / min a 10 min. Condizioni su QTRAP 4000 (ABSCIEX, Foster City, CA) sono stati spruzzo 2.3kV tensione, temperatura della sorgente di ioni a 150 ° C, GS1 di 12, e di gas tenda 15. </li><li> Il campione viene analizzato da SRM / MRM iniettando 10 ml di campione. Aree dei picchi sono integrati per peptidi leggeri e pesanti usando il programma di Skyline. 14 Calcolare il rapporto tra area del picco (PAR) del peptide senza etichetta / etichetta in ogni campione utilizzando la transizione più abbondante che è privo di rumore di fondo, in questo caso, la transizione y5 (luce peptide 476,3&gt; 579,3, pesante standard di peptide 481,3&gt; 589,3). </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Misurati i rapporti delle aree dei picchi (relativamente leggero peptide endogeno di spillo peptidi marcati con isotopi pesanti) forniscono una misura quantitativa del peptide di destinazione. Figura 3 mostra un esempio di cromatogramma peptidi leggeri e pesanti in un SISCAPA arricchito campione. Si noti che i peptidi leggeri e pesanti eluire allo stesso tempo, e le transizioni multiple possono essere monitorati per ogni peptide per confermare l'identità. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Una visione schematica del processo di SISCAPA. Una miscela proteica complessa viene digerito in peptidi. Analiti peptide mirati (analita endogeno e un isotopo stabile a spillo marcati con standard interno) sono arricchiti con anticorpi anti-peptide immobilizzato sulla proteina G particelle magnetiche rivestite. Dopo aver isolato, i peptidi mirate sono eluiti dalle particelle magnetiche e analizzati mediante spettrometria di massa per la quantificazione relativa allo standard interno. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. MS / MS spettro della GDSLAYGLR peptide che mostra la selezione di tre frammenti di SRM / MRM transizioni. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Cromatogrammi Esempio di profilo di un picco analita peptide luce (rosso) e la pesante isotopo stabile marcati con standard interno (blu). Cromatogrammi per la transizione Y5 dal peptide luce (476,3&gt; 579,3) e pesante isotopo stabile etichetta standard (481,3&gt; 589,3) vengono riportati nel corso del tempo come eluire dal sistema di cromatografia.

<ol><li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li>
<li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+%28SISCAPA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li>
<li>Chace, D. H., Kalas, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+perspective+on+the+use+of+tandem+mass+spectrometry+for+newborn+screening+and+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing.</a> Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).</li>
<li>Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+role+of+mass+spectrometry+in+metabolite+profiling+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization.</a> Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).</li>
<li>Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution--mass+spectrometric+quantification+of+specific+proteins%3A+model+application+with+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.</a> Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).</li>
<li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).</li>
<li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+C-reactive+protein+in+the+serum+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+using+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+and+13C-labeled+peptide+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.</a> Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).</li>
<li>Whiteaker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+enrichment+of+peptides+on+magnetic+beads+for+mass-spectrometry-based+quantification+of+serum+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.</a> Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+thyroglobulin%2C+a+low-abundance+serum+protein%2C+by+immunoaffinity+peptide+enrichment+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry.</a> Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).</li>
<li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Multiplexed+Assays+for+Troponin+I+and+Interleukin-33+in+Plasma+by+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+and+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry.</a> Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).</li>
<li>Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+and+multiplexed+method+for+high+throughput+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry-based+quantification+of+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).</li>
<li>Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+high-flow+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+nanoflow+LC-MS%2FMS%3A+assay+development+for+total+salivary+pepsin%2Fpepsinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen.</a> Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).</li>
<li>Ackermann, B. L., Berna, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+immunoaffinity+techniques+with+MS+for+quantitative+analysis+of+low-abundance+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers.</a> Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).</li>
<li>MacLean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li>
<li>Proc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+effects+of+chaotropic+agents%2C+surfactants%2C+and+solvents+on+the+digestion+efficiency+of+human+plasma+proteins+by+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin.</a> J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).</li>
<li>Berna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+immunoaffinity+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+determination+of+a+type+II+collagen+peptide+biomarker+in+rat+urine%3A+Investigation+of+the+impact+of+collision-induced+dissociation+fluctuation+on+peptide+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation.</a> Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La fase più critica nel protocollo come descritto è garantire le perle rimangono ben mescolato durante il periodo di incubazione. Permettere le perline di depositarsi sul fondo del pozzo / flacone si tradurrà in una maggiore variabilità. E &#39;anche importante spin-down qualsiasi liquido che può rimanere sulla parte superiore del pozzo / flacone dopo il periodo di incubazione. Digestione tripsina riproducibile è anche critico. La procedura per la digestione qui descritto è stato utilizzato ampiamente nel nostro laboratorio in collaborazione con SISCAPA, tuttavia, è probabile che i metodi alternativi di digestione potrebbe essere ottimizzata per un dato insieme di proteine ​​obiettivo del 15 eluizione di anticorpi liberi non interferisce con il rilevamento di. peptide, probabilmente perché l&#39;anticorpo è esclusa dalla colonna o eluisce oltre i peptidi, ma l&#39;anticorpo può essere reticolato di perline G della proteina prima di arricchimento affinità in esperimenti di grandi dimensioni o se anticorpi libero diventa un problema. Abbiamo anche ritenuto utile mettere un magnete sotto la piastra campione sul autocampionatore così come la colonna di lavaggio trappola in direzione inversa del flusso (rispetto al carico) per rimuovere eventuali residui di sfere o particelle. Oltre al metodo descritto perla magnetica, la tecnica può anche essere adattato a un formato di colonna (cioè cromatografia di affinità). 12, 16 Una volta che l&#39;utente sta bene con il protocollo generale, la tecnica è anche suscettibile di varie modifiche che migliorano il test complessivo. 11 In primo luogo, è possibile analizzare analiti multipli in un singolo test combinando anticorpi nella fase di arricchimento (cioè multiplexing). Lo spettrometro di massa è in grado di analizzare simultaneamente un gran numero di analiti. In secondo luogo, aumentare il volume del campione originale migliora la sensibilità del test.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> 1000ul piastre pozzo profondo 96-well </td><td> Eppendorf </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> Oasis HLB 1 cc cartuccia piatto, set-pak, 40 mg, 96 pozzetti </td><td> Acque </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> Kingfisher 96 pozzetti </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> Cancella 96 pozzetti, piatto bianco muro </td><td> Bio-Rad </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> Foglio di copertura per 96 pozzetti </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> Axymat tappeto di tenuta per 96 pozzetti </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> X perforare pellicola </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> Kingfisher processore perla magnetica con testa magnete PCR </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> HSP 9601 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Materiali <table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Urea </td><td> Sigma Aldrich </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma di base </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td> Perforare </td><td> 20291 </td><td> &quot;Senza peso ditiotreitolo&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina Oro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> Proteina G perline magnetiche, 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 28300 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido formico </td><td> EMD </td><td> 11670 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> A998-1 </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2: Reagenti <table border="1"><tbody><tr><th> Soluzione </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 100 mM Tris pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) </td><td> deve essere preparata fresca ogni volta </td></tr><tr><td> IAM 500 mM a 100 mM Tris (pH 8) </td><td> deve essere preparata fresca ogni volta </td></tr><tr><td> Tripsina 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina inibitore 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> Isotopo stabile di serie Mastermix </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-peptide Mastermix </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3: Soluzioni da preparare

quantificazione delle proteine ​​utilizzando arricchimento peptide immunoaffinità accoppiato con spettrometria di massa

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

C&#39;è un grande bisogno di analisi quantitative per la misurazione delle proteine. Immunodosaggi panino tradizionale, in gran parte considerato il gold standard nella quantificazione, sono associati ad un alto costo, tempi lunghi, e sono piene di inconvenienti (ad esempio gli anticorpi eterofili, le interferenze di autoanticorpi, &#39;gancio-effetto&#39;) 1. Una tecnica alternativa è l&#39;arricchimento affinità di peptidi accoppiata con spettrometria di massa quantitativa, comunemente indicata come SISCAPA (norme isotopo stabile e Capture da anticorpi anti-peptide). 2 In questa tecnica, l&#39;arricchimento affinità di peptidi con la diluizione degli isotopi stabili e il rilevamento da parte selezionato / spettrometria di massa di reazione più di monitoraggio ( SRM / MRM-MS) fornisce la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. SRM / MRM-MS è ben definito per la quantificazione accurata di piccole molecole 3, 4 e più recentemente è stato adattato per misurare le concentrazioni di proteine ​​nel plasma e lisati cellulari. 5-7 Per ottenere la quantificazione delle proteine, le molecole più grandi sono digeriti a peptidi componente utilizzando un enzima come la tripsina. Uno o più peptidi selezionati la cui sequenza è unica per la proteina bersaglio in questa specie (cioè &quot;proteotypic&quot; peptidi) vengono poi arricchite dal campione utilizzando anticorpi anti-peptide e misurato come surrogati stechiometrico quantitativa per la concentrazione di proteine ​​nel campione. Quindi, insieme alla diluizione degli isotopi stabili (SID) metodi (cioè un spillo in isotopi stabili etichettati peptide standard), SRM / MRM può essere usato per misurare le concentrazioni di peptidi proteotypic come surrogati per la quantificazione delle proteine ​​in matrici biologiche complesse. I saggi hanno diversi vantaggi rispetto ai tradizionali saggi immunologici. I reagenti sono relativamente meno costosi da produrre, la specificità per l&#39;analita è eccellente, il test può essere altamente multiplex, l&#39;arricchimento può essere effettuato dal plasma pulito (senza esaurimento richiesto), e la tecnica è suscettibile di una vasta gamma di proteine ​​o modifiche di interesse. 8-13 In questo video si dimostra il protocollo di base adattata ad una piattaforma magnetica tallone.

Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Esiste un forte bisogno di saggi quantitativi per la misurazione delle proteine. I tradizionali immunosaggi a sandwich, ampiamente considerati il gold standard in...

L'obiettivo generale della seguente procedura è isolare e quantificare peptidi in una miscela complessa che fungono da surrogati per le rispettive proteine. Innanzitutto, le proteine grandi presenti nella miscela vengono digerite in peptidi componenti mediante un enzima come la tripsina. Successivamente, gli analiti peptidici mirati e uno standard interno marcato con isotopo stabile aggiunto vengono arricchiti utilizzando anticorpi anti-peptide, immobilizzati su particelle magnetiche codificate con proteina G dopo l'isolamento.I peptidi bersaglio vengono eluiti dalle particelle magnetiche e analizzati mediante spettrometria di massa per la quantificazione rispetto allo standard interno. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i tradizionali saggio immunoistochimici, sono la maggiore velocità e convenienza economica nella creazione di un elevato numero di saggi. La tecnica presenta un alto tasso di successo ed è facilmente multiplexabile, come verrà illustrato nella procedura.Un tecnico in laboratorio ha un campione di 10 microlitri di plasma Eloqua su ghiaccio bagnato. Trasferire il campione in una piastra a pozzetti profondi da 1000 microlitri e coprire con pellicola paraffinata per denaturare le proteine aggiungendo 20 microlitri di urea fresca 9 M e 30 millimolari di DTT a ciascun campione, quindi incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere tre microlitri di iodoacetamide fresca 500 millimolare a ciascun campione e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Diluire ora l'urea a 0,6 M con tris 100 millimolare a pH 8 e aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre di tripsina da un microgrammo per microlitro, per ottenere un rapporto enzima:substrato di 1:50.Dopo aver incubato la reazione a 37 gradi Celsius durante la notte, aggiungere tre microlitri di acido formico puro per ottenere una concentrazione finale dell'1%, quindi continuare aggiungendo lo standard isotopico stabile o multipli standard. Se si esegue un saggio multiplex, lavare attentamente la piastra con cartucce Oasis con 500 microlitri di acido formico 0,1% in acetonitrile all'80%, scartando il flusso iniziale. Successivamente, equilibrare la piastra con cartuccia aggiungendo 500 microlitri di acido formico 0,1% in acqua e scartando il flusso iniziale.Caricare i campioni digeriti sulla piastra della cartuccia e regolare il vuoto in modo che il flusso sia molto lento. Lavare tre volte con 500 microlitri di acido formico 0,1% in acqua e scartare il flusso iniziale. Eluire i peptidi due volte con 500 microlitri di acido formico 0,1% in acetonitrile 80%, quindi liofilizzare o evaporare a secco l’eluito e ricostituire i peptidi secchi in 50 microlitri di PBS contenente 0,03% Chaps. Trasferire i campioni in una piastra standard Kingfisher a 96 pozzetti, aggiungere un microgrammo di anticorpo e 1,5 microlitri di microsferette magnetiche codificate con proteina G per ogni bersaglio. Vortexare le microsferette prima dell’aggiunta.Per garantire che le perle siano ben sospese, coprire la piastra con della stagnola e incubare tutta la notte con agitazione lenta su un centrifugo rotante. Centrifugare la piastra a 400 giri/min per 10 secondi per rimuovere qualsiasi liquido dalla superficie della stagnola.Rimuovere il coperchio in foglio di alluminio. La manipolazione del campione avviene su una piattaforma automatizzata Kingfisher. Lavare le perle due volte con 200 microlitri di PBS più 0,03% CHAPS e una volta con 200 microlitri di una diluizione 1:10 di PBS più 0,03% CHAPS, quindi eluire i peptidi con 25 microlitri di acido acetico al 5% più 0,03% CHAPS.Posizionare la piastra di eluizione su un magnete e trasferire l'eluato in una piastra a 96 pozzetti, avendo cura di non trasferire le perle rimaste. Coprire la piastra con la matrice superiore e consegnare questa piastra contenente l'eluato al triplo o quadruplo spettrometro di massa per l'analisi. Il metodo MRM viene costruito ottenendo uno spettro di massa in tandem del peptide di interesse, quindi selezionando e ottimizzando i migliori ioni frammento di transizione.Tipicamente, una configurazione per l'analisi MRM utilizza una colonna di trattenuta C 18 e colonne analitiche con due fasi mobili. Caricare 10 microlitri del campione ed eluire mediante un gradiente lineare. Integrare le aree dei picchi per i peptidi leggeri e pesanti e calcolare il rapporto tra le aree dei picchi del peptide non marcato e di quello marcato in ciascun campione.I peptidi leggeri e pesanti eluiscono contemporaneamente e possono essere monitorate più transizioni per ciascun peptide. Per confermare l'identità, l'area del picco del peptide endogeno viene misurata in rapporto all'area dello standard interno per fornire una misura quantitativa del peptide bersaglio. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come implementare questa tecnica nel vostro laboratorio. Può essere utilizzata per quantificare qualsiasi proteina di interesse, risultando così adatta a un'ampia gamma di applicazioni nella ricerca biologica.

quantification-proteins-using-peptide-immunoaffinity-enrichment

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il...

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

In questo video, dimostriamo l'immunoprecipitazione dei fosfopeptidi basata su anticorpi da una miscela di peptidi. I fosfopeptidi arricchiti sono concentrati sotto vuoto e conservati per l'analisi a valle.

Arricchimento di fosfopeptidi: una tecnica di immunoprecipitazione basata su anticorpi per separare specifici peptidi fosforilati da miscele di peptidi complessi

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Questo protocollo descrive come eseguire saggi di quantificazione assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi utilizzando il monitoraggio di reazioni selezionate. È stato utilizzato per quantificare con precisione le proteine della via di segnalazione della chemiotassi dei macrofagi di topo. La selezione dei peptidi target, lo sviluppo del saggio e i saggi qualitativi e quantitativi sono descritti in dettaglio.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Questo protocollo descrive una procedura per estrarre e arricchire fosfopeptidi da linee cellulari di carcinoma della prostata o tessuti per un'analisi della phosphoproteome via basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Impara la tecnica SISCAPA per la quantificazione di peptidi mediante arricchimento immunoaffinità e spettrometria di massa. Questo metodo automatizzato con particelle magnetiche offre elevata efficienza e multiplexing per la ricerca biologica.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Esplora altri video

Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa