Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

L'obiettivo generale della seguente procedura è isolare e quantificare i peptidi in una miscela complessa che fungono da surrogati per le rispettive proteine. In primo luogo, le grandi proteine all'interno della miscela vengono digerite in peptidi componenti utilizzando un enzima come la tripsina. Quindi gli analiti peptidici mirati e uno standard interno marcato con isotopi stabili spiked vengono arricchiti utilizzando anticorpi antip peptidici, immobilizzati su particelle magnetiche codificate con proteina G dopo l'isolamento.

I peptidi bersaglio vengono allusi dalle particelle magnetiche e analizzati mediante spettrometria di massa per la quantificazione rispetto allo standard interno. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i test immunologici tradizionali sono che è più veloce ed economica nella creazione di un gran numero di saggi. Ha un alto tasso di successo ed è facilmente multiplexato dimostrando che la procedura sarà descritta.

Un tecnico in laboratorio Haw un plasma Eloqua da 10 microlitri su ghiaccio bagnato. Trasferire il campione in una piastra a pozzetti profonda 1000 microlitri e coprire con pellicola parabolica per denaturare le proteine a 20 microlitri di urea fresca a nove molari 30 millimolari DTT per ciascun campione e incubare per 30 minuti A 37 gradi Celsius, aggiungere tre microlitri di Ito acetammide fresco da 500 millimolari a ciascun campione e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Ora diluire l'urea a 0,6 molari con 100 millimolari tris pH 8 e aggiungere 10 microlitri di un microgrammo per microlitro e una soluzione madre per un rapporto enzima / substrato da uno a 50.

Dopo aver incubato la reazione a 37 gradi Celsius durante la notte a tre microlitri di acido formico puro a una concentrazione finale dell'1%, continuare ad aggiungere lo standard dell'isotopo stabile o più standard. Se si esegue un test multiplex, lavare bene la piastra della cartuccia Oasis con 500 microlitri di acido formico allo 0,1% in nitrile ACE all'80%, scartando il flusso. Quindi equilibrare la piastra della cartuccia aggiungendo 500 microlitri di acido formico allo 0,1% in acqua e scartare il flusso attraverso.

Caricare i campioni di digestato sulla piastra della cartuccia e regolare il vuoto in modo che il flusso sia molto lento. Lavare tre volte con 500 microlitri di acido formico allo 0,1% in acqua e scartare il flusso attraverso, eluire i peptidi due volte con 500 microlitri di acido formico allo 0,1% in prova all'80%, quindi liofilizzare o accelerare il ritorno dell'eluato alla secchezza e ricostituire i peptidi essiccati in 50 microlitri di PBS più 0,03%Chaps, trasferire i campioni in una piastra standard Kingfisher a 96 pozzetti, aggiungere un microgrammo di anticorpo e 1,5 microlitri di proteina G Sfere magnetiche codificate per bersaglio. Agitare le perline prima dell'aggiunta.

Per garantire che le perline siano ben sospese. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare per una notte con una centrifuga delicata. La piastra a 400 giri/min per 10 secondi per rimuovere qualsiasi liquido dalla superficie della pellicola.

Rimuovere il coperchio di alluminio. La manipolazione del campione avviene su una piattaforma automatizzata di martin pescatore sulla piattaforma di martin pescatore. Lavare le perle due volte con 200 microlitri di PBS più lo 0,03% di screpolature e una volta con 200 microlitri di una diluizione da uno a 10 di PBS più lo 0,03%Le screpolature ora eludono i peptidi con 25 microlitri di acido acetico al 5% più 0,03% di zuccheri.

Posizionare la piastra di eluizione su un magnete e trasferire l'eluato su una piastra a 96 pozzetti, facendo attenzione a non trasferire le perle rimanenti. Coprire la piastra con il tappetino da soffitto, consegnare questa piastra contenente l'eluato allo spettrometro di massa triplo e quadruplo per l'analisi. Il metodo MRM è costruito ottenendo uno spettro di massa tandem del peptide di interesse piuttosto che scegliendo e ottimizzando i migliori ioni frammento di transizione.

In genere, una configurazione per l'analisi MRM utilizza una trappola C 18 e colonne analitiche con due fasi mobili. Caricare 10 microlitri di campione ed eluire con un gradiente lineare. Integrare le aree di picco per i peptidi leggeri e pesanti e calcolare il rapporto tra area di picco tra peptide non marcato e marcato in ciascun campione.

I peptidi leggeri e pesanti eluiscono contemporaneamente e per ciascun peptide possono essere monitorate transizioni multiple Per confermare l'identità, l'area del picco del peptide endogeno viene misurata rispetto all'area dello standard interno per fornire una misura quantitativa del peptide target. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare questa tecnica nel tuo laboratorio. Può essere utilizzato per quantificare qualsiasi proteina di interesse, rendendola adatta a un'ampia gamma di applicazioni nella ricerca biologica.