L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare le proteine leganti piccole molecole utilizzando una sonda di fotoaffinità, in grado di legarsi al suo bersaglio in cellule vive, consentendo il successivo isolamento e identificazione del bersaglio. Questo metodo può essere utilizzato per chiarire il meccanismo molecolare d'azione di farmaci o altre piccole molecole. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare nativo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

Iniziare questa procedura, preparando piastre sterili per colture cellulari di sei centimetri, per il numero di campioni desiderato. In genere, viene utilizzato un piatto di cellule per ogni condizione di trattamento. Per questa dimostrazione verranno preparate tre piastre di cellule e il controllo negativo con solo DMSO, etichettato D, solo trattamento con sonda, etichettato P e sonda più concorrente, etichettato C.To ciascuna piastra di coltura, aggiungerà 3,5 milioni di cellule T HEK 293 in quattro millilitri di terreno di coltura.

Incubare le cellule durante la notte. Prima di trattare le cellule, pre-aliquotare i farmaci necessari in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per il pretrattamento della concorrenza, aggiungere quattro microlitri di DMSO a ciascuna delle due provette e quattro microlitri di concorrente da 10 millimolari a una provetta.

Per il trattamento con sonda, aggiungere 16 microlitri di DMSO a una provetta e 16 microlitri di sonda di fotoaffinità micromolare a ciascuna delle due provette. Portare i piatti di coltura cellulare nella cappa di coltura cellulare per l'aggiunta dei farmaci pre-aliquotati. Aspirare un millilitro di terreno di coltura dalla capsula di trattamento della competizione, trasferirlo nella provetta da microcentrifuga che contiene il concorrente pre-aliquotato e risospendere il farmaco nel terreno.

Aggiungere delicatamente il terreno e la miscela di farmaci nel piatto a goccia. Allo stesso modo, aggiungere DMSO sia al piatto di controllo negativo che al piatto della sonda. Rimetti i piatti nell'incubatrice per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, riporta i piatti nella cappa di coltura e abbassa le luci. Aggiungere il DMSO pre-aliquotato alla capsula di controllo negativo e la sonda alla sonda e alle parabole della competizione. Rimetti i piatti nell'incubatrice per un'ora.

Dopo un'ora, mettere i piatti sul ghiaccio. Lavare delicatamente le cellule in ogni piatto con cinque millilitri di PBS ghiacciato per rimuovere la sonda in eccesso. Coprire nuovamente le cellule con quattro millilitri di PBS ghiacciato.

Posiziona un piatto di cellule, centrato tre centimetri sotto la lampada UV sopra un impacco di ghiaccio, per ridurre al minimo il riscaldamento della lampada, e irradia per tre minuti. Togliete il piatto e mettetelo sul ghiaccio. In questo modo, irradiare tutti i campioni.

Dopo l'irradiazione di tutti i campioni, aspirare il PBS dalle cellule e aggiungere 200 microlitri di PBS ghiacciato con inibitori della proteasi a ciascun piatto. Staccare le cellule dalla capsula utilizzando un raschietto di gomma e trasferirle in provette da microcentrifuga pre-marcate su ghiaccio. Aggiungere SDS a ciascun campione fino a una concentrazione finale dello 0,4%Lisi le cellule sonicando la sospensione per 10 impulsi, incubando su ghiaccio per un minuto e quindi sonicando per altri 10 impulsi.

Far bollire i campioni su un blocco termico impostato a 95 gradi Celsius per cinque minuti per completare la lisi cellulare e denaturare tutte le proteine. Dopo aver misurato la concentrazione proteica in ciascun campione, come descritto nel protocollo di testo, normalizzare la concentrazione proteica a 2,5 milligrammi per millilitro, aggiungendo PBS PH 8,5 più 0,4% SDS secondo necessità. Per iniziare questa procedura, trasferire 40 microlitri di ciascun lisato cellulare, preparato nel segmento precedente in una nuova provetta da microcentrifuga.

Aggiungere i seguenti reagenti in questo ordine, 0,2 microlitri di farina-azide, 0,58 microlitri di TCEP e 3,38 microlitri di TBTA. Vortice per mescolare. Aggiungere 1,14 microlitri di solfato di rame pentaidrato per avviare la reazione.

Agitare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Aggiungere 50 microlitri di tampone campione 2X SDS per estinguere la reazione. Eseguire i campioni su un gel SDS-PAGE e, quando il fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel, continuare a far scorrere il gel per altri cinque minuti per assicurarsi che tutta la farina-azide non reagita in eccesso sia completamente uscita dal gel.

Dopo aver lavato via tutto l'eccesso di farina-azide, posizionare il gel su una lastra di vetro e scansionare il gel utilizzando uno scanner per gel fluorescente, secondo le istruzioni del produttore. Per l'applicazione di un tag di biotina, utilizzare la quantità massima di lisati cellulari dopo la normalizzazione delle proteine, in modo tale che tutti i campioni abbiano lo stesso volume. Preclearificare i lisati aggiungendo ogni campione in una nuova provetta, contenente 50 microlitri di perle di streptavidina agarosio ad alta capacità prelavate.

Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione. Pellettare le perle mediante centrifugazione. Rimuovere il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga con ghiaccio e scartare le perle.

Per 500 microlitri di lisato, aggiungere i seguenti reagenti, 1,38 microlitri di biotina-azide, 5,5 microlitri di TCEP e 32,5 microlitri di TBTA. Vortice per mescolare. Aggiungere 11 microlitri di solfato di rame pentaidrato per 500 microlitri di lisato e agitare brevemente.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere quattro volumi di campione di acetone, raffreddato a 20 gradi Celsius, agitare i campioni e incubare per una notte a 80 gradi Celsius, per far precipitare completamente le proteine e rimuovere la biotina-azide non reagita. Il giorno seguente, centrifugare i campioni a 17.000 x g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le proteine precipitate.

Aspirare completamente il surnatante, aggiungere 150 microlitri di PBS PH 7,4 e 1%SDS a ciascun campione e risolubilizzare le proteine mediante sonicazione. Aggiungere 600 microlitri di PBS a ciascun campione, per diluire la concentrazione di SDS allo 0,2%, quindi aggiungere il campione in una nuova provetta contenente 30 microlitri di perle di agarosio di streptavidina ad alta capacità prelavate. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione.

Dopo un'ora, pellettare le perle mediante centrifugazione a 1000 x g per tre minuti. Aspirare ed eliminare il surnatante, contenente proteine non legate. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio alle perle e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente con rotazione.

Centrifugare, scartare il surnatante e lavare nuovamente con il tampone di lavaggio. Dopo il lavaggio finale, aspirare completamente il tampone di lavaggio dalle perle e aggiungere 30 microlitri di tampone per campioni 2X SDS. Incubare per cinque minuti in un blocco termico a 95 gradi Celsius, per rilasciare le proteine dalle perline.

Centrifugare le perle a 13000 x g a temperatura ambiente per un minuto. Pipettare con cura il tampone del campione, contenente le proteine delle microsfere, per SDS-PAGE. La visualizzazione delle proteine dopo l'etichettatura con il tag fluorescente, è illustrata da questo gel scansionato fluorescente.

La banda principale delle proteine leganti specifiche, a circa 35 kilodalton, è presente solo nella corsia della sonda ed è contesa dal composto progenitore in eccesso. La stessa banda di 35 kilodalton è stata visualizzata mediante colorazione con argento dopo pulldown della biotina e successivamente identificata mediante spettrometria di massa come proteina di membrana VDAC1. L'identità della proteina è stata ulteriormente convalidata, utilizzando un anticorpo specifico per VDAC1.

Il segnale è presente nella corsia della sonda e diminuito nella corsia di gara. Includendo la frazione di input, si garantisce che l'anticorpo funzioni e che la proteina di interesse possa essere rilevata nel lisato. Il leggero aumento del peso molecolare dei campioni di pulldown, è dovuto alla sonda covelantamente attaccata.

Vengono illustrate le conseguenze di una non corretta esecuzione di alcuni passaggi del protocollo. La rimozione incompleta dell'eccesso di farina-azide provoca grandi macchie nere sul fondo del gel scansionato fluorescente, mentre un'insufficiente prepurificazione dei lisati e/o il lavaggio delle perle, si traduce in un gel colorato d'argento con colorazione di fondo molto elevata. Dall'inizio alla fine, l'esperimento di pulldown richiede da due a tre giorni per essere completato.

Dopo che la proteina bersaglio è stata isolata e identificata mediante spettrometria di massa o western blotting, dovrebbero essere eseguiti ulteriori esperimenti di validazione specifici per valutare la rilevanza del bersaglio per il fenotipo indotto dal farmaco.