Name: Lidentificazione di piccole proteine che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri l'identificazione di proteine leganti piccole molecole tramite fotoaffinità in cellule HEK 293 T vive. Questo metodo preserva l'ambiente cellulare nativo per studiare i meccanismi d'azione dei farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Dr. Ben Nacev per i consigli sulla progettazione del protocollo di marcatura della fotoaffinità, il Dr. Wei Shi per aver sintetizzato la sonda di fotoaffinità itraconazolo, il Dr. Yongjun Dang per i consigli sugli esperimenti di pull-down dell'affinità e gli altri membri del laboratorio J.O.L. per gli utili commenti e il supporto. Questo lavoro è stato in parte supportato da una PhRMA Foundation Fellowship in Farmacologia/Tossicologia (a S.A.H.); Sovvenzione del National Cancer Institute R01CA184103; l'Istituto di Ricerca Medica per Assistenti di Volo; Fondazione per il cancro alla prostata (J.O.L.); e il Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, finanziato in parte dalla sovvenzione UL1 TR 001079 dal National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).

NOTA: Questo protocollo è stato adattato da MacKinnon e Taunton 10 per l&#39;utilizzo in cellule vive. 1. Preparazione di cellule in coltura <ol><li> Preparare sterili 6 cm piatti di coltura cellulare per il numero di campioni desiderati (vedi sotto). NOTA: Un piatto di cellule viene utilizzato per il trattamento condizione, ma se è necessario più proteine ​​2 o 3 piatti possono essere preparati per ogni condizione e combinati, dopo irradiazione UV. <ol><li> Preparare almeno 3 piatti di cellule; controllo negativo con DMSO solo (D), unico trattamento Probe (P), e sonda + concorrente (C). </li><li> Facoltativamente, preparare un 4 ° piatto come controllo non UV, da trattare con sonda ma non sottoposto a luce UV. NOTA: Se più molecole concorrenti devono essere testati, quali differenti analoghi della piccola molecola di interesse, preparare piastre concorrenti aggiuntivi come necessario. </li></ol></li><li> Aggiungere cellule HEK293T a piatti della cultura in 4 terreni di coltura ml. Utilizzare 3,5 milioni di cells per piastra. NOTA: Il numero di celle deve essere determinato per ciascun tipo di cellula in modo che le cellule sono quasi il 100% confluenti all&#39;inizio dell&#39;esperimento, al fine di ottenere la massima resa di proteine. Per HUVEC, utilizzare 0,3 milioni di cellule per piastra. Una buona approssimazione è 1/10 delle cellule in un piatto cm confluenti 15. HEK293T cellule devono essere coltivate in Dulbecco Modified Eagles medio supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina. </li><li> Ritorna le cellule alla cultura incubatore (37 ° C, 5% CO 2) durante la notte. </li></ol> 2. Il trattamento di cellule e Photocrosslinking <ol><li> Il giorno successivo, pre-aliquota dei seguenti farmaci in provette da 1,5 ml microcentrifuga: <ol><li> Per il primo trattamento, aggiungere 4 ml di DMSO a 2 tubi e 4 ml di 10 mM concorrente (cioè, il composto progenitore non modificato) a 1 tubo. </li><li> Per il secondo trattamento, aggiungere 16 ml di DMSO a 1 tubo e 16 ml di 50 &amp;# 181; M sonda photoaffinity a 2 tubi. NOTA: La concentrazione ottimale può essere diverso per i diversi sonde (vedi discussione), ma tra 200-500 nm è un buon punto di partenza (qui usiamo 200 nm). La concentrazione di concorrente dovrebbe superare quella della sonda almeno 20 volte (qui usiamo 10 pM). La concentrazione finale di DMSO dovrebbe essere uguale in tutte le piastre e non deve superare lo 0,5% (20 volumi mL). </li></ol></li><li> Portare le piastre delle celle nella cappa di coltura cellulare e aggiungere i farmaci pre-aliquotati dal punto 2.1.1 come segue: Aspirare 1 ml di terreni di coltura, risospendere il farmaco pre-aliquotati nei media, e delicatamente aggiungendo di nuovo al calo piatto saggio. Aggiungere il DMSO alla (D) piastra e la piastra sonda (P) DMSO, e aggiungere il concorrente del (C) Piastra concorrenza. Ritorna le piastre alla cultura incubatore per 30 min. </li><li> Con le luci del cofano cultura oscurato, aggiungere la sonda pre-aliquotati dal punto 2.1.2 per sondare (P) e della concorrenza piastre (C) e aggiungere ilDMSO alla piastra DMSO (D), come sopra. Riportare le piastre per l&#39;incubatore di coltura per 1 ora. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare i seguenti elementi; Un vassoio di ghiaccio che può andare bene tutti i piatti; tampone di lisi ghiacciata (PBS [pH 8,5] + inibitore della proteasi 1x cocktail [completa-EDTA libera, diluita dalla soluzione 50x magazzino effettuate in acqua]; 200 l / piastra); provette per microcentrifuga etichettati D, P o C per ciascuna delle diverse condizioni di trattamento, sul ghiaccio. </li><li> 15 min prima della fine dell&#39;incubazione 1 hr, impostare la lampada UV (365 nm) in camera fredda e accenderlo per riscaldare la lampadina. </li><li> Dopo 1 ora di incubazione con la sonda, posizionare piatti sul ghiaccio. Lavare le cellule delicatamente con 5 ml di ghiacciata PBS (pH 7.4) per rimuovere la sonda in eccesso. Ri-coprire le cellule con PBS 4 ml ghiacciata. </li><li> Porre la capsula di cellule centrati 3 cm sotto la lampada UV su di un pacchetto di ghiaccio per minimizzare il riscaldamento dalla lampada. Irradiare per 3 min. Rimuovere il piatto al vassoio di ghiaccio e ripetere per tutti i campioni. </li><li> UNopo irradiazione, aspirare il PBS dalle cellule e aggiungere 200 ml di ghiacciata PBS (pH 8,5) con inibitori della proteasi per ogni piatto. Staccare le cellule dalla piastra con una spatola di gomma e il trasferimento ai tubi microcentrifuga pre-etichettati su ghiaccio. </li><li> Aggiungere SDS a una concentrazione finale di 0,4% (10 ml di 10% SDS in 250 microlitri di campione). ATTENZIONE: SDS polvere è pericolosa. Evitare l&#39;inalazione di polvere SDS indossando una maschera sul naso e la bocca. </li><li> Lyse le cellule sonicating la sospensione per 10 impulsi (uscita 1, duty cycle del 30%) e incubare in ghiaccio per 1 minuto prima di un secondo giro di 10 impulsi. </li><li> Se necessario, rimuovere le 2 ml di sospensione e controllare sotto un microscopio ottico per garantire la completa lisi cellulare. </li><li> Far bollire i campioni su una piastra calda impostata a 95 ° C per 5 minuti per completare la lisi cellulare e denaturate tutte le proteine. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​in ciascun campione usando un saggio proteico detergente compatibile spettrofotometrica, come thtest e Dc proteine ​​19, secondo le istruzioni del produttore, con uno spettrofotometro impostato per misurare l&#39;assorbanza a 750 nm. </li><li> Normalizzare la concentrazione proteica di 2,5 mg / ml (o se le concentrazioni sono inferiori a 2,5 mg / ml, normalizzare il campione con la concentrazione proteica basso) aggiungendo PBS pH 8,5 + 0,4% SDS come necessario (ad esempio, se i campioni sono 5 mg / ml in 250 microlitri, aggiungere 250 microlitri di PBS pH 8,5 + 0,4% SDS per ottenere una concentrazione finale di 2,5 mg / ml). </li></ol> 3. Collegamento di Tag fluorescente da Click Chimica per la visualizzazione delle proteine ​​marcate <ol><li> Rimuovere 40 ml di lisato cellulare e trasferimento in una nuova provetta. Mantenere i restanti lisati per la reazione con biotina-azide (fase 4). </li><li> Aggiungere i seguenti reagenti in ordine: 0,2 ml Fluor-azide (1 mM soluzione madre in DMSO), 0,58 ml TCEP (100 mM magazzino in acqua con 4 equivalenti NaOH aggiunto, preparato fresco), e 3,38 ml TBTA (1.7 mm magazzino in un rapporto 4: 1 di t-butanolo a DMSO). Vortex per miscelare. </li><li> Aggiungere 1,14 ml CuSO 4 -5H 2 O (50 mM in acqua) per attivare la reazione. Vortex brevemente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li><li> Aggiungere 50 ml di tampone campione SDS 2x per placare la reazione. A questo punto, eseguire i campioni direttamente su un gel SDS-PAGE 20 per i migliori risultati, o conservare a -20 ° C per una notte, se necessario. </li><li> Se congelamento campioni, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C prima di caricare sul gel. NOTA: Dato che il peso molecolare della proteina bersaglio è in genere non noto in questa fase, è consigliabile eseguire 2 gel con concentrazioni di acrilamide differenti (cioè, l&#39;8% e il 15%), o un gel gradiente molecolare intervallo di peso ampia (cioè, 4-15%), al fine di garantire una copertura completa del peso molecolare. </li><li> Quando il fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel, continuare a eseguire il gel per altri 5 minuti per assicurare tutto l&#39;eccesso unreacted Fluor-azide ha completamente uscito il gel. </li><li> Rimuovere il gel in un contenitore con DDH 2 O e incubare per 10 minuti con agitazione, per lavare via ogni eccesso Fluor-azide. </li><li> Porre il gel su una lastra di vetro e digitalizzare il gel usando uno scanner gel Typhoon fluorescente secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 4. Fissaggio di biotina Tag da Click Chimica per affinità purificazione di proteine ​​marcate <ol><li> Dei restanti lisati dal punto 3.1, usare la quantità massima dopo la normalizzazione proteine ​​tale che tutti i campioni sono lo stesso volume (per esempio, se dopo la normalizzazione a 2,5 mg / ml i volumi dei campioni risultanti sono 500, 550, e 600 microlitri, utilizzare 500 ml di ciascuno). </li><li> Pre-cancellare i lisati con l&#39;aggiunta di 50 ml ad alta capacità perline streptavidina agarosio, 2x pre-lavate con PBS (pH 7,4). Incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione. </li><li> Agglomerare le perline per centrifugazione a 1.000 xg per 3 min. rimuovere tegli surnatante in una nuova provetta su ghiaccio e gettare le perle. </li><li> Rimuovere 1-2% del campione DMSO in una nuova provetta etichettata &quot;input&quot;. Aggiungere un volume equivalente di tampone campione 2x SDS e conservare a -20 ° C. </li><li> Per 500 ml di lisato, aggiungere i seguenti reagenti: 1.38 ml biotina-azide (10 mM magazzino in DMSO), 5,5 ml TCEP, e 32,5 ml TBTA. Vortex per miscelare. </li><li> Aggiungere 11 ml CuSO 4 -5H 2 O per 500 ml di lisato e vortex brevemente. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 4 volumi di campione di acetone refrigerate a -20 ° C. Vortex i campioni e incubare durante la notte a -80 ° C per precipitare completamente le proteine ​​e rimuovere reagito biotina-azide. </li><li> Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C per sedimentare le proteine ​​precipitate. </li><li> Aspirare il surnatante completamente, e resolubilize le proteine ​​mediante sonicazione in 150 microlitri di PBS (pH 7,4) + 1% SDS. </li><li&gt; Aggiungere 600 ml di PBS (pH 7,4) per diluire la concentrazione di SDS allo 0,2%. </li><li> Aggiungere i campioni da 30 microlitri pre-lavati ad alta capacità streptavidina agarosio e incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione. </li><li> Agglomerare le perline per centrifugazione a 1.000 xg per 3 min. Aspirare il surnatante contenente proteine ​​non legate e degli scarti. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0.2% SDS, pH 7.4) ai talloni e incubare 5 min a temperatura ambiente con rotazione. </li><li> Ripetere i punti 4.12 e 4.13 3 volte. </li><li> Aspirare il tampone di lavaggio completamente dalle perline, e aggiungere 30 ml di tampone campione 2x SDS. </li><li> Incubare per 5 minuti su un blocco C di calore 95 ° per rilasciare le proteine ​​dalle perline. </li><li> Centrifugare le perline per 1 min a 13.000 xg a temperatura ambiente. NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a -20 ° C fino al momento di eseguire SDS-PAGE. Se congelamento campioni, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> AccuratamentePipettare il tampone campione contenente proteine ​​al largo delle perle, e caricare su SDS-PAGE 20 (vedi importanti considerazioni di seguito). Le sfere possono essere salvate per ribollitura seguito, se necessario. NOTA: Per la rivelazione delle proteine ​​mediante macchia d&#39;argento, i risultati migliori si ottengono utilizzando un gel di spessore 1 mm. Se una banda da tagliare su gel d&#39;argento macchiate per analisi spettrometria di massa (MS), preparare tutti i reagenti freschi soluzioni sterili e lasciare un pozzo vuoto tra campioni sul gel. Per ogni fascia tagliata dalla corsia della sonda, una fetta parallelo dovrebbe essere presa dalla corsia DMSO in modo che le proteine ​​di fondo possono essere sottratti. Per la convalida di ID proteine ​​mediante western blot, è fondamentale per caricare anche il campione in ingresso dal punto 4.4 quando si esegue il gel SDS-PAGE. </li><li> Seguire un protocollo standard per entrambi argento colorazione 21 o Western blot 22 per rilevare la proteina bersaglio (s). </li></ol>

<ol><li>Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
<li>Cook, D., Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+a+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Titov, D. V., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+protein+targets+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules.</a> Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Sumranjit, J., Chung, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Target+Characterization+and+Identification+by+Photoaffinity+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes.</a> Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).</li>
<li>Robles, O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-+and+site-selective+derivatizations+of+natural+products+enabling+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies.</a> Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).</li>
<li>Zhou, Q., Gui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+Native+Chemical+Tagging+of+C-H+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds.</a> J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).</li>
<li>Li, Z., Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Synthesis+of+Minimalist+Terminal+Alkyne-Containing+Diazirine+Photo-Crosslinkers+and+Their+Incorporation+into+Kinase+Inhibitors+for+Cell-+and+Tissue-Based+Proteome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling.</a> Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).</li>
<li>Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazo+reagents+with+small+steric+footprints+for+simultaneous+arming%2FSAR+studies+of+alcohol-containing+natural+products+via+O-H+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem+biol%22%5BJournal%5D)">Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion.</a> ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).</li>
<li>Mackinnon, A. L., Taunton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Identification+by+Diazirine+Photo-Cross-linking+and+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).</li>
<li>Smith, E., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+in+target-+and+binding-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Future+med+chem%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification.</a> Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).</li>
<li>Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.3-Dipolare+Cycloadditionen%2C+XXXII.+Kinetik+der+Additionen+organischer+Azide+an+CC-Mehrfachbindungen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ber%22%5BJournal%5D)">1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen.</a> Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+Solid+Phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-Triazoles+by+Regiospecific+Copper%28I%29-Catalyzed+1%2C3-Dipolar+Cycloadditions+of+Terminal+Alkynes+to+Azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Head, S. A., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+itraconazole+targets+VDAC1+to+modulate+the+AMPK%2FmTOR+signaling+axis+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itraconazole+Side+Chain+Analogues%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies+for+Inhibition+of+Endothelial+Cell+Proliferation%2C+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor+2+%28VEGFR2%29+Glycosylation%2C+and+Hedgehog+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling.</a> J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Absolute+Stereochemistry+on+the+Antiangiogenic+and+Antifungal+Activities+of+Itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diversi approcci per identificare gli obiettivi di piccole molecole possono essere sostanzialmente raggruppati in due categorie: top-down, in cui il fenotipo cellulare del farmaco è usato per limitare i suoi potenziali obiettivi in ​​base alle loro funzioni note, o bottom-up, in cui l&#39;obiettivo è identificato direttamente con mezzi chimici o genetici 3. Top-down o studi fenotipici in grado di identificare alcuni processi cellulari colpite dal farmaco (per esempio, la trascrizione / traduzione / s...

piccole molecole bioattive fondamentalmente funzionano interagendo ed alterare la funzione di uno o più molecole &quot;target&quot;, più comunemente proteine, nella cellula. In scoperta di farmaci, quando un composto attivo viene scoperto attraverso lo screening fenotipico, identificazione del bersaglio molecolare (s) di detto composto è cruciale, non solo per la comprensione del meccanismo di azione e potenziali effetti collaterali del composto, ma anche per potenzialmente scoprire nuova biologia alla base del modello di malattia e aprendo la strada allo sviluppo di nuove classi meccanicistiche terapie in 1. Anche se l&#39;identificazione di destinazione non è richiesta per un farmaco da utilizzare terapeuticamente, negli ultimi anni c&#39;è stato un crescente riconoscimento del fatto che nuovi farmaci candidati hanno maggiori probabilità di avere successo negli studi clinici, e quindi produrre rendimenti migliori degli investimenti, se un bersaglio convalidato è noto 2. Così, c&#39;è stato un crescente interesse metodi per identificare piccoleproteine ​​bersaglio molecola. Un esperimento di identificazione di destinazione classica si basa in genere su purificazione di affinità, dove la piccola molecola di interesse è immobilizzato su una resina e incubato con lisati cellulari integrali, dopo di che le proteine ​​non legate vengono spazzati via e le restanti proteine ​​vengono eluite e identificati 3. Sebbene questa tecnica è stata utilizzata per identificare i bersagli di molte piccole molecole 4, è idoneo come metodo ID destinazione universale per diversi motivi. Innanzitutto, la proteina bersaglio deve mantenere la sua conformazione nativa upon lisi cellulare al fine di mantenere la sua capacità di legarsi alla piccola molecola. Questo può essere particolarmente problematico per proteine ​​di membrana, che spesso subiscono cambiamenti conformazionali dopo essere stato rimosso dal loro ambiente nativo, o semplicemente aggregata e precipitano dalla soluzione. In secondo luogo, la piccola molecola deve essere modificata chimicamente in modo tale che esso può essere immobilizzato sulla resina mantenendosua capacità di legare la proteina bersaglio. tasche vincolanti profondi possono pertanto diventare inaccessibile a una piccola molecola una volta che è fissato alla resina. In terzo luogo, l&#39;affinità di legame deve essere sufficientemente elevata che l&#39;interazione viene mantenuta durante le fasi di lavaggio, rendendo l&#39;identificazione delle interazioni minore affinità impegnativi. Quarto, condizioni ambientali, quali pH, concentrazione di ioni, o la presenza di altre molecole endogene possono variare spazialmente all&#39;interno della cellula e sono talvolta prerequisiti per interazioni farmaco-bersaglio. Così, trovare le condizioni corrette per consentire e mantenere al di fuori della cellula legame può richiedere una quantità significativa di tentativi ed errori. etichettatura Photoaffinity elude questi problemi, consentendo il legame di una piccola molecola e il suo obiettivo nel contesto nativo di una cellula covalente. Invece di immobilizzare la piccola molecola ad una grande resina ingombrante, la molecola viene invece modificato chimicamente installare due piccoli g funzionaliruppi: un residuo fotoattivabile che permette covalente reticolazione alla proteina bersaglio quando irradiato con una particolare lunghezza d&#39;onda della luce, e un gruppo giornalista che permette la proteina bersaglio da rilevare e successivamente isolato. cellule vive sono trattati con la sonda photoaffinity, la sonda si lega covalentemente e reticola alla proteina bersaglio, e il complesso sonda proteina è poi isolato intatto. La specificità di legame al bersaglio sonda è dimostrata effettuando un esperimento di competizione in parallelo, dove un eccesso del composto originario è utilizzato per competere via legame della sonda alla proteina bersaglio. La progettazione e la sintesi di sonde photoaffinity varia notevolmente da una piccola molecola ad un altro, e non saranno coperti in questo protocollo; tuttavia, diversi ottimi discussioni sul tema sono stati pubblicati 5-9. La considerazione principale è che la sonda mantiene la bioattività del composto originario, quindi presumabmente vincolante per la stessa destinazione (s). Relazione struttura-attività (SAR) studi devono essere effettuati per determinare quali parti della molecola possono essere modificate senza perdita di bioattività. Una varietà di diversi gruppi chimici sono stati utilizzati come reticolanti fotoattivabile, tra diazirine, benzofenone, e aril azide, che hanno ciascuno vantaggi e svantaggi 10. Inoltre, ci sono più tag giornalista che sono stati utilizzati per isolare proteine ​​sonda vincolante. Gruppi Reporter possono essere funzionale da soli, come la biotina comunemente usato o tag fluorescenti, o possono essere precursori che richiedono ulteriori funzionalizzazione successivamente alla fase photocrosslinking, che hanno il vantaggio di essere più piccolo e quindi meno probabilità di compromettere bioattività 11. In questo protocollo, abbiamo utilizzato una sonda photoaffinity contenente un gruppo diazirine photocrosslinking, e un alchino terminale per il fissaggio di un gruppo giornalista attraverso un Cu (I) -catalyzEd azide-Acetilene Sharpless-Huisgen cicloaddizione (o click) reazione di 12-15. Gli studi SAR, sonda progettazione e sintesi, e risultati di questi studi sono stati pubblicati altrove 16-18.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>Prepara un giorno fresco di utilizzo. Preparare 100 mM di brodo in acqua con 4 eq di NaOH.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metilammina (TBTA)</td><td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>Preparare 1,7 mM di stock in un rapporto 4:1 di t-butanolo e DMSO, conservare a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Solfato di rame (CuSO4&#8226; 5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>Preparare 50 mM di brodo in acqua, conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Strumenti chimici per</td> <td>biotina-azide</td><td>Click AZ104-100</td><td>Preparare 10 mM di stock in DMSO, conservare a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azide&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td><td>Prepara 1 mM di stock in DMSO, conservare a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Lampada UV da 365 nm</td> Gli occhiali con blocco UV <td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>devono essere indossati durante il funzionamento.</td></tr><tr><td>Compresse di inibitori della proteasi, senza EDTA</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Preparare 50 volte la soluzione in acqua e conservare a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Branson</td><td>Sonifier 250</td><td>impostato sull'uscita 1, dovere 30%.</td></tr><tr><td>Scanner su gel fluorescente</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Utilizza il laser rosso per rilevare Alexa-fluor 647.</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Dc compatibile con i detergenti</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Perle di agarosio di streptavidina ad alta capacità&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Siero fetale bovino a medio e basso contenuto di glucosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr>, <tr><td>qualificato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina/streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SDS Sample Buffer (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo cellular ambiente da live-cell photoaffinity etichettatura

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificare i bersagli molecolari di piccole molecole è un passo impegnativo ma necessario verso la comprensione del loro meccanismo d'azione. Sebbene siano stati sviluppati e utilizzati diversi metodi di identificazione del bersaglio per chiarire con successo le proteine leganti di una varietà di piccole molecole, queste tecniche presentano inconvenienti che le rendono inadatte a rilevare alcuni tipi di interazioni piccola molecola-bersaglio. In particolare, le interazioni non covalenti che dipendono da condizioni cellulari native, come quelle delle proteine di membrana le cui strutture possono essere perturbate durante la lisi cellulare, spesso non sono suscettibili di metodi di identificazione del bersaglio basati sull'affinità. Qui, dimostriamo un metodo in cui una sonda contenente un gruppo fotolabile viene utilizzata per reticolare covalentemente la proteina legante la piccola molecola all'interno dell'ambiente della cellula viva, consentendo il rilevamento e l'isolamento della proteina bersaglio senza la necessità di mantenere l'interazione dopo la lisi cellulare. Questa tecnica è uno strumento prezioso per lo studio di piccole molecole biologicamente interessanti con meccanismi sconosciuti, sia nel contesto della biologia di base che della scoperta di farmaci.

I risultati riportati sono stati ottenuti con una sonda foto-affinità del itraconazolo farmaco antimicotico, il cui uso è stato precedentemente pubblicato 16. Questi risultati dimostrano l&#39;uso della tecnica di etichettatura photoaffinity live-cell per identificare correttamente una proteina itraconazolo vincolante come 35 kDa proteina di membrana Voltage-Dependent dell&#39;anione Canale 1 (VDAC1). Il protocollo ...

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine leganti di molecole di piccole dimensioni utilizzando una sonda fotoaffine, in grado di legarsi al suo bersaglio in cellule vive, consentendo successivamente l'isolamento e l'identificazione del bersaglio. Questo metodo può essere impiegato per chiarire il meccanismo d'azione molecolare di farmaci o altre molecole di piccole dimensioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il legame e l'etichettatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare nativo, eliminando il rischio di alterare la struttura nativa delle proteine e le condizioni di legame durante la lisi cellulare.Iniziare questa procedura preparando piastre sterili per colture cellulari da sei centimetri, nel numero desiderato di campioni. Tipicamente, si utilizza una piastra di cellule per ogni condizione di trattamento. Per questa dimostrazione verranno preparate tre piastre di cellule: un controllo negativo con solo DMSO, etichettato D; il trattamento con sonda soltanto, etichettato P; e sonda più competitore, etichettato C. Aggiungere a ciascuna piastra 3,5 milioni di cellule HEK 293 T in quattro millilitri di mezzo di coltura.Incubare le cellule durante la notte. Prima di trattare le cellule, prelevare in aliquote i farmaci necessari in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. Per il pretrattamento con il composto competitivo, aggiungere quattro microlitri di DMSO a ciascuna di due provette e quattro microlitri di composto competitivo 10 millimolare a una provetta.Per il trattamento con la sonda, aggiungere 16 microlitri di DMSO in un tubo e 16 microlitri di sonda di affinità fotoattivabile 15 micromolare in ciascuno dei due tubi. Portare le piastre di coltura cellulare nell'incubatore per colture cellulari per l'aggiunta dei farmaci pre-aliquotati. Aspirare un millilitro di mezzo di coltura dalla piastra del trattamento di competizione, trasferirlo nel tubo microcentrifuga contenente il competitore pre-aliquotato e risospendere il farmaco nel mezzo.Aggiungere delicatamente, goccia a goccia, la miscela di mezzo e farmaco nuovamente nella piastra. Nello stesso modo, aggiungere DMSO sia nella piastra di controllo negativo sia nella piastra con la sonda. Rimettere le piastre nell'incubatore per 30 minuti.Dopo 30 minuti, riportare le piastre nell'incubatrice di coltura e abbassare le luci. Aggiungere il DMSO pre-aliquote alla piastra di controllo negativo e il sonda alle piastre con sonda e competizione. Rimettere le piastre nell'incubatrice per un'ora.Dopo un'ora, mettere le piastre sul ghiaccio. Lavare delicatamente le cellule in ogni piastra con cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio per rimuovere l'eccesso di sonda. Ricoprire nuovamente le cellule con quattro millilitri di PBS freddo di ghiaccio.Posizionare una piastra di cellule, centrata a tre centimetri sotto la lampada a raggi UV e sopra un pacchetto di ghiaccio, per minimizzare il riscaldamento causato dalla lampada, e irradiare per tre minuti. Rimuovere la piastra e posizionarla sul ghiaccio. Irradiare tutti i campioni in questo modo.Dopo l'irradiazione di tutti i campioni, aspirare il PBS dalle cellule e aggiungere 200 microlitri di PBS freddo con inibitori della proteasi a ogni piastra. Staccare le cellule dalla piastra utilizzando una spatola di gomma e trasferirle in provette microcentrifuga precedentemente etichettate e poste sul ghiaccio. Aggiungere SDS a ciascun campione fino a una concentrazione finale dello 0,4%. Lisiare le cellule sonicando la sospensione per 10 impulsi, incubando sul ghiaccio per un minuto e quindi sonicando per altri 10 impulsi.Fare bollire i campioni su un blocco riscaldato impostato a 95 gradi Celsius per cinque minuti per completare la lisi cellulare e denaturare tutte le proteine. Dopo aver misurato la concentrazione proteica in ciascun campione, come descritto nel protocollo testuale, normalizzare la concentrazione proteica a 2,5 milligrammi per millilitro, aggiungendo PBS pH 8,5 più 0,4% SDS secondo necessità. Per iniziare questa procedura, trasferire 40 microlitri di ciascun lisato cellulare, preparato nel segmento precedente, in un nuovo tubo da microcentrifuga.Aggiungere i seguenti reagenti in questo ordine: 0,2 microlitri di flour-azide, 0,58 microlitri di TCEP e 3,38 microlitri di TBTA. Vortexare per mescolare. Aggiungere 1,14 microlitri di solfato di rame pentaidrato per avviare la reazione.Vortexare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Aggiungere 50 microlitri di tampone campione 2X SDS per bloccare la reazione. Eseguire i campioni su un gel di SDS-PAGE e, quando il fronte del colorante ha raggiunto l'estremità del gel, proseguire l'elettroforesi per ulteriori cinque minuti per assicurare che tutto l'eccesso di fluor-azide non reagito abbia completamente abbandonato il gel.Dopo aver rimosso tutto l'eccesso di flour-azide, posizionare il gel su una lastra di vetro e scansionare il gel utilizzando uno scanner fluorescente per gel, seguendo le istruzioni del produttore. Per l'aggiunta di un marcatore biotinico, utilizzare la quantità massima di lisati cellulari dopo la normalizzazione delle proteine, in modo che tutti i campioni abbiano lo stesso volume. Precaricare i lisati aggiungendo ogni campione a un nuovo tubo contenente 50 microlitri di perle di agarosio streptavidina ad alta capacità, prelavate.Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione. Raccogliere le perle tramite centrifugazione. Rimuovere il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifuga posto sul ghiaccio e scartare le perle.Per 500 microlitri di lisato, aggiungere i seguenti reagenti: 1,38 microlitri di biotina-azide, 5,5 microlitri di TCEP e 32,5 microlitri di TBTA. Vortexare per mescolare. Aggiungere 11 microlitri di solfato di rame pentaidrato per ogni 500 microlitri di lisato e vortexare brevemente.Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere quattro volumi di campione di acetone, raffreddato a 20 gradi Celsius, vortexare i campioni e incubare tutta la notte a 80 gradi Celsius, per precipitare completamente le proteine e rimuovere il biotina-azide non reagito. Il giorno seguente, centrifugare i campioni a 17.000 x g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per formare il pellet delle proteine precipitate.Aspirare completamente il soprannatante, aggiungere 150 microlitri di PBS pH 7,4 e 1% SDS a ciascun campione e risolubilizzare le proteine mediante sonificazione. Aggiungere 600 microlitri di PBS a ciascun campione per diluire la concentrazione di SDS allo 0,2%, quindi aggiungere il campione in un nuovo tubo contenente 30 microlitri di perle di agarosio streptavidina ad alta capacità, prelavate. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione.Dopo un'ora, centrifugare le perle a 1000 x g per tre minuti per formare il pellet. Aspirare e scartare il soprannatante, che contiene le proteine non legate. Aggiungere un millilitro di buffer di lavaggio alle perle e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente con rotazione.Centrifugare, eliminare il surnatante e lavare nuovamente con il buffer di lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare completamente il buffer di lavaggio dalle perle e aggiungere 30 microlitri di buffer campione 2X SDS. Incubare per cinque minuti in un blocco termico a 95 gradi Celsius per rilasciare le proteine dalle perle.Centrifugare le perle a 13000 x g a temperatura ambiente per un minuto. Aspirare con attenzione il tampone del campione, contenente le proteine, separandolo dalle perle, per l'elettroforesi SDS-PAGE. La visualizzazione delle proteine dopo la marcatura con il marcatore fluorescente è illustrata da questa gel analizzata mediante scansione fluorescente.La principale banda della proteina legante specifica, a circa 35 kilodalton, è presente soltanto nella corsia del sonda e viene eliminata dalla competizione con l'eccesso del composto parentale. La stessa banda di 35 kilodalton è stata visualizzata mediante colorazione argentica dopo il saggio di precipitazione con biotina e successivamente identificata mediante spettrometria di massa come la proteina di membrana VDAC1. L'identità della proteina è stata ulteriormente confermata utilizzando un anticorpo specifico per VDAC1.Il segnale è presente nella corsia del sonda e risulta ridotto nella corsia della competizione. L'inclusione della frazione di input garantisce che l'anticorpo sia funzionante e che la proteina di interesse possa essere rilevata nel lisato. L'aumento leggero del peso molecolare nei campioni di pulldown è dovuto alla sonda legata covalentemente.Si illustrano le conseguenze di un'esecuzione non corretta di determinati passaggi del protocollo. La rimozione incompleta dell'eccesso di flour-azide provoca ampie striature nere in fondo al gel analizzato con fluorescenza, mentre un pretrattamento insufficiente dei lisati e/o un lavaggio inadeguato delle perle genera un gel colorato con argento caratterizzato da una colorazione di fondo molto intensa. Dall'inizio alla fine, l'esperimento di pulldown richiede da due a tre giorni per essere completato.Dopo che la proteina bersaglio è stata isolata e identificata mediante spettrometria di massa o western blotting, dovrebbero essere eseguiti ulteriori esperimenti di validazione specifici per il bersaglio al fine di valutare la rilevanza del bersaglio rispetto al fenotipo indotto dal farmaco.

identification-small-molecule-binding-proteins-native-cellular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

Fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola permette l'osservazione diretta e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in cellule di Escherichia coli vive.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Questo manoscritto descrive come condurre saggi basati su (singola molecola) basati sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per misurare le dinamiche di legame tra il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) e le molecole MHC caricate con peptidi antigenici mentre si verificano all'interno della sinapsi immunologica di una cellula T a contatto con un doppio strato lipidico supportato planare funzionalizzato.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

Viene descritta una nuova tecnica per la rilevazione dei recettori endogeni a bassa abbondanza presenti negli embrioni di zebrafish. L'abbiamo chiamato AFLIP perché consiste nell'etichettatura di affinità del recettore da parte del suo ligando legato all'immunoprecipitazione.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

Scopri l'identificazione di proteine leganti piccole molecole tramite fotoaffinità in cellule HEK 293 T vive. Questo metodo preserva l'ambiente cellulare nativo per studiare i meccanismi d'azione dei farmaci.

Lidentificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura (Video) | JoVE Journal

L'identificazione di piccole proteine che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Esplora altri video

L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Esplora altri video

L'identificazione di piccole proteine che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura