L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine leganti di molecole di piccole dimensioni utilizzando una sonda fotoaffine, in grado di legarsi al suo bersaglio in cellule vive, consentendo successivamente l'isolamento e l'identificazione del bersaglio. Questo metodo può essere impiegato per chiarire il meccanismo d'azione molecolare di farmaci o altre molecole di piccole dimensioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il legame e l'etichettatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare nativo, eliminando il rischio di alterare la struttura nativa delle proteine e le condizioni di legame durante la lisi cellulare.

Iniziare questa procedura preparando piastre sterili per colture cellulari da sei centimetri, nel numero desiderato di campioni. Tipicamente, si utilizza una piastra di cellule per ogni condizione di trattamento. Per questa dimostrazione verranno preparate tre piastre di cellule: un controllo negativo con solo DMSO, etichettato D; il trattamento con sonda soltanto, etichettato P; e sonda più competitore, etichettato C. Aggiungere a ciascuna piastra 3,5 milioni di cellule HEK 293 T in quattro millilitri di mezzo di coltura.

Incubare le cellule durante la notte. Prima di trattare le cellule, prelevare in aliquote i farmaci necessari in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. Per il pretrattamento con il composto competitivo, aggiungere quattro microlitri di DMSO a ciascuna di due provette e quattro microlitri di composto competitivo 10 millimolare a una provetta.

Per il trattamento con la sonda, aggiungere 16 microlitri di DMSO in un tubo e 16 microlitri di sonda di affinità fotoattivabile 15 micromolare in ciascuno dei due tubi. Portare le piastre di coltura cellulare nell'incubatore per colture cellulari per l'aggiunta dei farmaci pre-aliquotati. Aspirare un millilitro di mezzo di coltura dalla piastra del trattamento di competizione, trasferirlo nel tubo microcentrifuga contenente il competitore pre-aliquotato e risospendere il farmaco nel mezzo.

Aggiungere delicatamente, goccia a goccia, la miscela di mezzo e farmaco nuovamente nella piastra. Nello stesso modo, aggiungere DMSO sia nella piastra di controllo negativo sia nella piastra con la sonda. Rimettere le piastre nell'incubatore per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, riportare le piastre nell'incubatrice di coltura e abbassare le luci. Aggiungere il DMSO pre-aliquote alla piastra di controllo negativo e il sonda alle piastre con sonda e competizione. Rimettere le piastre nell'incubatrice per un'ora.

Dopo un'ora, mettere le piastre sul ghiaccio. Lavare delicatamente le cellule in ogni piastra con cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio per rimuovere l'eccesso di sonda. Ricoprire nuovamente le cellule con quattro millilitri di PBS freddo di ghiaccio.

Posizionare una piastra di cellule, centrata a tre centimetri sotto la lampada a raggi UV e sopra un pacchetto di ghiaccio, per minimizzare il riscaldamento causato dalla lampada, e irradiare per tre minuti. Rimuovere la piastra e posizionarla sul ghiaccio. Irradiare tutti i campioni in questo modo.

Dopo l'irradiazione di tutti i campioni, aspirare il PBS dalle cellule e aggiungere 200 microlitri di PBS freddo con inibitori della proteasi a ogni piastra. Staccare le cellule dalla piastra utilizzando una spatola di gomma e trasferirle in provette microcentrifuga precedentemente etichettate e poste sul ghiaccio. Aggiungere SDS a ciascun campione fino a una concentrazione finale dello 0,4%. Lisiare le cellule sonicando la sospensione per 10 impulsi, incubando sul ghiaccio per un minuto e quindi sonicando per altri 10 impulsi.

Fare bollire i campioni su un blocco riscaldato impostato a 95 gradi Celsius per cinque minuti per completare la lisi cellulare e denaturare tutte le proteine. Dopo aver misurato la concentrazione proteica in ciascun campione, come descritto nel protocollo testuale, normalizzare la concentrazione proteica a 2,5 milligrammi per millilitro, aggiungendo PBS pH 8,5 più 0,4% SDS secondo necessità. Per iniziare questa procedura, trasferire 40 microlitri di ciascun lisato cellulare, preparato nel segmento precedente, in un nuovo tubo da microcentrifuga.

Aggiungere i seguenti reagenti in questo ordine: 0,2 microlitri di flour-azide, 0,58 microlitri di TCEP e 3,38 microlitri di TBTA. Vortexare per mescolare. Aggiungere 1,14 microlitri di solfato di rame pentaidrato per avviare la reazione.

Vortexare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Aggiungere 50 microlitri di tampone campione 2X SDS per bloccare la reazione. Eseguire i campioni su un gel di SDS-PAGE e, quando il fronte del colorante ha raggiunto l'estremità del gel, proseguire l'elettroforesi per ulteriori cinque minuti per assicurare che tutto l'eccesso di fluor-azide non reagito abbia completamente abbandonato il gel.

Dopo aver rimosso tutto l'eccesso di flour-azide, posizionare il gel su una lastra di vetro e scansionare il gel utilizzando uno scanner fluorescente per gel, seguendo le istruzioni del produttore. Per l'aggiunta di un marcatore biotinico, utilizzare la quantità massima di lisati cellulari dopo la normalizzazione delle proteine, in modo che tutti i campioni abbiano lo stesso volume. Precaricare i lisati aggiungendo ogni campione a un nuovo tubo contenente 50 microlitri di perle di agarosio streptavidina ad alta capacità, prelavate.

Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione. Raccogliere le perle tramite centrifugazione. Rimuovere il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifuga posto sul ghiaccio e scartare le perle.

Per 500 microlitri di lisato, aggiungere i seguenti reagenti: 1,38 microlitri di biotina-azide, 5,5 microlitri di TCEP e 32,5 microlitri di TBTA. Vortexare per mescolare. Aggiungere 11 microlitri di solfato di rame pentaidrato per ogni 500 microlitri di lisato e vortexare brevemente.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere quattro volumi di campione di acetone, raffreddato a 20 gradi Celsius, vortexare i campioni e incubare tutta la notte a 80 gradi Celsius, per precipitare completamente le proteine e rimuovere il biotina-azide non reagito. Il giorno seguente, centrifugare i campioni a 17.000 x g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per formare il pellet delle proteine precipitate.

Aspirare completamente il soprannatante, aggiungere 150 microlitri di PBS pH 7,4 e 1% SDS a ciascun campione e risolubilizzare le proteine mediante sonificazione. Aggiungere 600 microlitri di PBS a ciascun campione per diluire la concentrazione di SDS allo 0,2%, quindi aggiungere il campione in un nuovo tubo contenente 30 microlitri di perle di agarosio streptavidina ad alta capacità, prelavate. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione.

Dopo un'ora, centrifugare le perle a 1000 x g per tre minuti per formare il pellet. Aspirare e scartare il soprannatante, che contiene le proteine non legate. Aggiungere un millilitro di buffer di lavaggio alle perle e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente con rotazione.

Centrifugare, eliminare il surnatante e lavare nuovamente con il buffer di lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare completamente il buffer di lavaggio dalle perle e aggiungere 30 microlitri di buffer campione 2X SDS. Incubare per cinque minuti in un blocco termico a 95 gradi Celsius per rilasciare le proteine dalle perle.

Centrifugare le perle a 13000 x g a temperatura ambiente per un minuto. Aspirare con attenzione il tampone del campione, contenente le proteine, separandolo dalle perle, per l'elettroforesi SDS-PAGE. La visualizzazione delle proteine dopo la marcatura con il marcatore fluorescente è illustrata da questa gel analizzata mediante scansione fluorescente.

La principale banda della proteina legante specifica, a circa 35 kilodalton, è presente soltanto nella corsia del sonda e viene eliminata dalla competizione con l'eccesso del composto parentale. La stessa banda di 35 kilodalton è stata visualizzata mediante colorazione argentica dopo il saggio di precipitazione con biotina e successivamente identificata mediante spettrometria di massa come la proteina di membrana VDAC1. L'identità della proteina è stata ulteriormente confermata utilizzando un anticorpo specifico per VDAC1.

Il segnale è presente nella corsia del sonda e risulta ridotto nella corsia della competizione. L'inclusione della frazione di input garantisce che l'anticorpo sia funzionante e che la proteina di interesse possa essere rilevata nel lisato. L'aumento leggero del peso molecolare nei campioni di pulldown è dovuto alla sonda legata covalentemente.

Si illustrano le conseguenze di un'esecuzione non corretta di determinati passaggi del protocollo. La rimozione incompleta dell'eccesso di flour-azide provoca ampie striature nere in fondo al gel analizzato con fluorescenza, mentre un pretrattamento insufficiente dei lisati e/o un lavaggio inadeguato delle perle genera un gel colorato con argento caratterizzato da una colorazione di fondo molto intensa. Dall'inizio alla fine, l'esperimento di pulldown richiede da due a tre giorni per essere completato.

Dopo che la proteina bersaglio è stata isolata e identificata mediante spettrometria di massa o western blotting, dovrebbero essere eseguiti ulteriori esperimenti di validazione specifici per il bersaglio al fine di valutare la rilevanza del bersaglio rispetto al fenotipo indotto dal farmaco.