Ganglio spirale Neuron Espianto cultura e Elettrofisiologia su Multi Electrode Array

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come coltivare e registrare l'attività elettrofisiologica dei neuroni uditivi su array multi-elettrodi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'udito, come la caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni uditivi e la stimolazione da parte delle aree degli elettrodi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la registrazione simultanea extracellulare non invasiva dell'attività neuronale di un gran numero di neuroni uditivi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia. In effetti, potrebbero essere utilizzati per implementare l'interfaccia elettroneuronale delle protesi come l'impianto cocleare per ripristinare l'udito nei pazienti sordi. Per iniziare questa procedura, preparare la soluzione di rivestimento ECM scongelando prima la miscela ECM con ghiaccio.

Quindi diluire la miscela ECM in un terreno di coltura basico in un rapporto da uno a 10 e conservarla in ghiaccio. Per i nuovi MEA in una cappa a flusso laminare, immergerli in etanolo al 70% per 30 secondi. Successivamente, lavateli con acqua distillata per 30 secondi.

Quindi lasciare asciugare i MEA per 30 minuti. Per rivestire i MEA, pipettare 50 microlitri di soluzione di rivestimento sui MEA con un puntale per pipetta freddo da 200 microlitri. Quindi lasciare che i MEA vadano da 30 minuti a un'ora a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere la soluzione di rivestimento. Aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura integrato con il 10% di FBS e cinque nanogrammi per millilitro di BDNF e lasciarlo a temperatura ambiente fino alla placcatura del tessuto. Quindi, posizionare la piastra di Petri contenente i MEA rivestiti in una grande piastra di Petri e aggiungere una piccola piastra di Petri contenente PBS per l'umidificazione.

In questa procedura, sterilizzare la testa del cucciolo con etanolo al 70%. Quindi tagliare la connessione tra la pelle e il cranio lungo la linea sagittale. Quindi, taglia il cranio in modo agitato e rimuovi il cervello.

Dopodiché, taglia le ossa temporali dal cranio e mettile in una capsula di Petri contenente HBSS sterile ghiacciato. Sotto un microscopio da dissezione, sezionare la bolla timpanica usando un paio di pinze sottili e isolare l'orecchio interno. Quindi, rimuovere l'osso della coclea.

Quindi, rimuovere il legamento spirale e l'SV insieme tenendo la porzione basale del ganglio spirale e l'SV con una pinza e svolgendo lentamente l'SV dalla base all'apice. Separare l'organo di Corti dal ganglio a spirale in modiolo tenendo la porzione basale del ganglio a spirale e l'organo di Corti con una pinza e svolgendo lentamente l'organo di Corti dalla base all'apice. Quindi, tagliare gli espianti laterali dal ganglio a spirale utilizzando una pinza o forbici o coltelli da microdissezione fine.

A questo punto trasferire gli espianti di ganglio spirale e l'organo di Corti sul MEA. Quindi, posizionare gli espianti SG sull'area dell'elettrodo e sull'organo di Corti a circa cinque millimetri di distanza dall'area dell'elettrodo. Posizionare gli espianti e l'organo di Corti sui MEA evitando danni al tessuto.

Successivamente, posizionare con cura i MEA nell'incubatore e nella coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Il giorno successivo, ispezionare visivamente gli espianti per verificarne l'attaccamento ai MEA. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e BDNF ogni giorno per cinque giorni consecutivi.

Il sesto giorno, aggiungere due millilitri di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e cinque nanogrammi per millilitro di BDNF e coltivare il tessuto per altri 13 giorni. Dopo un totale di 18 giorni di coltura, lavare la coltura MEA con la soluzione extracellulare preparata in precedenza a temperatura ambiente. Quindi, asciugare i contatti del chip MEA con un pezzo di tessuto e montare i MEA sul supporto MEA.

Infine, installa il MEA sulla configurazione di registrazione. Successivamente, aggiungere 300 microlitri della soluzione extracellulare e attendere 10 minuti per consentire al sistema di stabilizzarsi prima di registrare. Ora, registra l'attività spontanea per due minuti da tutti gli elettrodi e identifica gli elettrodi attivi.

Quindi, identificare gli elettrodi che rispondono alla stimolazione. Per escludere l'artefatto di stimolazione, stimolare dallo stesso elettrodo 10 volte. Se la coltura risponde almeno otto volte su 10, si può presumere che sia una risposta positiva dopo la stimolazione indotta da elettrodi.

Per identificare un rumore di fondo, applicare TTX alla coltura a una concentrazione di un micromolare per bloccare i canali del sodio voltaggio-dipendenti e quindi registrare per due minuti. Ecco le tracce delle registrazioni originali di sei dei 63 elettrodi che mostrano un'attività spontanea e questo è il grafico raster dei sei elettrodi dopo il rilevamento dei picchi. Ogni barra rappresenta un potenziale d'azione.

Questo grafico raster include tutti gli elettrodi attivi. Le attività vengono registrate da 63 elettrodi per due minuti. Questa figura illustra che uno stimolo bifasico con una durata totale di 80 microsecondi e un'ampiezza di 80 micro ampere è stato utilizzato per la stimolazione della coltura da un elettrodo.

Questo esempio rappresentativo di tracce di dati grezzi mostra i potenziali d'azione, il tutto senza risposte dopo la stimolazione. Ed ecco la coltura del ganglio a spirale sui MEA immuno-colorati per il marcatore neuronale, TUJ, alla fine dell'esperimento per visualizzare la copertura neuronale dell'area dell'elettrodo. L'elettrodo utilizzato per la stimolazione è indicato in verde e gli elettrodi di risposta sono indicati in rosso.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 50 minuti se eseguita correttamente. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sull'elettrofisiologia dei neuroni gangliari a spirale, possono essere applicati anche ad altri sistemi come le colture del cervello o del midollo spinale. Dopo lo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della scienza dei materiali e della nanotecnologia, alla modifica rapida della superficie di blot degli elettrodi di registrazione neuronale e alla stimolazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e registrare l'attività elettrofisiologica, organizzando un espiantazione neuronale su array multielettrodi.