Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

Questo protocollo consente la rilevazione di una beta malters nel tessuto corticale umano. In primo luogo, il tessuto omogeneizzato viene sottoposto a sonicazione con sonda e chiarificato mediante centrifugazione a bassa velocità. Successivamente, i campioni ridotti vengono bolliti in tampone SDS e caricati su una poli acrilamide.

Le proteine del gel vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa e la membrana viene riscaldata a vapore in soluzione salina tamponata al fosfato. Infine, su un agitatore orbitale, la membrana viene incubata tutta la notte in anticorpo primario, anticorpo secondario coniugato con HRP e quindi in reagente perossido di lumina prima dell'esposizione a pellicola a raggi X. Ciao, sono Rebecca Rosen del laboratorio di Larry Walker del Dipartimento di Neuroscienze presso il Yerkes National Primate Research Center dell'Emory University.

Oggi vi mostreremo come rilevare i multimeri di Abeta e l'omogeneità corticale mediante elettroforesi su gel SDS e immunoblotting con recupero dell'antigene indotto dal calore. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i livelli e la distribuzione di specifici multimeri di Abeta in tessuti corticali non fissati provenienti da esseri umani affetti da malattia di Alzheimer e da primati non umani anziani. Cominciamo dunque.

Iniziare con circa cento milligrammi di tessuto corticale non fissato e omogeneizzare verso il basso in circa 400 microlitri di tampone ghiacciato con circa 30 movimenti completi del pestello. Per una concentrazione del 20% peso/volume, il rapporto tra peso del tessuto e volume del tampone deve essere di un milligrammo ogni quattro microlitri. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire gli omogeneati in un tubo in polipropilene da quattro millilitri e sottoporre a sonica con sonda tre volte per cinque secondi alla potenza cinque.

Dopo la sonica, trasferire gli omogeneizzati in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro e centrifugare per cinque minuti a 3000 ×g; rimuovere con attenzione i supernatanti chiarificati e conservare aliquote da 50 microlitri di questi estratti a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Successivamente, determinare la concentrazione totale di proteine in aliquote appena scongelate di omogeneizzati chiarificati utilizzando un saggio bioacido o BCA secondo le istruzioni del produttore; gli omogeneizzati corticali al 20% chiarificati dovrebbero presentare una concentrazione proteica superiore a cinque microgrammi per microlitro e possono quindi essere diluiti da uno a 10 per rientrare nel range del lettore di piastre. Per il saggio BCA, preparare reazioni campione denaturanti utilizzando le stesse aliquote di omogeneizzati chiarificati.

Utilizzare circa 50-60 microgrammi di proteina totale e regolare il volume degli omogenati corticali di conseguenza, in modo che ciascuno contenga la stessa quantità totale di proteina. Preparare i campioni fino a un volume totale di 25 microlitri per ogni gel trice al 10-20% da eseguire. Per ogni gel, preparare un controllo positivo costituito da 10-100 nanogrammi di peptide sintetico a beta 40 o a beta 42 diluito in 1 X PBS fino a 10 microlitri, aggiungendo 12,5 microlitri di buffer campione 2 X SDS e 2,5 microlitri di agente riducente 10 X.

Dopo aver preparato tutti i campioni, inclusa un vortice di controllo beta per cinque-dieci secondi e riscaldato in bagno asciutto a 100 gradi Celsius per cinque minuti, centrifugare rapidamente tutti i tubi per rimuovere la condensa dal tappo. Caricare i campioni su un gel immerso in tampone di corsa trice SDS in una gel box e caricare almeno un pozzetto con 10 microlitri di un marcatore di peso molecolare non diluito. Far correre il gel a una tensione costante di 125 volt per circa 90 minuti o fino a quando il marcatore di quattro chilodalton si trova a circa un centimetro dal fondo del gel.

Rimuovere con attenzione i gel dalle custodie di plastica e assemblare il sandwich di trasferimento seguendo le istruzioni del produttore. Inumidire preventivamente i tamponi per il trasferimento e indicare le membrane di nitrocellulosa al micrometro con tampone tris-glicina. Trasferire il tampone e rimuovere eventuali bolle d'aria dai tamponi o dal sandwich costituito da carta da filtro e membrana.

Riempire la camera interna dell'apparato di trasferimento con buffer di trasferimento e la camera esterna con acqua distillata. Eseguire il trasferimento per due o tre ore a un'amperaggio costante di 25 milliampere. Al termine del trasferimento, smontare il sandwich e posizionare i gel in una bacinella riempita con acqua distillata e le membrane in una bacinella contenente un XPBS per tutti i passaggi del protocollo.

Assicurarsi che gel e membrane siano completamente ricoperti di liquido per evitare che si secchino. Per visualizzare l'efficienza del trasferimento proteico, colorare i gel con il colorante Simply Blue Safe non diluito per un'incubazione di circa un'ora e le membrane con il colorante PON S red 1x per circa cinque minuti. Il tempo di incubazione indicato nelle istruzioni del produttore; questa colorazione non interferirà con l'immunoblotting.

Se la colorazione rivela un trasferimento inefficiente della proteina, modificare il tempo di trasferimento al passaggio tre per il recupero dell'antigene. In un bagno a vapore sigillare la membrana in una busta di plastica CapEx resistente riempita con circa 50 millilitri di 1 XPBS a temperatura ambiente. Appena la busta inizia a espandersi, posizionarla in piano in un bagno a vapore preriscaldato a 100 gradi Celsius e incubare per ulteriori 15 minuti prima di rimuoverla dal bagno a vapore.

Lasciare raffreddare lentamente la membrana prima di rimuoverla dalla busta per evitare una eccessiva formazione di grinze a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione la membrana dalla busta e sciacquarla per cinque minuti con un XPBS su un agitatore orbitale, seguito da un ulteriore risciacquo di cinque minuti in TBST su un agitatore orbitale. Successivamente, incubare la membrana nella soluzione di blocco per un'ora su un agitatore orbitale senza risciacquare, quindi trasferire la membrana in una piastra contenente l'anticorpo primario six E 10, specifico per la regione terminale di A beta, diluito da 1 a 1000 fino a 1 a 5.000 nella soluzione di blocco.

Incubare su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per un'ora, quindi da 24 a 48 ore con agitazione a quattro gradi Celsius. Dopo un rapido risciacquo, lavare la membrana per 30 minuti. In TBST, eseguire successivamente tre risciacqui di 10 minuti ciascuno su un agitatore orbitale.

Incubare la membrana nell'anticorpo secondario coniugato con HRP, diluito uno a 10.000 nella soluzione di blocco, per 90 minuti sullo shaker a temperatura ambiente. In questo protocollo utilizziamo anticorpo anti-US da pecora. Risciacquare nuovamente la membrana per 30 minuti in TBST, iniziando con un risciacquo rapido seguito da tre risciacqui di 10 minuti ciascuno su uno shaker orbitale.

Dopo l'ultimo risciacquo, incubare la membrana in reagenti ECL Super Signal West Pico appena preparati e non diluiti per cinque minuti. Sulla piastra agitatrice a elevato numero di giri al minuto, rimuovere la membrana ed eliminare il reagente in eccesso. Utilizzando carta filtro senza lanugine o salviette Kim, posizionare la membrana in una cassetta per pellicole tra protezioni di plastica e asciugare ulteriore reagente Super Signal con salviette Kim senza polvere.

Se necessario, esporre per intervalli di 30 secondi fino a 30 minuti su pellicola Kodak Biomax MR e sviluppare in un rivelatore per pellicole. Dopo cinque minuti, le bande del monomero A beta saranno probabilmente saturate in questo esperimento. Omogenati chiarificati contenenti 50 microgrammi di proteina totale provenienti da sette soggetti umani sono stati analizzati per la presenza di beta amiloide multimerica o A beta e proteina precursore dell'amiloide o APP, la proteina transmembrana da cui il peptide A beta viene scisso.

Qui mostriamo immagini rappresentative di un esperimento di western blot per A beta a PP con tempi di esposizione di 30 minuti e cinque minuti. Un'esposizione di 30 minuti permette di visualizzare le bande molto più deboli dei dimeri, trimeri, tetrameri e delle forme ad alto peso molecolare o legamentose di Abeta, ma sovraesprime le altre lane a un tempo di esposizione di cinque minuti. La stessa banda del tetramero è presente ma debole, consentendo una chiara visualizzazione delle altre lane.

Omogenati corticali da soggetti con malattia di Alzheimer o AD sono visibili nelle corsie da uno a tre, un soggetto umano diagnosticato con demenza a corpi di Lewy o DLB e malattia di Alzheimer è visibile nella corsia quattro, casi di demenza a corpi di Lewy sono visibili nelle corsie cinque e sei e un caso di controllo umano anziano non demente. Nella corsia sette, l'immunoblotting con l'anticorpo sei C 10 ha rivelato monomeri di beta, dimeri, trimeri, tetrameri e una PP in tutti i casi di Alzheimer, oltre a abbondanti forme di peso molecolare più elevato di aggregati di beta in due casi di AD, indicativo dell'eterogeneità della beta-oligomerizzazione tra soggetti umani sintetici.

La presenza di Abeta 40 nella corsia di destra conferma l'identità delle bande di peso molecolare inferiore. Vi abbiamo appena mostrato un esperimento di Western blot su gel SDS-PAGE per identificare multimeri di Abeta in omogenati di tessuto non fissato provenienti dal cervello di esseri umani affetti da malattie neurodegenerative. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale preparare un omogenato corticale altamente concentrato per la separazione mediante elettroforesi su gel, al fine di rivelare multimeri di Abeta presenti in basse abbondanze.

È inoltre importante eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore prima della immunoblotting con un anticorpo diretto contro il peptide Abeta. Il recupero dell'antigene aiuta a rivelare gli epitopi Abeta oscurati, ottimizzando il legame dell'anticorpo durante l'immunoblotting. Qualsiasi apparecchio per la cottura a vapore, microonde o bagno termico in grado di mantenere una temperatura di 100 gradi Celsius è adeguato.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.