Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

Abbiamo descritto una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE, recupero antigene e immunoblotting con un anticorpo per il peptide Aβ. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomerici e multimerica nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.

Questo protocollo consente il rilevamento di una beta malters nel tessuto corticale umano. Il primo tessuto omogeneizzato viene sonicato con sonda e chiarificato mediante centrifugazione a bassa velocità. Successivamente campioni di ridotto bolliti in tampone SDS e caricati su una poliacrilammide.

Le proteine del gel vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa e la membrana viene riscaldata a vapore in soluzione salina tamponata con fosfato. Infine, su un agitatore orbitale, la membrana viene incubata per una notte nell'anticorpo primario HRP coniugato e quindi nel reagente perossido luminale prima dell'esposizione alla pellicola a raggi X. Ciao, sono Rebecca Rosen del laboratorio di Larry Walker nel Dipartimento di Neuroscienze presso lo Yerkes National Primate Research Center della Emory University.

Oggi vi mostreremo come rilevare i multimeri Abeta e l'omogeneità corticale utilizzando l'elettroforesi su gel SDS e l'immunoblotting con recupero dell'antigene indotto dal calore. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i livelli e la distribuzione di distinti multimeri Abeta in tessuti corticali non fissati provenienti da esseri umani con malattia di Alzheimer e primati non umani di età. Quindi iniziamo.

Iniziare con circa un centinaio di milligrammi di tessuto corticale non fissato e omogeneizzare in circa 400 microlitri di tampone ghiacciato con circa 30 colpi di pestello. Per il 20% di peso per volume, il rapporto tra peso del tessuto e volume del tampone dovrebbe essere di un milligrammo per quattro microlitri. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire gli omogenei in una provetta di polipropilene da quattro millilitri e sonare sonicare tre volte per cinque secondi alla quinta potenza.

Dopo la sonicazione, trasferire le provette omogeneizzate in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 3000 g, rimuovere con cura i surnatanti chiarificati e conservare 50 aliquote da microlitro di questi estratti a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Successivamente, determinare la concentrazione proteica totale per le aliquote appena scongelate di omogeneizzati chiarificati utilizzando un saggio di bioacido o BCA secondo le istruzioni del produttore: gli omogeneizzati corticali chiariti al 20% dovrebbero avere una concentrazione proteica superiore a cinque microgrammi per microlitro e possono quindi essere diluiti da uno a 10 per essere all'interno dell'intervallo del lettore di piastre. Per il saggio BCA, preparare reazioni di denaturazione del campione con le stesse aliquote di omogeneizzati chiarificati.

Utilizzare circa 50-60 microgrammi di proteine totali e regolare di conseguenza il volume degli omogeneizzati corticali, in modo che ciascuno contenga la stessa proteina totale. Preparare i campioni fino a un volume totale di 25 microlitri per ogni gel da eseguire al 10-20%. Per ogni gel, preparare un controllo positivo da 10 a cento nanogrammi di peptide sintetico beta 40 o beta 42 diluito in un XPBS a 10 microlitri con 12,5 microlitri di due tampone campione XSDS e 2,5 microlitri di 10 x agente riducente.

Dopo aver preparato tutti i campioni, compreso un vortice di controllo beta per cinque-10 secondi e riscaldato in un bagno asciutto a 100 gradi Celsius per cinque minuti, quindi centrifugare rapidamente tutte le provette per rimuovere la condensa nel tappo. Caricare i campioni su un gel imbevuto di un tampone di corsa per trice, SDS, in una scatola di gel e caricare almeno un pozzetto con 10 microlitri di un marcatore di peso molecolare non diluito. Far funzionare il gel a una tensione costante di 125 volt per circa 90 minuti o fino a quando il pennarello Dalton da quattro chili si trova a circa un centimetro dal fondo del gel.

Rimuovere con cautela i gel dalle custodie di plastica e assemblare il sandwich di trasferimento secondo le istruzioni del produttore. Pre-bagnare i tamponi assorbenti e puntare micrometricamente le membrane di nitrocellulosa con tris glicina. Trasferire il tampone e rimuovere eventuali bolle dai tamponi assorbenti o dal sandwich di membrana di carta da filtro.

Riempire la camera interna dell'apparecchio di trasferimento con il tampone di trasferimento e riempire la camera esterna con acqua distillata. Far funzionare il trasferimento per due o tre ore a un amperaggio costante di 25 milliampere. Al termine del trasferimento, decostruire il sandwich e posizionare i gel in una piastra riempita con acqua distillata e le membrane in una piastra riempita con un XPBS per tutte le fasi del protocollo.

Assicurati che i gel e le membrane siano completamente ricoperti di liquido per evitare che si secchino. Per visualizzare l'efficienza dei gel coloranti per il trasferimento delle proteine, i gel con colorante blu non diluito e sicuro per circa un'ora di incubazione e le membrane con un colorante rosso x PON S per circa cinque minuti. Tempo di incubazione Secondo le istruzioni del produttore, questa colorazione non interferisce con l'immunoblotting.

Se la colorazione rivela un trasferimento proteico inefficiente, modificare il tempo di trasferimento nella fase tre per il recupero dell'antigene. In una vaporiera, sigillare a caldo la membrana in una busta di plastica CapEx per impieghi gravosi riempita con circa 50 millilitri di XPBS a temperatura ambiente. Appoggiare la busta in una vaporiera preriscaldata a 100 gradi Celsius una volta che la busta inizia ad espandersi, incubare per altri 15 minuti prima di rimuoverla dalla vaporiera.

Lasciare raffreddare lentamente la membrana prima di rimuoverla dalla busta per evitare che si raggrinziscano eccessivamente a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela la membrana dalla busta e sciacquare la membrana per cinque minuti e un XPBS su un agitatore orbitale, seguito da un risciacquo di cinque minuti in TBST su un agitatore orbitale. Successivamente, incubare la membrana in soluzione bloccante per un'ora su un agitatore orbitale senza risciacquare, trasferire la membrana in un piatto contenente l'anticorpo primario sei E 10, che è specifico per la regione beta A e terminale diluita da uno a 1000 a uno a 5.000 in soluzione bloccante.

Incubare su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per un'ora e poi da 24 a 48 ore con agitazione a quattro gradi Celsius. Dopo un rapido risciacquo, lavare la membrana per 30 minuti. In TBST seguire con tre risciacqui di 10 minuti su uno shaker orbitale.

Incubare la membrana in un anticorpo secondario coniugato HRP diluito da uno a 10.000 in soluzione bloccante per 90 minuti sull'agitatore a temperatura ambiente. In questo protocollo utilizziamo anticorpi anti-US di pecora. Anche in questo caso, sciacquare la membrana per 30 minuti in TBST iniziando con un risciacquo veloce e seguendo con tre risciacqui di 10 minuti su uno shaker orbitale.

Dopo l'ultimo risciacquo, incubare la membrana nei reagenti ECL West Pico Super Signal non diluiti appena fatti per cinque minuti. Sull'agitatore ad alto numero di giri, rimuovere la membrana e rimuovere il reagente in eccesso. Utilizzando carta da filtro priva di lanugine o salviette per parentela, posizionare la membrana in una cassetta di pellicola tra le protezioni in fogli di plastica, tamponare il reagente del super segnale aggiuntivo con salviette Kim prive di polvere.

Se necessario, esporre a Kodak Biomax MR. Film per intervalli di 30 secondi, fino a 30 minuti e sviluppare in uno sviluppatore di pellicole. Dopo cinque minuti, le bande del monomero beta A saranno probabilmente saturate in questo esperimento. Gli omogeneizzati chiarificati contenenti 50 microgrammi di proteine totali provenienti da sette soggetti umani sono stati analizzati per la presenza di beta amiloide multimerica o di una proteina precursore beta e amiloide o di una PP, la proteina transmembrana da cui viene scisso il peptide beta A.

Qui mostriamo immagini rappresentative di un esperimento di western blot A beta a PP a 30 minuti e cinque minuti di esposizione. Un'esposizione di 30 minuti consente di visualizzare il dimero, il triero, il tetramero e le bande di dimero o legamentosi molto più leggere di Abeta, ma sovraespone le altre corsie con un tempo di esposizione di cinque minuti. La stessa banda del tetramero è presente ma debole e consente di visualizzare chiaramente altre corsie.

Gli omogeneizzati corticali di soggetti con malattia di Alzheimer o AD sono osservati nelle corsie da uno a tre, un soggetto umano con diagnosi di demenza con corpi vivaci o DLB e malattia di Alzheimer è visto nella corsia quattro, casi di demenza con corpi di Lewy sono osservati nella corsia cinque e sei e un caso di controllo umano non demente invecchiato. Nella corsia sette, l'immunofioritura con l'anticorpo 6 C 10 ha rivelato un monomero beta, dimeri, trimmeri, tetrameri e un PP in tutti i casi di Alzheimer, nonché un abbondante peso molecolare più elevato. Una beta vacilla in due casi pubblicitari, il che è indicativo dell'eterogeneità di una beta tra soggetti umani sintetici.

Un beta 40 nella corsia di destra conferma l'identità delle bande di peso molecolare più basse. Vi abbiamo appena mostrato una pagina SDS esperimento sul corpo occidentale per identificare un beta multimero in omogeneizzati di tessuto non fissati provenienti dal cervello di esseri umani con malattie neurodegenerative. Quando si esegue questa procedura, è importante preparare un omogeneo corticale altamente concentrato per la separazione mediante elettroforesi su gel al fine di rivelare una minore abbondanza di Abeta malters.

È anche importante eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore prima dell'immunoblotting con un anticorpo contro il peptide Abeta. Il recupero dell'antigene aiuta a rivelare gli epitopi di Abeta oscurati per un legame ottimale degli anticorpi durante l'immunoblotting. Sarà sufficiente qualsiasi vaporiera, forno a microonde o bagnomaria che mantenga i 100 gradi Celsius.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.