Name: Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Impara a rilevare multimeri di Aβ in tessuto corticale umano mediante SDS-PAGE e immunoblot con recupero dell'epitopo antigenico. Questo metodo consente l'analisi affidabile dei peptidi beta-amiloidi nella ricerca sull'Alzheimer.

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Molte grazie a Elaine Pranski e Carolyn Suwyn per un&#39;eccellente assistenza tecnica e di Harry LeVine III, M. Paul Murphy, e ingranaggi per le conversazioni importanti Marla. Il finanziamento è stato fornito da RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, la Fondazione Woodruff e la Emory University Comitato di ricerca.

Parte 1: Preparazione di omogenati di tessuti chiarito <ol><li> Dounce omogeneizzare non fissati tessuto corticale in 4 volumi tempi del freddo buffer (0.1M PBS [Ca + + - e Mg + +-free] da cocktail più di proteasi 2x inibitore [Santa Cruz]) con circa 30 colpi, anche pestello (cioè tampone aggiungere 400μl a 100 mg di tessuto). </li><li> Omogenati Spin per 5 minuti a 3.000 g (4 ° C). Rimuovere con cautela surnatanti chiarito e aliquote vendite di questi estratti a -80 ° C fino al momento dell'uso. </li><li> Determinare la concentrazione totale di proteine ​​(mg / mL) per omogenati chiarita utilizzando un acido bicinchoninic (BCA) test, secondo le istruzioni del produttore (ThermoFisher). </li></ol> Parte 2: SDS-PAGE La preparazione del campione <ol><li> Con un 10 e, il 10-20% Tricine gel (Invitrogen), il volume massimo che può essere caricato per bene è ~ 25μl. Volume totale comprende 2x tampone campione SDS e 10x agente riducente, in modo che il volume massimo di omogenato chiarito che possono essere caricati per bene è 10μl. Chiarito il 20% (w / v) omogenati corticali dovrebbe avere una concentrazione totale di proteine ​​superiore a 5 mg / mL, permettendo 50μg di proteine ​​totali per bene. I campioni con meno di 5mg/ml proteina richiederà meno carico di proteine ​​totali per bene. Tuttavia, i livelli di proteine ​​sono ottimali per la rilevazione di Aβ monomerica e aggregati (50-60μg delle proteine ​​totali è ottimale). Caricare sempre la stessa quantità di proteine ​​totali per bene. </li><li> Per ogni gel, carico di almeno un bene con 10μl di un marcatore di peso molecolare come SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Come controllo positivo, eseguire 10-100 ng di sintesi Aβ40 o Aβ42 peptide (diluito in 1xPBS) in un altro bene. </li><li> Preparare miscele di reazione su ghiaccio, con appena scongelati, omogenati chiarite. Tubi vortex per 5-10 secondi, il calore in un bagno secco a 100 ° C per 5 minuti, quindi girare velocemente tutti i campioni per eliminare condensa nel tappo. </li></ol> Parte 3: SDS-PAGE elettroforesi su gel <ol><li> Caricare i campioni in agitazione su un gel Tricine 10-20% nel Certo XCell Blocco Mini-Cell Gelbox, utilizzando Tricine tampone SDS in esecuzione, secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen), </li><li> Eseguire gel ad una tensione costante di 125V per circa 90 minuti. Lasciate che i campioni fino al marcatore 4KDa la band è di circa 1 cm dal fondo del gel. </li></ol> Parte 4: Trasferimento di proteine ​​da gel a Membrane <ol><li> Rimuovere con cura dal gel in plastica e assemblare il panino trasferimento all'interno del modulo XCell II Blot, secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen). Pre-umido assorbente pastiglie e le membrane di nitrocellulosa 0.2μm con Tris-Glicina buffer di trasferimento (20% metanolo), ed eliminare eventuali bolle dal pad assorbente o il filtro di carta / membrana sandwich. </li><li> Nel Gelbox XCell, riempire la camera interna con buffer di trasferimento e riempire la camera esterna con DIH 2 O (esposizione metanolo può logorare la gelbox plastica nel tempo). </li><li> Eseguire il trasferimento per 2-3 ore a un amperaggio costante di 25mA. </li><li> Quando il trasferimento è stato completato, decostruire il panino e posizionare il gel in DIH 2 O e le membrane in 1xPBS, sia in piazza scatole Petri in plastica (o altro contenitore appropriato). </li><li> Per visualizzare l'efficienza del trasferimento di proteine, gel può essere colorato con i Simply Blue SafeStain (Invitrogen), e le membrane con Ponceau S macchia rossa (Sigma Aldrich), sia secondo le istruzioni del produttore. Questa colorazione non interferirà con immunoblotting. Se la colorazione rivela inefficiente trasferimento di proteine, modificare il tempo di trasferimento al punto 3. </li></ol> Parte 5. Antigene-epitopo recupero e Immunoblotting <ol><li> Recupero Antigen è un passo importante nel rivelare il epitopi Aβ sulla membrana il legame degli anticorpi durante immunoblotting. Ogni bagno a vapore, forno a microonde, o l'acqua che mantiene una temperatura costante di 100 ° C sarà sufficiente. Per il recupero antigene in un piroscafo, termosaldato la membrana in un robusto sacchetto di plastica riempito di Kapak 1xPBS, a temperatura ambiente. Posare il sacchetto appartamento in un pre-riscaldato a vapore, una volta che il sacchetto comincia ad espandersi, incubare per altri 15 minuti. Lasciare che la membrana si raffreddi prima di rimuoverla dal sacchetto, per evitare pieghe eccessive. </li><li> A temperatura ambiente, rimuovere con attenzione la membrana dal sacchetto fumante e risciacquare la membrana per 5 minuti in 1xPBS, seguito da 5 minuti a sciacquare in TBS-T (Tris-Buffered Saline, pH 8,0 con 0,05% di Tween-20 [sigma] ), su un agitatore orbitale. Incubare la membrana in una soluzione bloccante (latte scremato 2,5% in TBS-T) per un'ora, agitando. Senza risciacquo, trasferimento a membrana su un piatto o sacchetto di plastica contenente l'anticorpo primario diluito in soluzione bloccante (6E10 a 1:1000 [1μg/ml] 1:5.000 [0.2μg/ml] diluizione, Covance), bolla evitandos. Incubare su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per un'ora e poi 24-48 ore in agitazione a 4 ° C (più lungo di incubazione può dare un segnale migliore). </li><li> Sciacquare la membrana per 30 minuti in TBS-T (una risciacquata veloce seguita da 3 x 10 risciacqui minuto). </li><li> Incubare la membrana in HRP-coniugato anticorpo secondario (Amersham ECL di pecora anti-topo, GE Healthcare), diluito in soluzione 1:10.000 blocco, per 90 minuti mediante l'agitatore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare la membrana per 30 minuti in TBS-T (una risciacquata veloce seguita da 3 x 10 risciacqui minuto). </li><li> L'agitatore, incubare la membrana in appena fatto reagente Electrochemiluminescence SuperSignal Pico West (ThermoFisher) per 5 minuti, fuori macchia reagente in eccesso sulla privo di carta da filtro e collocare la membrana in un film di cassetta, tra protettori foglio di plastica. Blot off ulteriori reagente SuperSignal con polvere Kimwipes se necessario. </li><li> Esporre ad una pellicola Kodak Biomax MR per intervalli di 30 secondi fino a 30 minuti e si sviluppano in uno sviluppatore film. Dopo 5 minuti, le bande di monomero Aβ sarà probabilmente saturo. </li><li> Membrane possono essere rimossi (dopo il risciacquo in TBS-T), agitando in Restore Plus stripping tampone per 30 minuti a temperatura ambiente e reprobed con anticorpi aggiuntivi se lo si desidera. </li></ol> Parte 6: Rappresentante Immunoblot: <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="Figura 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1c"> Figure 1a-c. Omogenati Chiarito contenente 50μg di proteine ​​totali da 7 soggetti umani vengono analizzati per la presenza di Aβ multimerica e APP. Immunoblotting con anticorpi 6E10 rivela Aβ monomeri, dimeri, trimeri, tetrameri, e APP (banda superiore) in tutti i casi di Alzheimer, così come più abbondante peso molecolare multimeri Aβ in 2 casi AD. Sintetico Aβ40 conferma l'identità delle bande basso peso molecolare. AD: malattia di Alzheimer, DLB: demenza con corpi di Lewy, ND: umana dementi (a) esposizione film di 30 minuti, (b) l'esposizione film di 5 minuti, (c) 30 esposizione secondo film..

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

Nonostante l&#39;importanza di aggregazione Aβ nella patogenesi della malattia di Alzheimer 1,4,5, pochi studi hanno descritto o quantificata la distribuzione di diversi multimeri Aβ in campioni di tessuto umano corticale 2. Comunemente usato tecniche immunoistochimiche non consentono la discriminazione di specie distinte Aβ multimerica nel fisso tessuto corticale. Non fissati in omogenati di tessuto corticale, multimeri Aβ possono essere separati e biochimicamente valutata mediante elettroforesi s...

<table><tbody><tr><td>Compresse di cocktail inibitore di proteasi completo</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>1 compressa in 25 ml di tampone</td></tr><tr><td>Kit BCA per la determinazione delle proteine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell e Kit XCell II Blot Module con marchio CE</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>Agente riducente per campioni NuPAGE (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Standard pre-colorato SeeBlue Plus2</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine Gel, spessore 1,0 mm, 10 pozzetti</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrane di nitrocellulosa, dimensione dei pori 0,2 &amp;mu;m</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Non interferisce con la colorazione immunoistochimica</td></tr><tr><td>Soluzione colorante rosso Ponceau S ATX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>Non interferisce con la colorazione immunoistochimica</td></tr><tr><td>Buste di plastica sigillabili termicamente Kapak per campioni</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale murino 6E10 anti-A&amp;#946;(1-16)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Diluire da 1:1.000 fino a 1:5.000 per WB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>IgG murina ECL, anticorpo totale anti-A&amp;#946; coniugato con HRP (da pecora)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Diluire 1:10.000</td></tr><tr><td>Substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Film Kodak Biomax MR</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione sds-page/immunoblot di multimeri aβ in human tessuto corticale omogenati utilizzando antigen-epitopi recupero

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

Il ripiegamento anomalo e polimerizzazione del β-amiloide (Aβ) peptide è pensato di avviare la cascata neurodegenerative nella patogenesi della malattia di Alzheimer<sup&gt; 1</sup&gt;. Aβ è prevalentemente un 40 - peptide acido o 42 aminoacidi che è incline a auto-aggregazione in β-sheet ricco di fibrille amiloidi che si trovano nei nuclei delle placche senili cerebrali nella malattia di Alzheimer. Crescente evidenza suggerisce che a basso peso molecolare, multimeri Aβ solubile sono più tossici amiloide Aβ fibrillare<sup&gt; 2</sup&gt;. L&#39;identificazione e la quantificazione a basso e ad alto peso molecolare, specie Aβ multimerica nel tessuto cerebrale è un obiettivo essenziale nella ricerca sulla malattia di Alzheimer, e dei metodi impiegati può essere applicata per l&#39;identificazione e la caratterizzazione dei multimeri tossici in altre proteopathies<sup&gt; 3</sup&gt;. Naturalmente multimeri Aβ può essere rilevato da SDS-poliacrilammide gel elettroforesi seguita da immunoblotting con anticorpi specifici anti-Aβ. Tuttavia, la separazione e la rilevazione di Aβ multimerica richiede l&#39;uso di alta concentrazione omogenati corticale e recupero dell&#39;antigene in piccoli pori di dimensioni membrane di nitrocellulosa. Qui si descrive una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE, e antigene-epitopo recupero / 6E10 blotting con anticorpi verso la regione N-terminale del peptide Aβ occidentale. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomeri, dimeri, trimeri, tetrameri, e superiori multimeri peso molecolare nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.

Abbiamo descritto una tecnica per la preparazione di omogenati chiarito umano corticale, la separazione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE, recupero antigene e immunoblotting con un anticorpo per il peptide Aβ. Usando questo protocollo, abbiamo costantemente rilevare Aβ monomerici e multimerica nel tessuto corticale da esseri umani con patologia di Alzheimer.

Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

Si ritiene che il ripiegamento anomalo e la polimerizzazione del peptide beta-amiloide (A&beta;) inneschino la cascata neurodegenerativa nell'Alzheimer...

Questo protocollo consente la rilevazione di una beta malters nel tessuto corticale umano. In primo luogo, il tessuto omogeneizzato viene sottoposto a sonicazione con sonda e chiarificato mediante centrifugazione a bassa velocità. Successivamente, i campioni ridotti vengono bolliti in tampone SDS e caricati su una poli acrilamide.Le proteine del gel vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa e la membrana viene riscaldata a vapore in soluzione salina tamponata al fosfato. Infine, su un agitatore orbitale, la membrana viene incubata tutta la notte in anticorpo primario, anticorpo secondario coniugato con HRP e quindi in reagente perossido di lumina prima dell'esposizione a pellicola a raggi X. Ciao, sono Rebecca Rosen del laboratorio di Larry Walker del Dipartimento di Neuroscienze presso il Yerkes National Primate Research Center dell'Emory University.Oggi vi mostreremo come rilevare i multimeri di Abeta e l'omogeneità corticale mediante elettroforesi su gel SDS e immunoblotting con recupero dell'antigene indotto dal calore. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i livelli e la distribuzione di specifici multimeri di Abeta in tessuti corticali

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Impara a rilevare multimeri di Aβ in tessuto corticale umano mediante SDS-PAGE e immunoblot con recupero dell'epitopo antigenico. Questo metodo consente l'analisi affidabile dei peptidi beta-amiloidi nella ricerca sull'Alzheimer.

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