Quantificazione assoluta di A?

L'obiettivo generale di questa procedura di misura di riferimento è armonizzare le misurazioni della beta nell'LC umano. Questo metodo può contribuire a standardizzare i saggi per la misurazione dell'a beta 42 nell'LC, un biomarcatore della patologia amiloide centrale e un reperto neuropatologico caratteristico della malattia di Alzheimer. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è stata accuratamente validata e non utilizza anticorpi per la quantificazione dell'AVR 142.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia di Alzheimer poiché potrebbe essere utilizzata per armonizzare i saggi e facilitare l'introduzione di livelli generali di cutoff nei trial clinici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patologia amiloide negli esseri umani, può essere applicato anche ad altri organismi mortali, come topi transgenici e primati non umani, per sviluppare nuovi farmaci. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché AVR 142 è molto idrofobico e può facilmente aderire a superfici come le punte delle pipette e le provette.

Per prima cosa, aggiungere 40 microlitri di peptido beta N15 a 0,46 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto. Aggiungere 50 microlitri della soluzione peptidica a 1,95 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da due millilitri.

Mescolare la soluzione peptidica con un agitatore vortex per un minuto. Successivamente, preparare sei soluzioni campione mescolando i volumi appropriati di ciascuna soluzione in provette per microcentrifuga. Dopo aver mescolato le soluzioni campione, preparare i campioni finali in duplicato mescolando i volumi appropriati delle corrispondenti soluzioni campione e LCR umano in provette da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Mescolare ogni soluzione su un agitatore vortex per un minuto. Per preparare lo standard interno, aggiungere prima 32 microlitri di 13C a un peptide beta in 1,968 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da due millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto.

Successivamente, aggiungere 0,1 millilitri della soluzione peptidica a 4,9 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da cinque millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto. Per preparare il campione del fattore di risposta, aggiungere 40 microlitri di peptido beta nativo a 0,46 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Dopo aver mescolato, aggiungere 20 microlitri della soluzione peptidica e 20 microlitri di peptido beta 15N a quattro microgrammi per millilitro in 1,96 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da due millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della soluzione peptidica a 0,38 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Dopo aver preparato le duplicazioni, mescolare ogni soluzione su un agitatore vortex per un minuto. Dopo aver scongelato i campioni su un rullo, aggiungere 0,18 millilitri di ogni calibratore, fattore di risposta e campione incognito in una piastra proteica da 96 pozzetti profondi da un millilitro, assicurandosi di aggiungere i campioni sul fondo dei pozzetti o nelle immediate vicinanze. A questo punto, aggiungere 20 microlitri di standard interno in ogni pozzetto rilasciando una goccia dello standard sul lato del pozzetto vicino alla superficie del campione, senza immergere la punta della pipetta.

Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di cloridrato di guanidina 5 M in ogni pozzetto. Posizionare la piastra campione su un agitatore per micropiastre e mescolare i campioni per 45 minuti a 1100 giri al minuto. Dopo il mescolamento, aggiungere 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ogni pozzetto.

Quindi, posizionare la piastra del campione sullo shaker per micropiastre e mescolare brevemente a 1000 giri al minuto. Posizionare un vassoio di raccolta dei rifiuti sotto una piastra di estrazione in fase solida a 96 pozzetti con scambio cationico a modalità mista, o piastra SPE, nella camera del manifold per piastre di estrazione. Successivamente, condizionare il sorbente SPE aggiungendo 0,2 millilitri di metanolo in ogni pozzetto.

Quindi, equilibrare il sorbente aggiungendo 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ogni pozzetto. Utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire tutti i campioni dalla piastra a pozzetti profondi alla piastra per SPE. Successivamente, lavare il sorbente due volte dopo il passaggio dei campioni, aggiungendo 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ogni pozzetto.

Dopo che il solvente di lavaggio è stato eluito dal sorbente, sostituire il vassoio del serbatoio con provette. A questo punto, eluire il campione dal sorbente aggiungendo due aliquote da 50 microlitri di acetonitrile al 75% e ammoniaca concentrata al 10%, tenendo presente che questa soluzione richiede un vuoto molto basso per passare attraverso il sorbente. Essiccare gli eluati mediante centrifugazione sotto vuoto senza applicare calore.

Infine, sigillare le provette e congelarle a 80 gradi Celsius fino all'analisi. I campioni di calibrazione sono vicini alla retta di regressione con basse deviazioni standard. Se la calibrazione è non lineare, la corsa deve essere scartata e la deviazione è molto probabilmente dovuta a tecniche errate di pipettaggio e/o errori nella diluizione dei campioni di calibrazione.

Il coefficiente di variazione delle repliche dovrebbe preferibilmente essere inferiore al 10%. I segnali nativi di 15N e 13C di una beta eluiscono dalla colonna LC contemporaneamente, con picchi quasi simmetrici e senza allungamento significativo della coda. Per ciascun picco dovrebbero essere effettuate almeno 10 misurazioni, regolabili impostando un tempo massimo di iniezione nel metodo. I peptidi possono essere misurati contemporaneamente durante l'analisi MS, a meno che la sensibilità del metodo non sia subottimale; in tal caso, per ogni iniezione dovrebbero essere misurati soltanto i peptidi di interesse.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di saturare sempre le punte della pipetta prima di trasferire la soluzione peptidica. È inoltre fondamentale utilizzare provette con il minor volume morto possibile.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della malattia di Alzheimer per esplorare la concordanza con altri metodi, come la tomografia a emissione di positroni (PET) per l'amiloide. È stata inoltre utilizzata per assegnare concentrazioni di beta 142 a materiali di riferimento basati sul liquido cerebrospinale (CSF). Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i calibratori in CSF umano e di come utilizzare l'estrazione in fase solida prima dell'analisi mediante LCMS per misurare la concentrazione assoluta di beta 142 nei campioni.

Non dimenticare che lavorare con il liquido cefalorachidiano umano può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti, occhiali protettivi e altre misure di sicurezza devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.