Name: Quantificazione assoluta di A? 1-42 In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri la quantificazione assoluta di Aβ1-42 nel liquido cerebrospinale umano mediante estrazione in fase solida e spettrometria di massa LC-MS/MS. Questo metodo validato standardizza i saggi per la ricerca sull'Alzheimer.

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Questo lavoro è stato svolto per conto del Gruppo di Lavoro della Federazione Internazionale di Chimica Clinica sulle Proteine CSF, che ha la seguente composizione: Kaj Blennow (Presidente) e Henrik Zetterberg, Università di Göteborg, Svezia; Les Shaw e Magdalena Korecka, Università di Filadelfia, PA, USA; Ingrid Zegers, Istituto per i materiali e le misure di riferimento, Geel, Belgio; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Germania; e Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Università di Washington, MO, Stati Uniti; e H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gand, Belgio. Questo lavoro è stato anche parte del Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, guidato da Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer's Association. Lo studio è stato sostenuto dal Consiglio svedese delle ricerche (sovvenzioni #14002, #521-2011-4709 e #2013-2546); la Fondazione Knut e Alice Wallenberg; Demensförbundet; e le fondazioni di Emil e Wera Cornell, Aina Wallström e Mary-Ann Sjöblom, Gun e Bertil Stohne, Magnus Bergvall e Gamla Tjänarinnor.

NOTA: Questo protocollo richiede aliquote di almeno 50 ml, con una concentrazione di 50 mg / ml per ciascun peptide Ap, come materiale di partenza. I peptidi Ap vanno dissolte in 20% acetonitrile (ACN) e il 4% di soluzione di ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) e conservati a 80 ° C. Attenzione: Vedi Tabella 1 per le informazioni di sicurezza. 1. preparazione delle soluzioni <ol><li> Preparare 100 ml di 20% ACN e 4% ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) diluendo 20 mL di ACN e 4 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Fare fresco tutti i giorni. </li><li> Preparare 50 mL di 5 M guanidina cloridrato sciogliendo 26,08 g di guanidina cloridrato in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml. Conservare a 20 ° C e fare mensile fresco. </li><li> Preparare 200 ml di acido fosforico 4% in acqua deionizzata (v /v) diluendo 9,4 mL di acido fosforico concentrato (~ 85%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 200 ml con acqua deionizzata. Conservare in frigorifero e fare settimanale fresco. </li><li> Preparare 50 mL di 75% ACN e ammoniaca concentrata 10% (v / v) in acqua deionizzata diluendo 37,5 mL di ACN e 5 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale di 50 ml con acqua deionizzata. Fare fresco tutti i giorni. </li><li> Scongelare almeno 2,5 ml di CSF umano per i calibratori, ottenuti da campioni avanzi de-identificato da analisi cliniche di routine. </li><li> Preparare CSF artificiale contenente 150 mM Na, 3,0 mM K, 1.4 mM Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P, e 155 mM Cl in acqua deionizzata e aggiungere sieroalbumina bovina ad una concentrazione finale di 4 mg / mL. Solo 1 ml è necessaria per l&#39;analisi, ma preparare un grande volume, un&#39;aliquota di esso, e conservare per uso futuro. </li></ol> 2. Preparazione dei calibratori <ol><li> Preparare 0,5 ml di 4 mg / ml 15 NAβ 1-42 peptide aggiungendo 40 ml di 50 mg / mL 15 NAβ 142 al 0.46 mL di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da 0,5 ml. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li><li> Preparare 2 mL di 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 peptide aggiungendo 50 ml di 4 mg / mL 15 NAβ 142 al 1.95 mL di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta 2 mL. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li><li> Preparare sei soluzioni calibratori (AF) mescolando i volumi di ogni soluzione indicata nella tabella 2. Utilizzare 0.5, 1.5, e 2 tubi ml microcentrifuga. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li><li> Preparare i calibratori finali (in duplicato) in 0,5 ml microprovette con l&#39;aggiunta delle soluzioni di taratura corrispondenti e CSF umano secondo la Tabella 3. Mix su un vortex per 1 minuto. </li></ol> 3. Preparazione dello standard interno <ol><li> Preparare 2 ml di 0,8 mg / mL 13 CAβ 1-42 peptide aggiungendo 32 ml di 50 mg / mL 13 CAβ 142 al 1.968 ml di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta 2 mL. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li><li> Preparare 5 ml di 16 ng / mL 13 CAβ 1-42 peptide aggiungendo 0,1 ml di 0,8 mg / ml a 4,9 ml di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da microcentrifuga 5. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li></ol> 4. Preparazione del campione Fattore di risposta NOTA: Il fattore di risposta (RF) determinazione è eseguita per determinare la concentrazione del peptide marcato usato per la calibrazione (15 NAβ 1-42). Ciò richiede che la concentrazione del nativo Ap 1-42 peptide è stata determinata tramite analisi amminoacidica (AAA). Così, il volume e la concentrazione di nativi aliquote peptide Ap 1-42necessità di soddisfare i requisiti del AAA. <ol><li> Preparare 0,5 ml di 4 mg / ml nativo (senza etichetta) Ap 1-42 con l&#39;aggiunta di 40 ml di 50 mg / ml nativo Ap 1-42 a 0,46 ml del 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da 0,5 ml. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li><li> Preparare un 2-ml 40 ng mL mix di nativi e 15 NAβ 1-42 / aggiungendo 20 ml di 4 mg / ml nativo Ap 1-42 e 20 ml di 4μg / mL 15 NAβ 1-42 a 1,96 ml del 20% ACN e 4% concentrate di ammoniaca in una provetta da microcentrifuga 2. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 20 ml di 40 ng / mL mix di 0,38 ml di liquido cerebrospinale artificiale in una provetta 0,5 microcentrifuga. Preparare i duplicati e mescolare su un vortex per 1 minuto. </li></ol> Preparazione del campione 5. NOTA: Scongelare i campioni da misurare a temperatura ambiente su un rullo stanza. <ol><li>Aggiungere 0,18 ml di ogni calibratore, fattore di risposta, e campione non noto (compreso il controllo di qualità [QC] campioni, se utilizzato) ad una piastra a 96 profondo bene 1 proteina mL, secondo la figura 1 (assumendo un piatto pieno è utilizzato). Assicurarsi di aggiungere i campioni in, o in prossimità, il fondo dei pozzetti. </li><li> Aggiungere 20 ml di standard interno ad ogni pozzetto (ad esempio, calibratori, i fattori di risposta, QC, e le incognite); è fondamentale per rilasciare la goccia sul lato del pozzo vicino alla superficie del campione senza immergendo la punta della pipetta. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di 5 M guanidina-cloridrato in ciascun pozzetto. </li><li> Posizionare il piatto del campione, un vortex e miscelare i campioni per 45 min a 1100 rpm. La frequenza ottimale potrebbe differire a seconda della strumentazione. Impostare la frequenza e l&#39;ampiezza del mixer in modo che le soluzioni sono accuratamente miscelati e non gocce di standard interno o CSF ​​sono lasciati non miscelato sul lato dei pozzetti. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di acido fosforico 4%in ciascun pozzetto. Vortex mescolare brevemente. </li></ol> 6. estrazione in fase solida NOTA: In tutte lavaggio, carico, e passi di eluizione, applicare il vuoto più basso possibile, dopo l&#39;aggiunta della soluzione e aumentare gradualmente come necessario per caricare o eluire la soluzione. Disabilitare il vuoto tra ogni carico e passo eluizione. <ol><li> Mettere un vassoio di serbatoio per i rifiuti sotto una modalità mista, scambio cationico, 96 pozzetti estrazione in fase solida (SPE) placca nella camera di collettore piatto di estrazione. </li><li> Condizionare la assorbente SPE con l&#39;aggiunta di 0,2 ml di metanolo ad ogni pozzetto. </li><li> Equilibrare il sorbente aggiungendo 0,2 mL di acido fosforico 4% a ciascun pozzetto. </li><li> Trasferire tutti i campioni (circa 0,62 ml in ogni pozzetto) dalla piastra profondo bene alla piastra SPE. Utilizzare una pipetta a otto canali per il trasferimento dei campioni dalla piastra profondo bene alla piastra SPE; non è cruciale per la trasmissione completa o volumi uguali di tutti i campioni, poiché i campioni contengono un internoal standard che compensare le variazioni. </li><li> Lavare il sorbente dopo i campioni hanno attraversato aggiungendo 0,2 mL di acido fosforico 4% a ciascun pozzetto. </li><li> Dopo che il solvente di lavaggio è eluito dalla sorbente, sostituire il vassoio serbatoio con una piastra di raccolta o tubi. </li><li> Eluire il campione dalla sorbente di due volte aggiungendo 50 ml di 75% ACN / 10% ammoniaca concentrata e notare che questa soluzione richiede molto basso vuoto per passare attraverso l&#39;assorbente. Ricordarsi di disattivare il vuoto tra ogni aggiunta. <ol><li> OPTIONAL: Sigillare la piastra di raccolta o tubi e congelarli a -80 ° C. Rimuovere il sigillo dalla piastra raccolta o tubi prima di procedere al punto 6.8.2. </li><li> Asciugare le eluati utilizzando centrifugazione a vuoto (senza applicazione di calore); questo può richiedere da una a diverse ore, a seconda della centrifuga a vuoto. </li><li> Sigillare i contenitori e congelarli a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. chromato Liquidgrafia <ol><li> Preparare fase mobile A (5% ACN e ammoniaca concentrata 0,3% in acqua deionizzata [v / v]), B (acqua deionizzata 4% e ammoniaca concentrata 0,1% in ACN [v / v]), e lavaggio dell&#39;ago (50% ACN e 4% concentrato ammoniaca in acqua deionizzata [v / v]). <ol><li> Per 500 ml di fase mobile A, aggiungere 25 ml di ACN e 1,5 ml di ammoniaca concentrata di acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 500 ml con acqua deionizzata. </li><li> Per 500 ml di mobili fase B, aggiungere 500 ml di ammoniaca concentrata e 25 ml di acqua deionizzata ad ACS. Regolare il volume finale di 500 ml con ACN. </li><li> Preparare 250 ml di lavaggio dell&#39;ago aggiungendo 120 mL di ACN e 10 ml di ammoniaca concentrata di acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 250 ml con acqua deionizzata. </li><li> Mettere il fasi mobili A e B e lavare l&#39;ago bottiglie aperte in un bagno di ultrasuoni per 20 minuti prima di utilizzarlo con il sistema LC </li></ol></li><li> Sciogliere ogni campione con 25 ml di 20% ACN e il 4% Concentrasoluzione di ammoniaca Ted e metterli su un agitatore per 20 min. Centrifuga verso il basso i campioni e metterli nel campionatore automatico (tenere a 7 ° C). </li><li> Iniettare 20 ml di campione su un 1 x 250 mm 2 polistirene-divinilbenzene (fase inversa) colonna monolitica mantenuta a 50 ° C. <ol><li> Utilizzare il gradiente LC mostrato nella Tabella 4 con una portata di 0,3 mL / min. Deviazione i primi due e gli ultimi cinque minuti sprecare (post-colonna) mediante una valvola di deviazione per ridurre la contaminazione dello spettrometro di massa. </li></ol></li></ol> Analisi 8. Messa spettrometrica NOTA: Questi parametri sono stati utilizzati per uno spettrometro di massa ibrido quadrupolo-Orbitrap dotato di aheated sorgente di ionizzazione elettrospray. <ol><li> Impostare i parametri per la sorgente di ioni secondo la tabella 5. </li><li> Impostare lo strumento MS per isolare i 4+ carica stati di natale Ap 1-42 (1,129.48 di massaa-charge ratio [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), e 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) nell&#39;analizzatore di massa a quadrupolo con una larghezza isolamento di 2,5 m / z. </li><li> Frammentare i peptidi isolati nella cella di collisione con un&#39;energia di collisione normalizzata (NCE) di 17,0. Questo potrebbe essere necessario sintonizzati per ogni strumento, anche dello stesso tipo (e soprattutto se si utilizzano altri tipi di strumenti, come un triplo quadrupolo MS). </li><li> Registrare il spettri frammento con una risoluzione di 17.500, con un obiettivo di controllo automatico del guadagno di 2 x 10 5 cariche e un tempo massimo di iniezione di 250 ms. </li></ol> 9. Elaborazione dati <ol><li> Utilizzare la somma degli ioni prodotto (con una tolleranza massa di ± 250 unità di massa milli [MMU]) nella Tabella 6, per calcolare le aree cromatografiche per ciascun peptide. Si noti che i tipi di ioni ed i numeri sono indicati solo per Ap nativo <sub&gt; ioni 1-42 di prodotto, dal momento che sono gli stessi per entrambi 15 NAβ 1-42 e 13 CAβ 1-42. </li><li> Determinare il fattore di risposta media dei due campioni fattore risposta dividendo l&#39;area sotto la curva (picco cromatografico) del 15 NAβ 1-42 con l&#39;area sotto la curva del nativo Ap 1-42. </li><li> Regolare la concentrazione del 15 NAβ 1-42 utilizzata per la calibrazione, moltiplicandolo per il fattore di risposta calcolato nel passo 9.2. </li><li> Costruire una curva di taratura riportando i rapporti di superficie di 15 NAβ 1-42 al 13 CAβ 1-42 da due serie di calibratori contro la concentrazione. </li><li> Calcolare la pendenza e intercetta della curva di calibrazione utilizzando la regressione lineare. </li><li> Calcolare il rapporto di nativo Ap 1-42 area a standard interno (13 CAβ 1-42) per uncampioni noti. </li><li> Estrapolare la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla curva di calibrazione utilizzando la pendenza e l&#39;intercetta ottenuto nel passaggio 9.5. </li></ol>

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JP e EP non riferiscono alcuna divulgazione. HZ ha fatto parte dei comitati consultivi di Roche Diagnostics, Eli Lilly e Pharmasum Therapeutics. KB ha lavorato come consulente o nei comitati consultivi di Fujirebio Europe, IBL International e Roche Diagnostics. HZ e KB sono co-fondatori di Brain Biomarker Solutions a Göteborg AB, una società di piattaforme basata su GU Venture presso l'Università di Göteborg.

Per il metodo descritto, invece di utilizzare una matrice surrogata, abbiamo usato il metodo surrogata analita 13, 14, 15, 16, che consente la calibrazione in CSF umano. L&#39;approccio analita surrogato coinvolge due diversi standard marcati con isotopi. Uno (15 NAβ 142) è utilizzato per generare la curva di calibrazione in CSF umano, mentre un altro (13 CAβ <...

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e colpisce circa 35 milioni di persone in tutto il mondo 1. Le caratteristiche neuropatologici della malattia ampiamente creduto di essere al centro della patogenesi sono grovigli neurofibrillari intracellulari di hyperphosphorylated proteina tau 2 e placche extracellulari costituito da (Ap) peptidi 3 aggregati beta-amiloide. In linea con questo, la valutazione della patologia placca in vivo da biomarcatori è stato recentemente inserito nei criteri diagnostici di ricerca per AD 4. Per misurazioni CSF di Ap 1-42, vari test immunologici sono disponibili e sono utilizzati in molti laboratori clinici 5. La concentrazione di Ap 1-42 in CSF è inferiore di circa il 50% in pazienti con AD rispetto al cognitivo normale anziani, riflettendo la deposizione del peptide in placche nel brain 6, 7. Questi biomarcatori sono principalmente analizzati utilizzando saggi immunologici (ad esempio, le tecniche a base di anticorpi), ma questi test possono essere influenzati da effetti di matrice 8. L&#39;uso di saggi immunologici su piattaforme tecnologiche diverse e la mancanza di test di standardizzazione 9, 10 rende l&#39;introduzione di concentrazioni di cut-off globali difficili 11, 12. Un RMP analiticamente convalidato avrebbe permesso la calibrazione uniforme delle piattaforme di analisi diverse, idealmente con conseguente migliore comparabilità tra le piattaforme di analisi e in un migliore controllo dei fattori che contribuiscono alla variabilità complessiva di misura. La quantificazione assoluta di Ap 1-42 con il metodo LC-MS / MS sviluppata supera molti dei problemi connessi con tecn a base di anticorpiiques. Il metodo, indicato come un RMP dal comitato misto per la tracciabilità in Medicina di Laboratorio (JCTLM archivio di identificazione numero C11RMP9), sarà utilizzato per determinare la concentrazione assoluta di Ap 1-42 in un materiale di riferimento certificato (CRM) per armonizzare CSF Ap 1 misurazioni -42 attraverso tecniche e piattaforme analitiche. Il flusso di lavoro descritto deve essere rilevante per lo sviluppo di metodi di riferimento candidato per peptidi e proteine ​​all&#39;interno di altre aree della medicina.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL</td> Provette per microcentrifuga <td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind, 1,5 mL</td> Provette per microcentrifuga <td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind, 2 mL</td><td></td> Provette per microcentrifuga <td>Eppendorf</td> 022431102 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene Micronic da 0,75 mL,</td> provette <td>Micronic</td> MPW32071BC3 con fondo a V <td>utilizzate per la raccolta dell'eluato SPE, ma possono essere utilizzati altri dispositivi di raccolta, come le piastre a 96 pozzetti.</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in TPE diviso Micronic per tubi da 96 pollici</td> Tappi <td>MP53026</td><td>Micronic</td><td>per tubi Micronic.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 bianco con barra di copertura alta codificato</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Holder per provette Micronic.</td></tr><tr><td>Puntali Biohit Optifit 1,2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Utilizzati per raggiungere il fondo delle piastre LoBind deepwell (96 pozzetti). Anche altri suggerimenti stretti potrebbero funzionare.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96 pozzi &; Acque a placca di eluizione</td><td></td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waters Piastra collettore</td> serbatoio <td>vassoio Waters</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Waters Piastra di estrazione Collettore per Oasis Piastre a 96 pozzetti</td><td>Acque</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di ammonio, puriss. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado di gradiente HPLC UV lontano, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>acido orto-fosforico 85%, ACS, ISO, Reag. Merck</td><td>Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina cloridrato, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Spettrometro di massa Orbitrap ibrido a quadrupolo Q-exactive Thermo</td><td>Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Con Dionex Ultimate 3000 LC e autocampionatore in bundle.</td></tr><tr><td>Colonna monolitica Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina, polvere liofilizzata, adatta per (per biologia molecolare),</td> Beta-amiloide <td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td>non acetilata</tr><tr><td>(1-42), Ultra pura, TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-amiloide (1-42),</td><td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr> <tr><td>uniformemente marcato13C Beta-Amiloide (1-42), Agitatori</td> per micropiastre <td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td>uniformemente marcati</tr><tr><td>, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; HLER</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione assoluta di a?<sub&gt; 1-42</sub&gt; in csf utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

La malattia di Alzheimer (AD) è la malattia neurodegenerativa più comune tra gli anziani e rappresenta il 60-80% di tutti i casi di demenza. Attualmente, la diagnosi di AD si basa su test cognitivi ed esami dello stato mentale, ma il peptide amiloide-beta (Aβ) nel liquido cerebrospinale (CSF) è sempre più utilizzato negli studi clinici e in contesti. Come per la maggior parte dei biomarcatori proteici e peptidici, la quantificazione viene eseguita utilizzando tecniche basate su anticorpi, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Tuttavia, la variabilità intra e inter-laboratorio di questi test ne ostacola l'uso come marcatore diagnostico nella routine clinica.
È stata sviluppata una procedura di misurazione di riferimento (RMP) indipendente dagli anticorpi basata sull'estrazione in fase solida (SPE) e sulla cromatografia liquida (LC)-spettrometria di massa tandem (MS/MS), in cui sono stati utilizzati peptidi Aβ stabili marcati con isotopi come standard interni, consentendo la quantificazione assoluta. Per le misurazioni è stato utilizzato uno strumento ibrido quadrupolo-orbitrap ad alta risoluzione. Il metodo consente la quantificazione del liquido cerebrospinale Aβ1-42 tra 150-4.000 pg/mL.

Il setup piatto in Figura 1 è utilizzato per un piatto pieno di campioni. Se un minor numero di campioni sconosciuti sono da analizzare, il secondo calibratore, set RF, e QC deve essere posto dopo la prima metà dei campioni sconosciuti. Come si vede nella figura 2, i calibratori sono vicini alla linea di regressione, con basse deviazioni standard. Questo metodo ha un livello inferiore di quant...

Viene descritta una procedura di misura di riferimento per la quantificazione assoluta di Aβ1-42 nel liquido cerebrospinale umano basata sull'estrazione in fase solida e sulla spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida.

Quantificazione assoluta di A?<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura di misura di riferimento è armonizzare le misurazioni della beta nell'LC umano. Questo metodo può contribuire a standardizzare i saggi per la misurazione dell'a beta 42 nell'LC, un biomarcatore della patologia amiloide centrale e un reperto neuropatologico caratteristico della malattia di Alzheimer. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è stata accuratamente validata e non utilizza anticorpi per la quantificazione dell'AVR 142.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia di Alzheimer poiché potrebbe essere utilizzata per armonizzare i saggi e facilitare l'introduzione di livelli generali di cutoff nei trial clinici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patologia amiloide negli esseri umani, può essere applicato anche ad altri organismi mortali, come topi transgenici e primati non umani, per sviluppare nuovi farmaci. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché AVR 142 è molto idrofobico e può facilmente aderire a superfici come le punte delle pipette e le provette.Per prima cosa, aggiungere 40 microlitri di peptido beta N15 a 0,46 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto. Aggiungere 50 microlitri della soluzione peptidica a 1,95 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da due millilitri.Mescolare la soluzione peptidica con un agitatore vortex per un minuto. Successivamente, preparare sei soluzioni campione mescolando i volumi appropriati di ciascuna soluzione in provette per microcentrifuga. Dopo aver mescolato le soluzioni campione, preparare i campioni finali in duplicato mescolando i volumi appropriati delle corrispondenti soluzioni campione e LCR umano in provette da microcentrifuga da 0,5 millilitri.Mescolare ogni soluzione su un agitatore vortex per un minuto. Per preparare lo standard interno, aggiungere prima 32 microlitri di 13C a un peptide beta in 1,968 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da due millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto.Successivamente, aggiungere 0,1 millilitri della soluzione peptidica a 4,9 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da cinque millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto. Per preparare il campione del fattore di risposta, aggiungere 40 microlitri di peptido beta nativo a 0,46 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri.Dopo aver mescolato, aggiungere 20 microlitri della soluzione peptidica e 20 microlitri di peptido beta 15N a quattro microgrammi per millilitro in 1,96 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in un tubo microcentrifuga da due millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un agitatore vortex per un minuto. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della soluzione peptidica a 0,38 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri.Dopo aver preparato le duplicazioni, mescolare ogni soluzione su un agitatore vortex per un minuto. Dopo aver scongelato i campioni su un rullo, aggiungere 0,18 millilitri di ogni calibratore, fattore di risposta e campione incognito in una piastra proteica da 96 pozzetti profondi da un millilitro, assicurandosi di aggiungere i campioni sul fondo dei pozzetti o nelle immediate vicinanze. A questo punto, aggiungere 20 microlitri di standard interno in ogni pozzetto rilasciando una goccia dello standard sul lato del pozzetto vicino alla superficie del campione, senza immergere la punta della pipetta.Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di cloridrato di guanidina 5 M in ogni pozzetto. Posizionare la piastra campione su un agitatore per micropiastre e mescolare i campioni per 45 minuti a 1100 giri al minuto. Dopo il mescolamento, aggiungere 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ogni pozzetto.Quindi, posizionare la piastra del campione sullo shaker per micropiastre e mescolare brevemente a 1000 giri al minuto. Posizionare un vassoio di raccolta dei rifiuti sotto una piastra di estrazione in fase solida a 96 pozzetti con scambio cationico a modalità mista, o piastra SPE, nella camera del manifold per piastre di estrazione. Successivamente, condizionare il sorbente SPE aggiungendo 0,2 millilitri di metanolo in ogni pozzetto.Quindi, equilibrare il sorbente aggiungendo 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ogni pozzetto. Utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire tutti i campioni dalla piastra a pozzetti profondi alla piastra per SPE. Successivamente, lavare il sorbente due volte dopo il passaggio dei campioni, aggiungendo 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ogni pozzetto.Dopo che il solvente di lavaggio è stato eluito dal sorbente, sostituire il vassoio del serbatoio con provette. A questo punto, eluire il campione dal sorbente aggiungendo due aliquote da 50 microlitri di acetonitrile al 75% e ammoniaca concentrata al 10%, tenendo presente che questa soluzione richiede un vuoto molto basso per passare attraverso il sorbente. Essiccare gli eluati mediante centrifugazione sotto vuoto senza applicare calore.Infine, sigillare le provette e congelarle a 80 gradi Celsius fino all'analisi. I campioni di calibrazione sono vicini alla retta di regressione con basse deviazioni standard. Se la calibrazione è non lineare, la corsa deve essere scartata e la deviazione è molto probabilmente dovuta a tecniche errate di pipettaggio e/o errori nella diluizione dei campioni di calibrazione.Il coefficiente di variazione delle repliche dovrebbe preferibilmente essere inferiore al 10%. I segnali nativi di 15N e 13C di una beta eluiscono dalla colonna LC contemporaneamente, con picchi quasi simmetrici e senza allungamento significativo della coda. Per ciascun picco dovrebbero essere effettuate almeno 10 misurazioni, regolabili impostando un tempo massimo di iniezione nel metodo. I peptidi possono essere misurati contemporaneamente durante l'analisi MS, a meno che la sensibilità del metodo non sia subottimale; in tal caso, per ogni iniezione dovrebbero essere misurati soltanto i peptidi di interesse.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di saturare sempre le punte della pipetta prima di trasferire la soluzione peptidica. È inoltre fondamentale utilizzare provette con il minor volume morto possibile.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della malattia di Alzheimer per esplorare la concordanza con altri metodi, come la tomografia a emissione di positroni (PET) per l'amiloide. È stata inoltre utilizzata per assegnare concentrazioni di beta 142 a materiali di riferimento basati sul liquido cerebrospinale (CSF). Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i calibratori in CSF umano e di come utilizzare l'estrazione in fase solida prima dell'analisi mediante LCMS per misurare la concentrazione assoluta di beta 142 nei campioni.Non dimenticare che lavorare con il liquido cefalorachidiano umano può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti, occhiali protettivi e altre misure di sicurezza devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Fonte: Samuels, D. J., et al. Un approccio basato su cromatografia liquida tandem e spettrometria di massa per l'analisi dei metaboliti dello Staphylococcus aureus. J. Vis. Esp. (2017)Questo video dimostra l'uso della cromatografia liquida–spettrometria di massa per identificare e quantificare i metaboliti intracellulari di S. aureus. Descrive le fasi coinvolte nell'estrazione dei metaboliti, nella normalizzazione dei peptidi, nella cromatografia liquida e nell'analisi della spettrometria di...

Un approccio basato sulla cromatografia liquida e la spettrometria di massa per l'analisi dei metaboliti di S. aureus

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A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

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Quantificazione assoluta di A?

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