Quantificazione assoluta di A? _1-42 In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

L'obiettivo generale di questa procedura di misurazione di riferimento è quello di armonizzare le misurazioni di un beta nel liquido cerebrospinale umano. Questo metodo può aiutare a standardizzare i test per la misurazione del liquido cerebrospinale a beta 42, che è un biomarcatore per la patologia dell'amiloide centrale e segno distintivo neuropatologico della malattia di Alzheimer. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è accuratamente convalidata e non utilizza anticorpi per la quantificazione di AVR 142.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'Alzheimer perché verrebbe utilizzata per armonizzare i test e facilitare l'introduzione di livelli di cut-off generali negli studi clinici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patologia amiloide negli esseri umani, può essere applicato anche ad altri organismi mortali come topi transgenici e primati non umani per venerare nuovi farmaci. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché AVR 142 è molto idrofobico e può facilmente attaccarsi a superfici come puntali e tubi.

Innanzitutto, aggiungere 40 microlitri di peptide N15 a beta a 0,46 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un miscelatore a vortice per un minuto. Aggiungere 50 microlitri della soluzione peptidica a 1,95 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.

Mescolare la soluzione peptidica su un miscelatore a vortice per un minuto. Quindi, preparare sei soluzioni di calibrazione mescolando i volumi appropriati di ciascuna soluzione in provette per microcentrifuga. Dopo aver miscelato le soluzioni del calibratore, preparare i calibratori finali in duplice copia mescolando i volumi appropriati delle corrispondenti soluzioni del calibratore e del liquido cerebrospinale umano in provette da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Mescolare ogni soluzione su un miscelatore a vortice per un minuto. Per preparare lo standard interno, aggiungere prima 32 microlitri di peptide beta 13C a 1,968 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un miscelatore a vortice per un minuto.

Quindi, aggiungere 0,1 millilitri della soluzione peptidica a 4,9 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in una provetta da microcentrifuga da cinque millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un miscelatore a vortice per un minuto. Per preparare il campione del fattore di risposta, aggiungere 40 microlitri di peptide beta nativo a 0,46 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Dopo la miscelazione, aggiungere 20 microlitri della soluzione peptidica e 20 microlitri di quattro microgrammi per millilitro, 15N un peptide beta a 1,96 millilitri di acetonitrile al 20% e ammoniaca concentrata al 4% in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Mescolare la soluzione peptidica su un miscelatore a vortice per un minuto. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della soluzione peptidica a 0,38 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Dopo aver preparato i duplicati, mescolare ogni soluzione su un miscelatore a vortice per un minuto. Dopo aver scongelato i campioni su un rullo, aggiungere 0,18 millilitri di ciascun calibratore, fattore di risposta e campione sconosciuto a una piastra a pozzetti profondi protein 96 da un millilitro, assicurandosi di aggiungere i campioni all'interno o vicino al fondo dei pozzetti. Ora, aggiungere 20 microlitri di standard interno a ciascun pozzetto rilasciando una goccia di standard sul lato del pozzetto vicino alla superficie del campione senza immergere la punta della pipetta.

Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di guanadina cloridrato a cinque molari in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra del campione su un agitatore per micropiastre e mescolare i campioni per 45 minuti a 1100 giri/min. Dopo la miscelazione, aggiungere 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% in ciascun pozzetto.

Quindi, posizionare la piastra del campione sull'agitatore per micropiastre e mescolare brevemente a 1000 giri/min. Posizionare un vassoio di riserva per i rifiuti sotto un'estrazione in fase solida a 96 pozzetti a scambio cationico in modalità mista, o piastra SPE nella camera del collettore della piastra di estrazione. Quindi, condizionare il sorbente SPE aggiungendo 0,2 millilitri di metanolo a ciascun pozzetto.

Quindi, equilibrare l'assorbente aggiungendo 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% a ciascun pozzetto. Utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire tutti i campioni dalla piastra a pozzetti profondi alla piastra SPE. Successivamente, lavare l'assorbente due volte dopo che i campioni sono passati aggiungendo 0,2 millilitri di acido fosforico al 4% a ciascun pozzetto.

Dopo che il solvente di lavaggio è stato eluito dal sorbente, sostituire la vaschetta del serbatoio con dei tubi. Ora, eluire il campione dal sorbente aggiungendo due aloquat da 50 microlitri di acetonitrile al 75% e ammoniaca concentrata al 10%, notando che questa soluzione richiede un vuoto molto basso per passare attraverso il sorbente. Asciugare gli eluati utilizzando la centrifugazione sottovuoto senza applicare calore.

Infine, sigillare le provette e congelarle a 80 gradi Celsius fino all'analisi. I calibratori sono vicini alla linea di regressione con basse deviazioni standard. Se la taratura non è lineare, la seduta deve essere scartata e la deviazione è molto probabilmente dovuta a tecniche di pipettaggio errate e/o errori nella diluizione dei calibratori.

Il coefficiente di variazione delle repliche dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 10%Il 15N e il 13C nativi a eluito beta dalla colonna LC simultaneamente con picchi vicini a simmetrici e senza code significative. Devono essere eseguite almeno 10 misurazioni per ogni picco e possono essere regolate con un tempo massimo di iniezione nel metodo. I peptidi possono essere misurati contemporaneamente durante l'analisi MS a meno che la sensibilità del metodo non sia subottimale, in cui solo i peptidi di interesse dovrebbero essere misurati per ogni iniezione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di saturare sempre i puntali della pipetta prima di trasferire la soluzione peptidica. È anche importante utilizzare tubi con il minor volume di vuoto possibile.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della malattia di Alzheimer per esplorare la concordanza con altri metodi, come l'imaging PET amiloide. È stato anche utilizzato per assegnare una concentrazione di beta 142 a materiali di riferimento basati su CSF. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i calibratori nel liquido cerebrospinale umano e utilizzare l'estrazione in fase solida prima dell'analisi LCMS per misurare la concentrazione assoluta di un beta 142 nei campioni.

Non dimenticare che lavorare con il liquido cerebrospinale umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come guanti, occhiali protettivi e altre misure di sicurezza.