Saggi di elettrochemiluminescenza autoanticorpi anti-umano dell'isolotto

Qui, abbiamo presentato i metodi per rilevare i autoantibodies di insule umane utilizzando dosaggi di elettrochemiluminescenza (ECL). Il protocollo usato per predire il diabete di tipo 1, può essere estesa, per rilevare gli autoanticorpi per altre malattie autoimmuni.

L'obiettivo generale di questo test di elettrochemiluminescenza è quello di rilevare gli atutoanticorpi delle isole nel diabete autoimmune di tipo uno, con elevata sensibilità e alta specificità. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del diabete di tipo uno, come il momento di inizio dell'autoimmunità delle isole e la previsione ad alto rischio per il diabete di tipo uno. Il vantaggio principale di questa tecnica è una maggiore sensibilità, più specifica per la malattia e non radioattiva rispetto agli attuali test radiologici standard.

L'implicazione di questa tecnica si estende alla previsione e alla diagnosi del diabete di tipo 1 perché questi autoanticorpi delle isole insulari compaiono mesi o anni prima della malattia clinica sintomatica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla previsione del diabete di tipo uno, può anche essere applicato per studiare altre malattie autoimmuni, come gli autoanticorpi contro la transglutaminasi per la celiachia e la tireoglobulina per la malattia autoimmune della tiroide e molti altri. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che la tecnica si basa su un'alta sensibilità e non radioattività.

A differenza del metodo ELISA convenzionale che non funziona bene per la rilevazione di autoanticorpi delle isole insulari. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il dosaggio degli autoanticorpi dell'insulina con il trattamento con acido sierico è difficile da descrivere nel testo. A dimostrare la procedura sarà Yong Gu, un postdoc del mio laboratorio.

Innanzitutto, mescolare l'autoantigene delle isole umane con la biotina o SULFO-TAG in un rapporto da uno a cinque molari in una provetta. E copri il tubo con un foglio di alluminio poiché entrambi i tag sono sensibili alla luce. Quindi, incubare la provetta per un'ora a temperatura ambiente.

Nel frattempo, quando l'incubazione è in corso, la colonna di centrifuga con soluzione salina tamponata con fosfato due volte. Quindi, centrifugare la colonna a 1.000 volte la gravità per due minuti ogni volta. Quindi, centrifugare la miscela di tag dell'autoantigene nella colonna di centrifuga a 1.000 volte la gravità per due minuti.

Quindi, aliquotare e conservare l'antigene marcato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare la concentrazione razionale dell'antigene marcato con biotina SULFO-TAG in base al test a scacchiera per il tampone antigenico, per preparare tre millilitri di soluzione antigenica per piastra a 96 pozzetti. Quindi, in ogni pozzetto, aggiungere quattro microlitri di siero e regolare il volume finale a 20 microlitri con una piega di soluzione salina tamponata con fosfato.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di soluzione antigenica marcata in ciascun pozzetto. E coprire il piatto con un foglio sigillante per evitare la luce. Quindi, trasferire il piatto su uno shaker a temperatura ambiente per due ore.

Una volta che lo shaker si ferma, lasciare il piatto a quattro gradi Celsius in frigorifero per 18-24 ore. Ora, mescolare 15 microlitri di siero con 18 microlitri di acido acetico 0,5 molare per ogni campione e incubare lo stesso a temperatura ambiente per 45 minuti. Sulla base del test a scacchiera, utilizzare la concentrazione razionale dell'antigene marcato con biotina SULFO-TAG per preparare la soluzione antigenica.

Quindi, aliquotare 35 microlitri di tampone antigenico in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR. Poco prima che il ciclo di incubazione della miscela di siero sia completato, aggiungere 3,8 microlitri di un tampone Tris molare a PH nove, accanto a ciascun pozzetto sulla piastra dell'antigene. Una volta terminata l'incubazione, trasferire rapidamente 25 microlitri di siero trattato con acido acetico in ciascun pozzetto della piastra antigenica e agitare la soluzione.

Quindi, coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce e posizionarla su uno shaker a temperatura ambiente per due ore. Una volta fatto, trasferire la piastra a quattro gradi Celsius in frigorifero e incubare per 18-24 ore. Togliete una piastra di streptavidina dal frigorifero a quattro gradi Celsius e lasciate che la piastra raggiunga la temperatura ambiente.

Dopo che la piastra per streptavidina ha raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere 150 microlitri di bloccante A al 3% in ciascun pozzetto e coprire la piastra PCR con un foglio sigillante e incubare in frigorifero per una notte. Il giorno successivo rimuovere la piastra di streptavidina dal frigorifero ed espellere il tampone dai pozzetti. Quindi, asciugare il piatto mettendolo a testa in giù su della carta assorbente per far assorbire il tampone rimasto.

Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone PBST a piega singola per lavare il pozzetto per tre lavaggi consecutivi. Successivamente, trasferire 30 microlitri di antigene sierico incubare in ciascun pozzetto della piastra per streptavidina e coprire la piastra con un foglio per evitare la luce. Quindi, trasferire il piatto su uno shaker a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo un'ora, scartare l'antigene sierico incubato dalla piastra e aggiungere 150 microlitri di tampone PBST in una piega per lavare il pozzetto per tre volte. Una volta terminato il lavaggio, aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura in ogni pozzetto da leggere su un lettore di piastre. Prima di analizzare i campioni sconosciuti, è stato impostato il cutoff per ciascun test degli autoanticorpi testando circa 100 pazienti con diabete di tipo uno e circa 100 controlli sani.

Quindi, è stata tracciata una curva ROC per determinare l'indice ottimale del limite superiore della norma per il test GADA, che era 0,023, in modo da ottenere la migliore sensibilità e specificità. Quindi, il risultato del campione sconosciuto è stato calcolato utilizzando un'equazione derivata da standard di controllo positivi alti, positivi bassi e negativi. Successivamente, è stato tracciato un grafico per determinare i segnali ottenuti nel test dell'autoaticorpo insulare sull'incubazione dell'anticorpo monoclonale dell'insulina con siero umano normale in presenza e assenza di trattamento acido.

Il grafico mostra che il segnale è marcatamente bloccato dopo l'aggiunta di siero normale in assenza di trattamento acido. Al contrario, il segnale ottenuto è comparabilmente più alto quando il siero viene sottoposto a trattamento acido prima dell'incubazione con l'anticorpo monoclonale insulina. Un grafico simile è stato anche tracciato per determinare i segnali ottenuti utilizzando Sieri di pazienti estranei in presenza e assenza di trattamento acido.

Il trattamento del paziente con acido prima dell'incubazione con l'anticorpo aumenta significativamente i segnali nel test degli autoanticorpi delle isole se confrontato in assenza di trattamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere facilmente eseguita per diverse centinaia di campioni in un giorno se preformata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire il test a scacchiera per ciascun test degli autoanticorpi per ottimizzare le condizioni del test.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del diabete autoimmune di tipo uno per la previsione e la prevenzione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della facilità con cui eseguire questo test. Non dimenticare che lavorare con campioni di siero può essere pericoloso e contagioso.

Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese precauzioni per evitare il contatto diretto con la pelle.