Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.

Il microarray di antigene influenzale consente la misurazione simultanea di isotipi di anticorpi multipli contro più di 300 ceppi di influenza da un piccolo volume di campioni di sangue di un solo microlitro. Il microarray facilita una misurazione ad alta produttività dell'ampiezza degli anticorpi influenzali attraverso il paesaggio antigenico dei ceppi influenzali. Caratterizzando gli anticorpi influenzali in modo più dettagliato di quanto fosse stato possibile in precedenza, questo microarray può aiutare a determinare perché alcune persone sviluppano un'infezione influenzale e altre no.

La tecnica del microarray antigene è stata applicata a 35 diversi agenti patogeni nel nostro laboratorio, consentendo la misurazione degli anticorpi contro 60.000 bersagli di antigeni e da 50.000 campioni di siero raccolti da casi di malattie infettive e controlli sani in tutto il mondo. Dopo aver insegnato questa tecnica attraverso workshop di persona, abbiamo scoperto che essere in grado di dimostrare visivamente la tecnica è fondamentale per la sua comprensione e le sue prestazioni. A dimostrare la procedura saranno Al Jasinskas e Rafael De Assis, scienziati del nostro laboratorio.

Per stampare antigeni utilizzando una stampante microarray, selezionare una stampante con perni di avvistamento microarray a basso volume in grado di aspirare gli antigeni da una piastra sorgente a 384 po 'nel canale del campione e depositare gli antigeni tramite contatto diretto e azione capillare su vetri rivestiti in nitrocellulosa a 16 pad. Nel software di stampa, immettere il numero di lastre campione che verranno utilizzate nel numero di lastre di testo e selezionare il tipo di lastra che verrà utilizzata per l'analisi. Selezionare una configurazione pin e impostare gli offset di origine sulle distanze tra l'origine della diapositiva e la posizione in cui i perni di stampa inizieranno a stampare sulle diapositive.

Nella scheda progettazione matrice definire le dimensioni e la forma delle matrici e selezionare i parametri per il modo in cui i pin di stampa prelevano e erogano i campioni. Configurare i protocolli di pulizia e blotting dei pin e definire la sequenza in cui i blocchi di esempio vengono stampati sulle diapositive. Il software array costruirà un file di indice della griglia annotato per descrivere la disposizione degli antigeni all'interno di ogni microarray.

Dopo aver programmato il software di stampa con il protocollo desiderato, avviare l'esecuzione della stampa. Una volta completato, posizionare le diapositive di microarray non protessate in una scatola a prova di luce in un armadio essiccatore a temperatura ambiente. Per sondare i sieri per gli anticorpi sul microarray, utilizzare le clip per attaccare il lato del pad di diapositive microarray sulle camere di sondaggio e posizionare le camere nei fotogrammi.

Fare attenzione quando si assemblano le diapositive, in quanto sono facilmente rotte e verificare la presenza di eventuali perdite dopo la reidratazione. Se necessario, smontare e rimontare le diapositive per correggere le perdite. Reidratare le diapositive con 100 microlitri di tampone di blocco filtrato per pozzo e diluire i sieri con un rapporto uno a 100 in 100 microlitri di tampone di blocco per campione.

Quindi, incubare i vetrini di microarray reidratati e i sieri diluiti per 30 minuti a temperatura ambiente e da 100 a 250 rotazioni al minuto su uno shaker orbitale. Al termine dell'incubazione, utilizzare punte di pipetta collegate a una linea di vuoto con un pallone di raccolta secondario per aspirare con cura il tampone di blocco dall'angolo di ogni camera senza toccare i cuscinetti e aggiungere immediatamente i sieri diluiti ai cuscinetti senza lasciare asciugare i cuscinetti. Quindi, posizionare i telai coperti in vassoi contenenti tovaglioli di carta umidi sigillati per mantenere l'umidità e incubare i telai durante la notte a quattro gradi Celsius su uno shaker a dondolo.

Per l'etichettatura degli anticorpi secondari coniugati a punti quantici, aspirare attentamente i sieri come appena dimostrato e risciacquare le diapositive con tre lavaggi in 100 microlitri di tampone TTBS fresco per pozzo per cinque minuti ciascuno su uno shaker orbitale. Le diapositive vengono quindi incubate con una miscela di anticorpi secondari coniugati a punti quantici e quindi lavate tre volte come descritto nel protocollo, utilizzando la stessa tecnica appena dimostrata. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere con cura gli scivoli dalle camere e sciacquare delicatamente gli scivoli con acqua distillata doppia filtrata e quindi posizionare ogni diapositiva in un tubo da 50 millilitri.

Quindi, asciugare le diapositive per centrifugazione. Per acquisire immagini delle diapositive di microarray, accendere prima l'imager portatile e posizionare con cura la diapositiva da stampare a faccia in giù nel supporto della diapositiva nella camera di imaging. Aprire il software di imaging e nella scheda Configura imager selezionare la configurazione diapositiva appropriata.

Sotto la scheda controllo immagine, selezionare il canale fluorescente appropriato e regolare i tempi di esposizione e acquisizione a seconda della reattività dei sieri. Quindi, fare clic su acquisisci per avviare l'acquisizione dell'immagine. Al termine dell'acquisizione, utilizzare le griglie orientate sui marcatori fiduciari per rilevare i punti dell'array.

Per misurare l'intensità dello spot, nel pannello informazioni sul file caricare il file gal e specificare la cartella in cui devono essere salvati i file di output dell'analisi nella sezione delle opzioni di analisi. Nella scheda controllo immagine aprire una delle immagini acquisite da quantificare e selezionare automaticamente. Nella sezione analisi matrice creare un modello fiduciario come indicato dal software.

Fare clic su analisi batch per selezionare la cartella contenente le immagini da quantificare e selezionare il modello fiduciario appena creato. Il software analizzerà ogni immagine e quantifirà l'intensità del punto. Quindi, analizzare i dati grezzi per confrontare il legame anticorpale tra gli antigeni e tra i campioni di siero.

In questo studio rappresentativo, gli anticorpi secondari utilizzati erano l'IgG anti-umano di capra coniugato con l'emissione di punti quantici a 800 nanometri e l'IgA anti-umano di capra coniugato con dot quantistico che emette a 585 nanometri per il rilevamento multiplex di anticorpi IgG e IgA rispettivamente. Nella mappa termica risultante, solo i sottotipi clinicamente rilevanti con alta rappresentazione sono stati etichettati per risparmiare spazio con il segno più che indica tutti i sottotipi rimanenti di un numero più alto. Il siero IgA e L'IgG sono stati raggruppati per le loro forme molecolari e sottotipi di emagglutinina e neuraminidasi.

Dimostrare l'elevata specificità degli anticorpi del gruppo della testa dell'emagglutinina per i sottotipi clinici e l'elevata reattività incrociata dell'emagglutinina intera e degli anticorpi dell'emagglutinina intera triamerizzata con l'inclusione della regione stock. Le risposte degli anticorpi influenzali misurate sul microarray possono essere confermate dalle tecniche tradizionali, tra cui l'inibizione dell'emoagglutinazione e i test di microneutralizzazione. Questa tecnica ha prodotto approfondimenti sulla specificità del sottotipo degli anticorpi per il gruppo della testa influenzale e sull'importanza relativa degli anticorpi IgA e IgG per la suscettibilità influenzale.

Sebbene nessuno dei materiali sia estremamente pericoloso, tutti i campioni di siero umano devono essere manipolati in conformità con i protocolli istituzionali di biosicurezza.