Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo

Questo manoscritto descrive un semplice protocollo per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi myography elettrofisiologici, imaging e pressione del calcio.

Capire come viene controllato il flusso sanguigno nella retina è un obiettivo importante, poiché il flusso sanguigno anomalo è stato implicato nello sviluppo di una varietà di malattie retiniche pericolose per la vista, come la retinopatia diabetica, il glaucoma e le occlusioni delle vene ramificate. Le arteriole retiniche svolgono un ruolo chiave nella regolazione del flusso sanguigno nella retina dilatando e restringendo il loro diametro luminale, mediato da cambiamenti nella contrattilità delle cellule muscolari lisce che circondano questi vasi. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della regolazione della perfusione retinica richiede quindi preparazioni in cui le cellule muscolari lisce arteriolari retiniche possano essere accessibili e studiate in condizioni il più vicino possibile alla fisiologia.

In questo video, dimostriamo un protocollo semplice per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi di patch clamp, imaging del calcio e miografia della pressione. Negli ultimi anni, questo preparato è stato utilizzato per fornire ulteriori informazioni sulla regolazione della contrattilità della muscolatura liscia vascolare e del flusso sanguigno nella retina sia in salute che in malattia. Preparare una soluzione da un litro di basso contenuto di calcio contenente Hanks'or LCH, come mostrato nella tabella dei materiali.

Assemblare l'attrezzatura di isolamento prima della raccolta del tessuto. La pipetta in vetro Pasteur deve essere lucidata a fuoco per levigare, ma non restringere la punta. Taglia una pipetta di plastica a un'apertura di circa cinque-sette millimetri.

Posizionare gli occhi sulla capsula di dissezione, immersa in una soluzione di ICL. Usa un set di pinze per ancorare l'occhio al piatto tenendo gli attacchi dei muscoli orbitali o il nervo ottico. Assicurarsi che il punto di ancoraggio sia il più vicino possibile alla sclera per stabilizzare l'occhio.

Usando la lama, tagliare la cornea lungo l'ora serrata e rimuovere la lente premendo delicatamente sulla sclera con una pinza. La piccola regione circolare che vediamo nella parte posteriore dell'occhio in questa immagine è il nervo ottico. Utilizzando la lama, tagliare l'oculare a metà simmetricamente attraverso il disco ottico.

Utilizzando una pinza chiusa, spazzolare delicatamente le retine dalle due metà dell'oculare, avendo cura di rimuovere eventuali attacchi rimanenti sul disco ottico. Ripetere il processo con il secondo occhio e trasferire le retine sezionate nella provetta utilizzando la pipetta di plastica e una piccola goccia di terreno ICL. Usando la pipetta di plastica, riempire la provetta con LCH fino a circa cinque millilitri e lasciare che le retine si depositino sul fondo della provetta.

Lavare il fazzoletto circa tre volte rimuovendo circa quattro millilitri di soluzione dalla provetta e aggiungendo ICL fresco utilizzando la pipetta di plastica. Se necessario, il tessuto estraneo deve essere rimosso. Lavare l'interno della pipetta Pasteur in vetro con punta lucidata con LCH per evitare che il fazzoletto si attacchi alla pipetta.

Utilizzando la stessa pipetta, rimuovere circa quattro millilitri di soluzione dalla provetta e aggiungere circa due millilitri di ICL fresco. Dissociare delicatamente le retine aspirando lentamente il tessuto attraverso la punta della pipetta di vetro ed espellere il contenuto nella provetta. Cerca di non introdurre bolle in questa fase e ripeti il processo fino a quando le retine non si rompono fino alla dimensione di circa due o tre millimetri quadrati.

Lavare l'interno della pipetta con circa due millilitri di ICL ed espellerlo nella provetta. Lasciare che il contenuto si depositi sul fondo per cinque-10 minuti. Ripetere il processo di triturazione come descritto in precedenza con un po' più di forza fino a quando i pezzi di tessuto non raggiungono una dimensione di circa un millimetro quadrato.

Lascia che il tessuto si depositi e ripeti ancora una volta con ancora più forza fino a quando il contenuto non è completamente omogeneizzato e non rimangono pezzi di retina. La soluzione in questa fase dovrebbe apparire lattiginosa. Questa tecnica produrrà fino a otto segmenti arteriolici per isolamento, misurando da 200 a 2.500 micrometri di lunghezza.

L'incannulamento di un'estremità dell'arteriola con occlusione dell'estremità opposta consente la misurazione della vasocostrizione indotta dalla pressione, nota anche come risposta miogenica. La miografia della pressione arteriolare viene eseguita come segue. Un'aliquota di omogenato retinico viene trasferita in una camera di registrazione fisiologica montata sul tavolino di un microscopio invertito.

Lasciare riposare l'omogeneizzato sul fondo della camera per almeno cinque minuti. Eseguire una scansione visiva attraverso la camera di registrazione per identificare le arteriole di lunghezza superiore a 200 micrometri e dotate di un'estremità aperta attraverso la quale il vaso può essere incannulato. Ancorare un'estremità del recipiente utilizzando una pinza fine e un piccolo filo di tungsteno posizionato sopra il recipiente.

Utilizzando le estremità sovrapposte del filo di tungsteno, manovrare il recipiente in modo che scorra orizzontalmente attraverso il bagno, in modo che l'estremità aperta sia in linea con la cannula di pressurizzazione. Perfondere la camera con Hanks' a zero calcio a 37 gradi Celsius. Gli incannulamento vengono eseguiti con pipette di vetro.

La cannula viene posizionata all'estremità aperta del vaso utilizzando un micromanipolatore a grana fine. La punta è posizionata immediatamente adiacente all'apertura, come valutato regolando il piano di messa a fuoco sul microscopio, in modo tale che sia l'estremità del vaso che la punta della cannula siano a fuoco contemporaneamente e la cannula di pressurizzazione avanzi nell'apertura del vaso. Una pipetta ausiliaria è necessaria per assistere il processo di incannulamento e viene utilizzata per trattenere delicatamente l'arteriola e guidare la parete arteriolare sopra la cannula di pressurizzazione nello stesso momento in cui la cannula viene fatta avanzare nel lume del vaso.

Questa procedura richiede un movimento simultaneo e controllato di entrambi i manipolatori e una vasta pratica per ottenere un alto tasso di successo. Dopo un minuto di registrazione a zero millimetri di mercurio, la pressione intraluminale viene aumentata a 40 millimetri di mercurio e il vaso dovrebbe dilatarsi rapidamente, confermando il successo dell'incannulamento. La vasocostrizione indotta dalla pressione, cioè la risposta miogenica, si svilupperà successivamente in un periodo di circa 15 minuti.

La registrazione del patch clamp dalle cellule muscolari lisce vascolari retiniche consente di studiare le correnti ioniche della membrana plasmatica che regolano il calcio intracellulare e quindi la contrattilità cellulare. La registrazione di cellule intere e di un singolo canale è possibile da singole cellule muscolari lisce ancora incorporate all'interno delle loro arteriole madri come segue. Le arteriole retiniche sono isolate e ancorate nella camera di registrazione con strisce di filo di tungsteno.

La lamina basale deve essere digerita per consentire la formazione di una tenuta ad alta resistenza tra la pipetta del cerotto e la membrana delle cellule muscolari lisce arteriolari. Le arteriole vengono superfuse con una serie sequenziale di soluzioni enzimatiche a 37 gradi Celsius, il che provoca anche il disaccoppiamento elettrico delle cellule adiacenti, come indicato dalle frecce sull'immagine. Il livello di digestione viene inizialmente valutato sulla separazione visiva degli strati endoteliale e della muscolatura liscia durante la fase della collagenasi.

La rimozione di eventuali filamenti rimanenti di lamina basale e/o neuropila periferica si ottiene spazzando attentamente le punte chiuse di una pinza sottile lungo la superficie del vaso. Per il bloccaggio dei patch, la punta della pipetta per patch viene posizionata verticalmente sopra la cellula di interesse e abbassata gradualmente utilizzando il movimento lento e fine del micromanipolatore per entrare in contatto con la membrana muscolare liscia arteriolare. Questo viene giudicato in base al movimento della cellula e a una variazione della resistenza della pipetta, misurata utilizzando un protocollo di test di tenuta cellulare nel software di acquisizione.

Quando la pipetta viene abbassata sulla cella, la resistenza di tenuta aumenterà di circa cinque volte. La pressione negativa viene applicata transitoriamente sul retro della pipetta e si forma gradualmente un gigaseal. Ciò richiede applicazioni ripetute di pressione negativa nel corso di uno o cinque minuti.

Per la registrazione di cellule intere, viene utilizzato prevalentemente il metodo del patch-clamp perforato. Un gigaseal è formato, come descritto in precedenza, con una pipetta contenente una soluzione intracellulare e amfotericina B. La resistenza all'accesso viene monitorata utilizzando il protocollo di test a membrana nel software di acquisizione. Una volta che la resistenza di accesso scende a meno di 15 megaohm, viene eseguita la compensazione della resistenza in serie.

Tipicamente è possibile compensare la resistenza in serie di circa il 75% in modalità patch perforata. I gradini di tensione o i protocolli di rampa possono quindi essere utilizzati per misurare le correnti dell'intera cella. Dopo la dissociazione della retina, le arteriole primarie, secondarie e pre-capillari possono essere identificate in base al loro calibro e alla disposizione delle cellule muscolari lisce vascolari.

Le arteriole del primo e del secondo ordine appaiono visivamente simili al microscopio a campo chiaro, ma possono essere distinte sulla base delle loro dimensioni. Le arteriole pre-capillari sono i vasi arteriosi più piccoli della preparazione e sono facilmente riconoscibili a causa della disposizione intermittente delle cellule muscolari lisce vascolari. Le arteriole isolate possono essere chiaramente differenziate dai capillari e dalle venule all'interno dell'isolamento.

I capillari sono evidenti come una rete di vasi di piccolo calibro di circa 4-10 micrometri di diametro, mentre le venule sono a parete sottile e mancano di copertura delle cellule muscolari lisce. Le arteriole primarie, secondarie e pre-capillari sono adatte per la miografia della pressione, l'imaging del calcio e gli studi di patch-clamp. Utilizzando arteriole pressurizzate, abbiamo studiato i meccanismi molecolari coinvolti nella generazione della risposta miogenica.

Le micrografie fotografiche in questa immagine mostrano un'arteriola retinica di ratto in vari punti temporali durante il corso di un esperimento di miografia a pressione. Il grafico dell'andamento temporale sottostante mostra i cambiamenti nel diametro del recipiente durante l'intero corso dell'esperimento. Immediatamente dopo la pressurizzazione, il vaso si dilata, seguito da una costrizione miogenica attiva che raggiunge un livello stazionario dopo 15 minuti.

L'aggiunta di wortmannin in una soluzione di Hanks a zero calcio alla fine dell'esperimento dilata il recipiente al suo diametro passivo ai fini della normalizzazione. Questa diapositiva mostra un esempio di registrazione di patch-clamp a canale singolo da una cellula muscolare liscia dell'arteriola retinica prima e dopo l'allungamento della membrana. Questo cerotto sulla cellula contiene due canali TRPV2 attivati dall'elasticità, la cui attività aumenta con l'applicazione di una pressione negativa alla pipetta del cerotto.

I protocolli descritti qui richiedono pratica, ma dovrebbero essere realizzabili con una risoluzione dei problemi minima. Si consiglia di utilizzare le arteriole isolate lo stesso giorno dell'isolamento. Il metodo è ottimizzato per le arteriole retiniche di ratto, ma può essere utilizzato sulle retine dei topi.

Ora abbiamo utilizzato ampiamente questa preparazione, ma dove possibile cerchiamo anche di convalidare i nostri risultati chiave utilizzando montature retiniche intere ex vivo e misurazioni in vivo del diametro dei vasi sanguigni e del flusso sanguigno.