Name: Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Impara a isolare le arteriole retiniche dal ratto per studi elettrofisiologici e di miografia pressoria. Questo metodo consente di analizzare la contrattilità del muscolo liscio vascolare e la regolazione del flusso sanguigno retinico.

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Sviluppo dei protocolli descritti in questa carta è stato sostenuto da sovvenzioni dalle seguenti agenzie di finanziamento: BBSRC (BB/I026359/1), lotta per vista (1429 e 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) e MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
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<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr. Joanna Kur è ora un dipendente della Medtronic (città gemellate, Minnesota, USA), il suo lavoro attuale non sia in conflitto con quello presentato qui.

I protocolli sopra descritti richiedono pratica ma dovrebbero essere realizzabili con minima risoluzione dei problemi. In un giorno medio vorremmo ottenere 6-8 arteriole utilizzabile dall'isolamento e realizzare esperimenti di successo 3-4. Se si verificano problemi, tuttavia, ci sono alcuni passaggi che possono essere adottate per contribuire a migliorare le percentuali di successo. Occasionalmente abbiamo trovato, soprattutto quando si usano più giovani ratti (< 8 settimane), che il rendimento delle arteriole può essere basso. Per aggirare questo problema, vi suggeriamo di centrifugazione del tessuto retinico (10-30 s a 500 x g) tra ciascuno della triturazione passi nei passaggi 1.12-1.14. Questo spesso aiuta a migliorare il rendimento delle navi, ma aumenterà anche la quantità di detriti cellulari all'interno della preparazione.
Quando incannulamento vasi per studi myography pressione è importante controllare le arteriole attentamente per eventuali rami laterali che si possono avere stati spaccati vicino al sito di biforcazione. Questo rappresenta una causa comune di perdita e la perdita di pressione durante la sperimentazione. Il problema principale che possa sorgere con il [Ca2 +]i protocolli è il livello della tintura di caricamento. Caricamento di povero tintura porta a bassi rapporti segnale-rumore, pur sovraccaricare risultati interruzione del normale omeostasi del Ca2 + . Per ridurre la probabilità di uno di questi problemi, una piccola aliquota dell'omogeneato retinica può essere rimosso, e vasi isolati controllato periodicamente durante il protocollo di carico. Quando esperimenti di impresa patch-clamp, il tasso di successo di gigaseal formazione è altamente dipendente da come ben la lamina basale è stata digerita. Quando inizialmente questo protocollo di analisi o utilizzando un nuovo sacco di enzimi può essere necessario regolare la concentrazione/durata della digestione degli enzimi. Monitorare attentamente la separazione degli strati endoteliali e muscolari lisce garantirà digestione sufficiente rimuovere abbastanza basale laminare per ottenere l'accesso. Attento monitoraggio è anche necessario per evitare sovra-digestione, che può manifestarsi come la nave comincia a restringersi. In questo caso, le cellule di muscolo liscio sono spesso troppo fragile per la registrazione di patch clamp. Quando l'applicazione di enzimi, è importante includere dnasi io per garantire la rimozione di filamenti di DNA liberati dalle cellule danneggiate durante il processo di isolamento. Frammenti di DNA sono appiccicosi e causare il forcipe rispettare l'arteriola durante le fasi finali del processo di pulizia (punto 4.4), spesso con conseguente perdita del vaso. Pulizia dei vasi è tecnicamente difficile e migliore viene eseguita ad alto ingrandimento (X 20) con movimenti delicati di spazzamento di pinze chiuse del diametro della punta possibili migliore. Tra spazza, pulire le pinze con rotolo di laboratorio.
Come evidenziato in precedenza, una motivazione chiave dietro lo sviluppo dei protocolli descritti in questo manoscritto era capire meglio perché il flusso sanguigno è interrotto durante malattie vascolari retiniche. La maggior parte del nostro lavoro fino ad oggi si è concentrata sulla malattia dell'occhio diabetica28,33. Arteriole possono essere isolati da retine dei modelli sperimentali del roditore del diabete utilizzando i metodi descritti nella sezione 1. Quando sperimentando su arteriole retiniche isolati dagli animali diabetici, è importante cercare di replicare strettamente le condizioni hyperglycemic vissute dai vasi in vivo. Per questo motivo, abbiamo normalmente sarebbe aumentare i livelli di D-glucosio nel nostro isolamento e soluzioni sperimentali a 25 mM. Ispessimento delle membrane dello scantinato vascolare è un fenomeno incontestato in vasi retinici durante diabete34,35. Quando si utilizza animali con diabete prolungata (> 1 mesi di durata di malattia), le concentrazioni dell'enzima aumentata o tempi di digestione sono spesso necessarie per consentire all'applicazione di metodi di registrazione di patch-clamp.
Un'importante limitazione dell'utilizzo di ex vivo isolato arteriole retiniche a studiare fisiologia vascolare retinica e patofisiologia è la perdita della compresa retinico circostante. Anche se la rimozione delle cellule gliali e neuronali della retina consente un facile accesso per le cellule di muscolo liscio vascolare retinica per gli studi di fisiologia cellulare, la risposta dei vasi di mediatori vasoattivi possa cambiare drasticamente in assenza e in presenza di retinale tessuto. Le azioni di adenosina tri-fosfato (ATP), ad esempio, forniscono un buon esempio di questo punto. In isolati ratto arteriole retiniche, aggiunta di ATP trigger una robusta costrizione dei vasi36, mentre si è in presenza di un intatto compresa, i vasi si dilatano37. Pertanto, ove possibile, cerchiamo di solito convalidare i risultati chiave da nostri preparativi arteriola isolato utilizzando ex vivo retinica tutta-monti e in vivo misure di vaso diametro e sangue flusso16,37 . Della nota, nuovi metodi recentemente sono emerso per studiare piccole arteriole e capillari in tutto irrorato porcina retine ex vivo38,39. Tali preparazioni sono suscettibili di migliorare notevolmente la nostra comprensione di come il compresa retinica regola il tono arteriolare e capillare retinico e come cambiamenti in emodinamica retinica modulano l'attività neuronale nella retina.
Anche se le procedure descritte in questo documento sono focalizzate sull'utilizzo delle arteriole retiniche isolati del ratto per fisiologia cellulare del muscolo liscio arteriolare di comprensione, attualmente stiamo sviluppando protocolli per attivare anche lo studio della funzione endoteliale delle cellule in questi vasi. Nel lavoro preliminare, siamo riusciti a modificare la digestione enzimatica dei segmenti arteriolare retiniche per produrre tubi di vitali delle cellule endoteliali che sono suscettibili di Ca2 + imaging e patchclamp studi di registrazione. Inserimento di una canula delle arteriole isolate ad entrambe le estremità, abilitazione intraluminal consegna delle droghe, in futuro potrebbe anche enable endotelio-dipendente risposte vasodilatatori ad essere studiati in questi vasi.

Comprendere come viene controllato il flusso sanguigno nella retina è un obiettivo importante, poiché il flusso sanguigno anormale è stato implicato nella patogenesi di una varietà di avvistare-minacciosa malattie retiniche1,2,3, 4. La circolazione retinica, che fornisce i neuroni della retina interni e cellule gliali, ha un accordo di arteria di fine, con tutto il sangue dalle arterie retiniche e arteriole passando attraverso i capillari al venules retinici ed infine vene5. Flusso sanguigno nella retina è regolato dal tono delle arterie retiniche e arteriole, nonché l'attività contrattile dei pericytes poste sulle pareti dei capillari retinici e venule post-capillari6,7, 8. il controllo del tono vascolare retinica è complesso ed è modulato da una gamma di input dal sistema circolatorio e tessuto retinico circostante, compresi i gas del sangue, circolazione molecole e ormoni, e sostanze vasoattive rilasciato dal retiniche vascolari endotelio e macroglia9,10,11. Le arteriole retiniche sono i piccoli rami arteriosi della retina e sono composte da un singolo strato di cellule muscolari lisce vascolari e un rivestimento interno di disposti longitudinalmente cellule endoteliali12,13, 14. questi vasi formano il sito principale della resistenza vascolare all'interno della circolazione retinica e pertanto svolgono un ruolo importante nel controllo locale del flusso sanguigno retinico. Arteriole retiniche regolano il flusso sanguigno capillare nella retina di dilatazione o costrizione loro diametro luminal, mediato dai cambiamenti nel muscolo liscio vascolare contrattilità10,15,16. Comprensione dei meccanismi molecolari attraverso cui retinica arteriole regolano perfusione retinica richiede pertanto preparati dove le cellule di muscolo liscio arteriolare possono essere consultate e studiate in condizioni più vicino al fisiologiche possibile.
Ex vivo preparazioni dei vasi sanguigni retinici isolati forniscono accesso alle cellule muscolari lisce vascolari, pur mantenendo la loro funzionalità e l'interconnessione con l'endotelio sottostante. Maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzando vasi isolati si sono concentrati sui grandi vasi arteriosi di specie bovine o suine (60-150 µm). Questi può essere montati a filo disponibile in commercio o sistemi di myograph di pressione per attivare farmacologico interrogatorio del muscolo liscio vascolare delle cellule contrattili meccanismi17,18. Tali preparazioni hanno contribuito notevolmente alla nostra conoscenza della fisiologia vascolare retinica in condizioni normali. Pochi studi hanno utilizzato arteriole retiniche isolati da piccoli animali da laboratorio come loro diametro più piccolo (~ 8-45 µm) impedisce l'utilizzo in sistemi convenzionali myography19,20,21,22. Un vantaggio importante, tuttavia, di utilizzare navi da piccoli animali da laboratorio è l'ampia disponibilità di modelli di malattia di organismi geneticamente modificati, transgenici e retinica. Piccoli animali da laboratorio sono anche più favorevoli per gli studi di intervento in vivo .
Qui descriviamo protocolli semplici per isolare e incannulamento arteriole retiniche di ratto per esperimenti myography pressione. CA2 + imaging ed elettrofisiologia protocolli utilizzando questi vasi sono anche dettagliati. Questi possono fornire ulteriori intuizioni nella regolazione della contrattilità del muscolo liscio vascolare e del flusso sanguigno nella retina.

<table><tbody><tr><td>Becher</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Forbici curve</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pipetta di plastica monouso / trasferimento</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL è il migliore, ma altre dimensioni sono accettabili; rimuovere la punta per allargare l'apertura</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Qualsiasi pinza fine equivalente</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Pasteur Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Lucidato a fuoco per ridurre l'attrito ma non abbastanza per restringere la punta</td></tr><tr><td>Piastra Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente da 10 cm</td></tr><tr><td>Pipetta per tettarella</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Fornitura di acqua purificata</td><td>Sistema di purificazione dell'acqua integrato</td><td>Merek</td> Milli-Q <td>O qualsiasi sistema equivalente</td></tr><tr><td>Provetta a fondo tondo</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pinza Seratted</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Lame a taglio singolo</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>O qualsiasi superficie flessibile&nbsp;</td></tr><tr><td>Rack per provette</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Miografia</td><td></td><td></td><td></td></tr> a <tr><td>pressione Manipolatore meccanico a 3 assi</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (o qualsiasi prodotto equivalente)</td></tr><tr><td>Rubinetti a 3 vie</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Tabella d'aria</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Banco pulito</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Software di analisi&nbsp;</td><td>Immagine J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Software di imaging gratuito</td></tr><tr><td>Plugin di analisi</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Plugin personalizzato per imageJ Disponibile gratuitamente per il download</td></tr><tr><td>Pipetta di incannulamento in vetro</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Termometro digitale</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Produci 1 mM di stock in</td></tr><tr><td>DMSO Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Qualsiasi pinza fine equivalente</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Produci 1 mM di stock in DMSO</td></tr><tr><td>Camera di registrazione con fondo in vetro</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Bicchiere</td> <td>per pipetta HelperStrumenti di precisione mondiale</td><td>IB150F-3</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Riscaldatore</td><td></td><td></td> in linea <td>Bilancia commerciale equivalente SH-27B Riscaldatore in linea da Harvard Apparecchio</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Manometro</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Estrattore</td> <td>di microelettrodiSutter instruments</td><td>P97</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Microscopio Olympus CX 31</td><td>Vetreria</td><td>Fine Point F-550</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Strumenti Sutter</td><td>MP-285</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Collettore di erogazione multicanale&nbsp;</td><td>Automatizza</td> la <td>matita di perfusione</td> scientifica <td>o qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Riempitrice per pipette&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Siringa riscaldata e tirata al diametro interno della pipetta</td></tr><tr><td>Supporto per pipetta</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>1-HL-U</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pompa di aspirazione</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Pompa di aerazione convertita mediante soffietto invertitore</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Avvento</td><td>W558818</td><td>75&mu; m diametro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>varie dimensioni</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Fotocamera USB</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Software di acquisizione video</td><td>Hypercam</td><td>versione 2.28.01</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>x20 obiettivo</td><td>Nikon</td><td>20x / 0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>x4 obiettivo</td><td>Nikon</td><td>4x / 0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>O qualsiasi qualsiasi prodotto equivalente prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Connettori a Y</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Patch clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubinetti a 3 vie</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>manipolatore meccanico a 3 assi</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr>Società di produzione tecnica <td>della tavola d'aria</td><td>&nbsp;</td><td>Banco pulito</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg disciolto quotidianamente in 50 &mu; L di DMSO (sonicare per dissolvere)</td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200a</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Convertitore analogico digitale</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>0,1 mg/mL in ICL</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Termometro digitale</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Stock di lavoro 1 MU mL-1 (10 MU diluiti in 10 mL LCH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td>Su misura</td><td></td><td>Qualsiasi prodotto commerciale equivalente</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Dumont</td><td>n. 7</td><td>Qualsiasi pinza superfine</td></tr><tr><td>Camera di registrazione con fondo in vetro</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Riscaldatore in linea</td><td>Su misura</td><td></td><td>Riscaldatore in linea per soluzione equivalente commerciale SH-27B da Harvard</td></tr><tr><td>Apparatus Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Estrattore di microelettrodi</td><td>Strumenti Sutter</td><td>P97</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Microscopio Olympus CX 31</td><td>Vetreria</td><td>Fine Point F-550</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Strumenti Sutter</td><td>MP-285</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Collettore di erogazione multicanale&nbsp;</td><td>Automatizza</td> la <td>matita di perfusione</td> scientifica <td>o qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Software di patching</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Pclamp v10.2</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Riempitrice per pipette&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Siringa riscaldata e tirata al diametro interno della pipetta</td></tr><tr><td>Supporto per pipetta</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Proteasi Tipo XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>0,01 mg/mL in ICL</td></tr><tr><td>Pipetta monocanale in vetro</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pompa di aspirazione</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Pompa di aerazione convertita a soffietto invertitore</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Avvento</td><td>W557418</td><td>50&mu; m diametro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>varie dimensioni</td><td>Qualsiasi prodotto equivalente per adattarsi alla</td></tr><tr><td>fotocamera USB</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pipetta a celle intere in vetro</td><td>Warner</td><td>Instruments GC150TF-7.5</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>x20 lente</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>x4 lente</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>x40 obiettivo</td><td>Nikon</td><td>40x / 0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Ca2 + imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rubinetti a 3 vie</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>a 3 assi manipolatore meccanico</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Software di acquisizione&nbsp;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Motore di acquisizione V1.1.5</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Tabella d'aria</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Banco pulito</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Software di analisi per l'imaging confocale</td><td>Immagine J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Software di imaging gratuito</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp;</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; confocale</td></tr><tr><td>Termometro digitale</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Dumont</td><td>n. 7</td><td>Qualsiasi pinza superfine</td></tr><tr><td>Camera di registrazione con fondo in vetro</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Riscaldatore in linea</td><td>Equivalente commerciale su misura SH-27B Soluzione Riscaldatore in linea da Harvard Apparatus</td><td></td> Inverted <td></td></tr><tr><td> microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Monocromatore&nbsp;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Optoscan</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Collettore di erogazione multicanale&nbsp;</td><td>Automatizza</td> la <td>matita di perfusione</td> scientifica <td>o qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Riempitrice per pipette&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Siringa riscaldata e tirata al diametro interno della pipetta</td></tr><tr><td>Software per microscopio confocale</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF versione 3.3.</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; confocale</td></tr><tr><td>Pompa di aspirazione</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Pompa di aerazione convertita a soffietto invertitore</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Avvento</td><td>W557418</td><td>50&mu; m diametro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>varie dimensioni</td><td>Qualsiasi prodotto equivalente per adattarsi Bagno</td></tr><tr><td>d'acqua</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>x100 lente</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 olio</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>x20 lente</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Obiettivo x20</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; obiettivo confocale</td></tr><tr><td>x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>obiettivo x63</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente; connettori a Y confocali</td></tr><tr><td></td><td>World Percision Strumenti</td><td>14012</td><td>O qualsiasi prodotto equivalente</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td></td><td></td><td>Specifiche e impostazioni per la fabbricazione di pipette per la sperimentazione</td></tr><tr><td>Helper pipetta</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>Diametro interno: 0,86 mm Rampa: 261 Pressione: 300 Calore: 280 Tirare : 0 Velocità: 56 Tempo: 250 Numero di cicli: 4 Diametro della punta: 0,5-2 &mu; m lucidatura: sì resistenza finale: >10 m&omega;</td></tr><tr><td>Pipetta per incannulamento</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Diametro interno: 1,17 mm Rampa: 290 Pressione: 300 Calore: 280 Trazione: 0 Velocità: 58 Tempo: 150 Numero di cicli: 4 Diametro della punta: 3-10 &mu; m Lucidatura: no Resistenza finale: < 1 M&Omega;</td></tr><tr><td>Strumenti di precisione</td><td>World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Diametro interno: 0,86 mm Rampa: 261 Pressione: 300 Calore: 280 Trazione: 0 Velocità: 56 Tempo: 250 Numero di cicli: 4 Diametro della punta: 0,5-2 &mu; m Lucidatura: sì Resistenza finale: >5 m&omega;</td></tr><tr><td>Patching a celle intere</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Diametro interno: 1.17 mm Rampa: 296 Pressione: 200 Calore: 287 Tiro: 0 Velocità: 50 Tempo: 250 Numero di cicli: 4 Diametro della punta: 2-3 &mu; m Lucidatura: utile ma non necessaria Resistenza finale: 1-2 M&Omega;</td></tr></tbody></table>

isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule ex vivo

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

La retina è un tessuto altamente metabolicamente attivo che richiede un rifornimento di anima sostanziale. La circolazione retinica supporta la retina interna, mentre i vasi coroideali forniscono i fotorecettori. Le alterazioni retiniche perfusione contribuiscono ad numerosi disordini avvistare-minaccioso, tra cui la retinopatia diabetica, glaucoma e ramo della retina occlusioni della vena. Comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nel controllo del flusso di sangue attraverso la retina e come questi sono alterati durante la malattia oculare potrebbe portare all'identificazione di nuovi bersagli per il trattamento di queste condizioni. Arteriole retiniche sono i vasi di resistenza principale della retina e di conseguenza, un ruolo chiave nella regolazione della retina emodinamica attraverso i cambiamenti di diametro luminal. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato metodi per isolare arteriole dalla retina del ratto che sono adatti per una vasta gamma di applicazioni, tra cui gli studi di fisiologia cellulare. Questa preparazione ha già iniziato a produrre nuove intuizioni come il flusso di sangue è controllato nella retina e ci ha permesso di identificare alcune delle principali modifiche che si verificano durante la malattia oculare. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'isolamento delle arteriole retiniche di ratto e includere protocolli per il loro uso in elettrofisiologia di patch-clamp, calcio imaging e studi myography pressione. Questi vasi sono anche favorevoli per l'uso in PCR-, western blotting e immunohistochemistry-studi basati.

Questo manoscritto descrive un semplice protocollo per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi myography elettrofisiologici, imaging e pressione del calcio.

Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Capire come viene controllato il flusso sanguigno nella retina è un obiettivo importante, poiché il flusso sanguigno anomalo è stato implicato nello sviluppo di una varietà di malattie retiniche pericolose per la vista, come la retinopatia diabetica, il glaucoma e le occlusioni delle vene ramificate. Le arteriole retiniche svolgono un ruolo chiave nella regolazione del flusso sanguigno nella retina dilatando e restringendo il loro diametro luminale, mediato da cambiamenti nella contrattilità delle cellule muscolari lisce che circondano questi vasi. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della regolazione della perfusione retinica richiede quindi preparazioni in cui le cellule muscolari lisce arteriolari retiniche possano essere accessibili e studiate in condizioni il più vicino possibile alla fisiologia.In questo video, dimostriamo un protocollo semplice per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi di patch clamp, imaging del calcio e miografia della pressione. Negli ultimi anni, questo preparato è stato utilizzato per fornire ulteriori informazioni sulla regolazione della contrattilità della muscolatura liscia vascolare e del flusso sanguigno nella retina sia in salute che in malattia. Preparare una soluzione da un litro di basso contenuto di calcio contenente Hanks'or LCH, come mostrato nella tabella dei materiali.Assemblare l'attrezzatura di isolamento prima della raccolta del tessuto. La pipetta in vetro Pasteur deve essere lucidata a fuoco per levigare, ma non restringere la punta. Taglia una pipetta di plastica a un'apertura di circa cinque-sette millimetri.Posizionare gli occhi sulla capsula di dissezione, immersa in una soluzione di ICL. Usa un set di pinze per ancorare l'occhio al piatto tenendo gli attacchi dei muscoli orbitali o il nervo ottico. Assicurarsi che il punto di ancoraggio sia il più vicino possibile alla sclera per stabilizzare l'occhio.Usando la lama, tagliare la cornea lungo l'ora serrata e rimuovere la lente premendo delicatamente sulla sclera con una pinza. La piccola regione circolare che vediamo nella parte posteriore dell'occhio in questa immagine è il nervo ottico. Utilizzando la lama, tagliare l'oculare a metà simmetricamente attraverso il disco ottico.Utilizzando una pinza chiusa, spazzolare delicatamente le retine dalle due metà dell'oculare, avendo cura di rimuovere eventuali attacchi rimanenti sul disco ottico. Ripetere il processo con il secondo occhio e trasferire le retine sezionate nella provetta utilizzando la pipetta di plastica e una piccola goccia di terreno ICL. Usando la pipetta di plastica, riempire la provetta con LCH fino a circa cinque millilitri e lasciare che le retine si depositino sul fondo della provetta.Lavare il fazzoletto circa tre volte rimuovendo circa quattro millilitri di soluzione dalla provetta e aggiungendo ICL fresco utilizzando la pipetta di plastica. Se necessario, il tessuto estraneo deve essere rimosso. Lavare l'interno della pipetta Pasteur in vetro con punta lucidata con LCH per evitare che il fazzoletto si attacchi alla pipetta.Utilizzando la stessa pipetta, rimuovere circa quattro millilitri di soluzione dalla provetta e aggiungere circa due millilitri di ICL fresco. Dissociare delicatamente le retine aspirando lentamente il tessuto attraverso la punta della pipetta di vetro ed espellere il contenuto nella provetta. Cerca di non introdurre bolle in questa fase e ripeti il processo fino a quando le retine non si rompono fino alla dimensione di circa due o tre millimetri quadrati.Lavare l'interno della pipetta con circa due millilitri di ICL ed espellerlo nella provetta. Lasciare che il contenuto si depositi sul fondo per cinque-10 minuti. Ripetere il processo di triturazione come descritto in precedenza con un po' più di forza fino a quando i pezzi di tessuto non raggiungono una dimensione di circa un millimetro quadrato.Lascia che il tessuto si depositi e ripeti ancora una volta con ancora più forza fino a quando il contenuto non è completamente omogeneizzato e non rimangono pezzi di retina. La soluzione in questa fase dovrebbe apparire lattiginosa. Questa tecnica produrrà fino a otto segmenti arteriolici per isolamento, misurando da 200 a 2.500 micrometri di lunghezza.L'incannulamento di un'estremità dell'arteriola con occlusione dell'estremità opposta consente la misurazione della vasocostrizione indotta dalla pressione, nota anche come risposta miogenica. La miografia della pressione arteriolare viene eseguita come segue. Un'aliquota di omogenato retinico viene trasferita in una camera di registrazione fisiologica montata sul tavolino di un microscopio invertito.Lasciare riposare l'omogeneizzato sul fondo della camera per almeno cinque minuti. Eseguire una scansione visiva attraverso la camera di registrazione per identificare le arteriole di lunghezza superiore a 200 micrometri e dotate di un'estremità aperta attraverso la quale il vaso può essere incannulato. Ancorare un'estremità del recipiente utilizzando una pinza fine e un piccolo filo di tungsteno posizionato sopra il recipiente.Utilizzando le estremità sovrapposte del filo di tungsteno, manovrare il recipiente in modo che scorra orizzontalmente attraverso il bagno, in modo che l'estremità aperta sia in linea con la cannula di pressurizzazione. Perfondere la camera con Hanks' a zero calcio a 37 gradi Celsius. Gli incannulamento vengono eseguiti con pipette di vetro.La cannula viene posizionata all'estremità aperta del vaso utilizzando un micromanipolatore a grana fine. La punta è posizionata immediatamente adiacente all'apertura, come valutato regolando il piano di messa a fuoco sul microscopio, in modo tale che sia l'estremità del vaso che la punta della cannula siano a fuoco contemporaneamente e la cannula di pressurizzazione avanzi nell'apertura del vaso. Una pipetta ausiliaria è necessaria per assistere il processo di incannulamento e viene utilizzata per trattenere delicatamente l'arteriola e guidare la parete arteriolare sopra la cannula di pressurizzazione nello stesso momento in cui la cannula viene fatta avanzare nel lume del vaso.Questa procedura richiede un movimento simultaneo e controllato di entrambi i manipolatori e una vasta pratica per ottenere un alto tasso di successo. Dopo un minuto di registrazione a zero millimetri di mercurio, la pressione intraluminale viene aumentata a 40 millimetri di mercurio e il vaso dovrebbe dilatarsi rapidamente, confermando il successo dell'incannulamento. La vasocostrizione indotta dalla pressione, cioè la risposta miogenica, si svilupperà successivamente in un periodo di circa 15 minuti.La registrazione del patch clamp dalle cellule muscolari lisce vascolari retiniche consente di studiare le correnti ioniche della membrana plasmatica che regolano il calcio intracellulare e quindi la contrattilità cellulare. La registrazione di cellule intere e di un singolo canale è possibile da singole cellule muscolari lisce ancora incorporate all'interno delle loro arteriole madri come segue. Le arteriole retiniche sono isolate e ancorate nella camera di registrazione con strisce di filo di tungsteno.La lamina basale deve essere digerita per consentire la formazione di una tenuta ad alta resistenza tra la pipetta del cerotto e la membrana delle cellule muscolari lisce arteriolari. Le arteriole vengono superfuse con una serie sequenziale di soluzioni enzimatiche a 37 gradi Celsius, il che provoca anche il disaccoppiamento elettrico delle cellule adiacenti, come indicato dalle frecce sull'immagine. Il livello di digestione viene inizialmente valutato sulla separazione visiva degli strati endoteliale e della muscolatura liscia durante la fase della collagenasi.La rimozione di eventuali filamenti rimanenti di lamina basale e/o neuropila periferica si ottiene spazzando attentamente le punte chiuse di una pinza sottile lungo la superficie del vaso. Per il bloccaggio dei patch, la punta della pipetta per patch viene posizionata verticalmente sopra la cellula di interesse e abbassata gradualmente utilizzando il movimento lento e fine del micromanipolatore per entrare in contatto con la membrana muscolare liscia arteriolare. Questo viene giudicato in base al movimento della cellula e a una variazione della resistenza della pipetta, misurata utilizzando un protocollo di test di tenuta cellulare nel software di acquisizione.Quando la pipetta viene abbassata sulla cella, la resistenza di tenuta aumenterà di circa cinque volte. La pressione negativa viene applicata transitoriamente sul retro della pipetta e si forma gradualmente un gigaseal. Ciò richiede applicazioni ripetute di pressione negativa nel corso di uno o cinque minuti.Per la registrazione di cellule intere, viene utilizzato prevalentemente il metodo del patch-clamp perforato. Un gigaseal è formato, come descritto in precedenza, con una pipetta contenente una soluzione intracellulare e amfotericina B. La resistenza all'accesso viene monitorata utilizzando il protocollo di test a membrana nel software di acquisizione. Una volta che la resistenza di accesso scende a meno di 15 megaohm, viene eseguita la compensazione della resistenza in serie.Tipicamente è possibile compensare la resistenza in serie di circa il 75% in modalità patch perforata. I gradini di tensione o i protocolli di rampa possono quindi essere utilizzati per misurare le correnti dell'intera cella. Dopo la dissociazione della retina, le arteriole primarie, secondarie e pre-capillari possono essere identificate in base al loro calibro e alla disposizione delle cellule muscolari lisce vascolari.Le arteriole del primo e del secondo ordine appaiono visivamente simili al microscopio a campo chiaro, ma possono essere distinte sulla base delle loro dimensioni. Le arteriole pre-capillari sono i vasi arteriosi più piccoli della preparazione e sono facilmente riconoscibili a causa della disposizione intermittente delle cellule muscolari lisce vascolari. Le arteriole isolate possono essere chiaramente differenziate dai capillari e dalle venule all'interno dell'isolamento.I capillari sono evidenti come una rete di vasi di piccolo calibro di circa 4-10 micrometri di diametro, mentre le venule sono a parete sottile e mancano di copertura delle cellule muscolari lisce. Le arteriole primarie, secondarie e pre-capillari sono adatte per la miografia della pressione, l'imaging del calcio e gli studi di patch-clamp. Utilizzando arteriole pressurizzate, abbiamo studiato i meccanismi molecolari coinvolti nella generazione della risposta miogenica.Le micrografie fotografiche in questa immagine mostrano un'arteriola retinica di ratto in vari punti temporali durante il corso di un esperimento di miografia a pressione. Il grafico dell'andamento temporale sottostante mostra i cambiamenti nel diametro del recipiente durante l'intero corso dell'esperimento. Immediatamente dopo la pressurizzazione, il vaso si dilata, seguito da una costrizione miogenica attiva che raggiunge un livello stazionario dopo 15 minuti.L'aggiunta di wortmannin in una soluzione di Hanks a zero calcio alla fine dell'esperimento dilata il recipiente al suo diametro passivo ai fini della normalizzazione. Questa diapositiva mostra un esempio di registrazione di patch-clamp a canale singolo da una cellula muscolare liscia dell'arteriola retinica prima e dopo l'allungamento della membrana. Questo cerotto sulla cellula contiene due canali TRPV2 attivati dall'elasticità, la cui attività aumenta con l'applicazione di una pressione negativa alla pipetta del cerotto.I protocolli descritti qui richiedono pratica, ma dovrebbero essere realizzabili con una risoluzione dei problemi minima. Si consiglia di utilizzare le arteriole isolate lo stesso giorno dell'isolamento. Il metodo è ottimizzato per le arteriole retiniche di ratto, ma può essere utilizzato sulle retine dei topi.Ora abbiamo utilizzato ampiamente questa preparazione, ma dove possibile cerchiamo anche di convalidare i nostri risultati chiave utilizzando montature retiniche intere ex vivo e misurazioni in vivo del diametro dei vasi sanguigni e del flusso sanguigno.

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