Name: Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare lattivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Impara la citometria a flusso e l'analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nel cervelleo di topo neonato. Questo metodo rivela l'eterogeneità cellulare e contribuisce alla comprensione dello sviluppo cerebellare.

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<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>140 &micro; m filtro a rete metallica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo conico&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arginasi 1 - Coniugato Pecy7 - Clone : A1exF5</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti fluorescenti stabili da banco</td><td>Invitrogen</td><td>Codice: A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Coniugato Fitc - Clone : M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Coniugato SB600 - Clone : TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - APC coniugato - Clone : C068C2</td><td>BioLeggenda</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Coniugato A700 - Clone : 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Coniugato PerCP-eF710 - Clone : X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Coniugato SB436 - Clone : 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Pe coniugato - Clone : GL-1</td><td>BioLeggenda</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) 10x</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>Codice 311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>VWR Internazionale</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - PE coniugato - eF610 - Clone : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Vivo/Morto Amcyan</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di coltura cellulare microgliale</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>Codice A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Topo antiratto CD16/CD32</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Librerie scRNAseq</td><td>Genomica 10X</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo colloidale a base di silice</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Aziduro di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Blu</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Questo protocollo utilizza efficacemente la citometria a flusso per caratterizzare le popolazioni di cellule microgliali in campioni di cervello di topo, sulla base dell'espressione di marcatori di superficie e intracellulari selezionati. Le sezioni seguenti descrivono in dettaglio i risultati ottenuti dalle fasi chiave del flusso di lavoro, evidenziando la distribuzione e l'eterogeneità dei sottogruppi di microglia in risposta alle condizioni sperimentali.
Convalida della strategia di compensazione e gating Le perle di compensazione sono state utilizzate per calibrare i segnali di fluorescenza e correggere la sovrapposizione spettrale tra i fluorocromi. Le popolazioni positive e negative per ciascun fluorocromo sono state chiaramente separate, consentendo un'accurata generazione di matrici di compensazione. Le soglie di gating sono state inizialmente convalidate utilizzando il controllo FMO (Fluorescence Minus One) durante l'ottimizzazione del pannello per distinguere il segnale reale dal fondo, in particolare per i marcatori poveri o sovrapposti. Queste soglie sono state successivamente riutilizzate in tutti gli esperimenti utilizzando le stesse impostazioni del pannello di colorazione e del citometro per garantire la coerenza. I controlli isotipici sono stati inclusi per monitorare il potenziale legame non specifico, in particolare per i marcatori intracellulari, ma non sono stati utilizzati per le decisioni di gating.
Identificazione delle cellule microgliali La strategia di gating cellulare vivo/morto (Amciano) ha escluso con successo le cellule morte. La strategia di gating ha isolato efficacemente le popolazioni di cellule microgliali in base all'espressione di CD45 (AF700) e CD11b (FITC). I parametri di dispersione diretta (FSC) e laterale (SSC) sono stati ottimizzati (FSC = 300, SSC = 200) per centrare la popolazione di microglia all'interno del dot plot (Figura 5).
Fenotipizzazione delle cellule microgliali L'analisi a punti ha permesso l'identificazione di sottopopolazioni di microglia in base all'espressione differenziale di marcatori di superficie e intracellulari. Utilizzando specifiche strategie di gating nel software FlowJo, è stato identificato un sottoinsieme di cellule microgliali che esprimono CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) e iNOS (PE-eFluor 610) (Figura 6A). Il doppio gating è stato utilizzato anche per definire sottogruppi che esprimono CD206 (APC) e Arg1 (PE-Cy7) (vedere la Figura 6B). Altre popolazioni sono state caratterizzate dalla co-espressione di CD86 (PE) e CD64 (PerCP-eFluor 710), nonché di CD163 (Super Bright 600) e CD206 (APC) (Figura 6C, D). Questi profili fenotipici riflettono l'eterogeneità definita dai marcatori all'interno della popolazione microgliale e dimostrano la capacità di questo protocollo di distinguere più sottogruppi trascrizionalmente e immunologicamente distinti senza dedurre stati funzionali fissi.
Analisi di microglia su singola cellula L'approssimazione e la proiezione uniforme del collettore (UMAP) sono state utilizzate per visualizzare l'eterogeneità cellulare e identificare i cluster di cellule microgliali tra altri tipi di cellule cerebrali. Ogni punto rappresenta una singola cellula e il cluster è codificato a colori in base alla somiglianza trascrizionale (Figura 2).
L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita all'interno del cluster di microglia per identificare i geni modulati in condizioni sperimentali. I geni con un valore P aggiustato ≤ 0,05 sono stati considerati espressi in modo differenziale.
È stato generato un grafico a vulcano per visualizzare questi geni differenzialmente espressi di cellule microgliali, evidenziando quelli con un'elevata variazione di piega e significatività statistica (Figura 4).
Per confrontare questi risultati di singole cellule con i dati della citometria a flusso, è stata esaminata l'espressione dei marcatori microgliali CD45 e CD11b (Ptprc e Itgam). Un UMAP mostra la loro espressione all'interno di diverse popolazioni cellulari (Figura 7).
Infine, è stata valutata l'espressione di marcatori immuno-correlati selezionati per caratterizzare l'eterogeneità trascrizionale tra le cellule microgliali. Un grafico di Violin mostra l'espressione di geni come CD80 e NOS-, così come Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 a livello di singola cellula (Figura 8). Questi modelli di espressione dei marcatori consentono il confronto con la profilazione basata sulla citometria a flusso ed evidenziano la diversità molecolare dei sottogruppi microgliali in condizioni sperimentali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Figura 1: Controllo di qualità dei dati trascrittomici su singola cellula. (A) Distribuzione del contenuto di RNA mitocondriale tra le cellule. Le cellule con &gt;30% di RNA mitocondriale sono state escluse per rimuovere le cellule potenzialmente stressate o morenti. (B) Le cellule con un log10GenesPerUMI &gt; 0,75 sono state filtrate per garantire un rapporto gene-UMI coerente e ridurre il rumore proveniente da librerie a bassa complessità. (C) Sono state escluse anche le cellule con meno di 500 trascritti rilevati (nUMI) o più di 300 geni rilevati (nGENE) per eliminare cellule multiple o di scarsa qualità. (D) Grafico di correlazione di NUMI rispetto a nGene che illustra l'impatto delle soglie di filtraggio. I doppietti rilevati sono stati rimossi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Figura 2: Visualizzazione UMAP di trascrittomi a singola cellula. Grafico UMAP che mostra la distribuzione di singole cellule in base ai profili trascrittomici ottenuti da due singoli animali. Ogni punto rappresenta una cella, codificata a colori in base all'identità del cluster. Il cluster di cellule microgliali viene identificato tra le altre popolazioni cellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Figura 3: Curva ROC del classificatore Random Forest valutata mediante cross-validation. Curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che illustra le prestazioni del modello Random Forest utilizzato per distinguere la microglia da altri tipi di cellule cerebrali in base ai profili di espressione genica. Il modello è stato addestrato su un set di ~1000 celle con etichette note e valutato utilizzando la convalida incrociata 10-fold. Tra i cinque modelli statistici testati (Random Forest, regressione logistica, naive Bayes, support vector machine e decision tree), il modello Random Forest ha ottenuto le prestazioni di classificazione più elevate. L'area sotto la curva (AUC) riflette l'accuratezza del modello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Figura 4: Analisi dell'espressione genica differenziale in cellule microgliali. Grafico del vulcano che rappresenta la variazione log2 volte rispetto al valore P aggiustato per i geni espressi in modo differenziale nella microglia tra i due gruppi sperimentali (controllo vs. lesione cerebrale cerebellare). Il gene sovraregolato è più espresso nel gruppo di interesse (ident.1) e i geni sottoregolati mostrano un'espressione ridotta rispetto al gruppo di riferimento (ident.2). Vengono marcati i geni chiave espressi in modo significativamente differenziale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Figura 5: Strategia di gating per l'identificazione della microglia mediante citometria a flusso. (A) Strategia di gating applicata a cellule cerebellari da un topo di controllo postnatale al 3° giorno (P3). (B) Le canottiere sono state selezionate per escludere i doppietti. (C) le cellule vitali sono state identificate utilizzando un colorante vitale; gli eventi con basso FSC-A sono stati esclusi per rimuovere i detriti e garantire l'analisi delle cellule intatte. (D) Le microglia sono state identificate come CD45+ e CD11b+ con due popolazioni distinte: CD45 low-CD11bint per la microglia quiescente e CD45int -CD11bhigh per la microglia attivata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Figura 6. Caratterizzazione dei profili di espressione dei marcatori della microglia mediante citometria a flusso. (A) Gating sequenziale di cellule CD45+ CD11b+ basato sull'espressione di CD80, CD86 e iNOS. (B) Identificazione di un sottogruppo che esprime CD206, seguita da gating basato sull'espressione di Arg1. (C) Identificazione di un sottogruppo che esprime CD86, seguita da gating basato sull'espressione di CD64. (D) Identificazione di un sottogruppo che esprime CD163, seguita da gating basato sull'espressione di CD206. Queste strategie di gating illustrano l'eterogeneità fenotipica delle popolazioni di microglia in base all'espressione di marcatori di superficie e intracellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Figura 7: Conferma dell'identità della microglia utilizzando l'espressione di Itgam e Ptprc nei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. UMAP mostra il panorama trascrizionale delle cellule cerebellari a P15, con l'espressione genica di Itgam e Ptprc sovrapposta in cluster. La co-espressione di questi marcatori mieloidi canonici supporta l'identificazione delle popolazioni di microglia e si allinea con i marcatori utilizzati nella citometria a flusso, fornendo una convalida incrociata tra le analisi trascrittomiche e a livello proteico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Figura 8: Profili di espressione di geni immuno-correlati selezionati in cellule microgliali identificati mediante sequenziamento dell'RNA a singola cellula. I grafici a violino mostrano la distribuzione dell'espressione genica per CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 tra le singole cellule microgliali. Questi marcatori sono comunemente associati a processi immuno-correlati e illustrano l'eterogeneità trascrizionale osservata all'interno della popolazione microgliale. I dati sono mostrati sia per il controllo che per le condizioni di lesione cerebrale cerebellare (CBI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate per l'isolamento e la colorazione delle cellule neurali. Questa tabella fornisce una composizione dettagliata delle soluzioni necessarie per l'isolamento e la colorazione delle cellule, comprese le rispettive concentrazioni e componenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Concentrazioni della miscela di anticorpi per la colorazione extracellulare. Questa tabella descrive in dettaglio le concentrazioni di anticorpi e soluzione viva/morta utilizzati per la colorazione extracellulare, specificando i volumi e le diluizioni richiesti per ciascun anticorpo nella miscela colorante per un campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Concentrazioni della miscela di anticorpi per la colorazione intracellulare. Questa tabella descrive in dettaglio le concentrazioni di anticorpi utilizzati per la colorazione intracellulare, specificando i volumi e le diluizioni richiesti per ciascun anticorpo nella miscela di colorazione per un campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

La nostra ricerca esplora il modo in cui le microglia influenzano la riparazione cerebrale dopo una lesione cerebrale prenatale. E miriamo a determinare se la modulazione dell'attività delle cellule microgliali può migliorare gli esiti neurologici a lungo termine. Credo che sia la complessità delle risposte delle cellule microgliali e le sfide di descrivere tali risposte nel modo più accurato per rappresentare le risposte fisiologiche, ma anche patologiche e le malattie.Stiamo utilizzando diverse modalità, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e gli esperimenti di citometria a flusso, per caratterizzare gli stati e la funzione microgliale nel cervello in via di sviluppo dopo un danno prenatale. Una delle principali sfide è preservare la vitalità cellulare e l'identità microgliale durante l'isolamento, specialmente nei momenti neonatali quando il numero di cellule cerebellari è limitato. Solleva interrogativi su come gli insulti cerebellari nei primi anni di vita portino ad alterazioni trascrizionali nella sottopopolazione microgliale e su come le terapie mirate possano modulare questi cambiamenti.Per iniziare, seziona la regione specifica del cervello dei topi secondo necessità. Usando una pinza, trasferire il tessuto in una piccola capsula di Petri contenente terreno di coltura cellulare microgliale posto su ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. Utilizzando una pipetta, rimuovere il terreno di coltura cellulare microgliale dalla piastra di Petri.Quindi, usando un bisturi, taglia finemente il tessuto cerebrale nella stessa capsula di Petri. Trasferire il tessuto cerebrale omogeneizzato in provette da cinque millilitri per la digestione enzimatica. Aggiungere due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks integrata con collagenasi D e DNasi 1 a ciascuna provetta e sigillare ermeticamente i tappi con Parafilm.Quindi, incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, agitandole ogni cinque minuti. Per fermare la digestione, posizionare i tubi sul ghiaccio. Quindi, passare l'omogeneizzato attraverso un filtro a rete metallica da 140 micrometri per rimuovere i detriti di grandi dimensioni.Utilizzando un pestello di vetro, dissociare delicatamente le celle rimanenti sul filtro. Lavare più volte il filtro a rete metallica con tre millilitri di terreno di coltura cellulare microgliale per ogni lavaggio. Ora, utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere il filtrato e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri.Quindi, centrifugare la provetta a 500 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, capovolgere con cura il tubo per scartare il surnatante. Utilizzando una griglia, raschiare delicatamente il tubo per risospendere il pellet.Quindi, aggiungere 10 millilitri di una soluzione di terreno colloidale a base di silice al 37% alle cellule risospese. Centrifugare la soluzione a 500 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con una forza di rottura minima. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, aspirare lo strato di mielina dalla parte superiore della soluzione.Per lavare le cellule, aggiungere 10 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks e centrifugare la provetta a 500 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante e risospeso il pellet, aggiungere 10 millilitri di tampone di selezione cellulare attivato con fluorescenza nella provetta. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet finale nel tampone rimanente per le applicazioni a valle.Trasferire tutte le celle isolate in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico. Centrifugare la piastra a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Capovolgere rapidamente la piastra con un solo movimento per scartare il surnatante.Quindi, risospendere il pellet cellulare in 25 microlitri di soluzione bloccante e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Per preparare la miscela di colorazione extracellulare degli anticorpi, centrifugare le provette stock degli anticorpi a 10.000 g per rimuovere gli aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare il volume richiesto dal surnatante.Utilizzando il tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza, regolare il volume totale a 25 microlitri. Ora, aggiungi 25 microlitri della miscela di colorazione anticorpale extracellulare a ciascun pozzetto e incuba la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. Senza mescolare, aggiungere 150 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato con fluorescenza in ciascun pozzetto.Centrifugare la piastra a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, capovolgere rapidamente la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento. Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato a fluorescenza e centrifugare come dimostrato in precedenza.Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone saponina-paraformaldeide per fissare e permealizzare le cellule. Quindi, incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Senza mescolare, aggiungere 100 microlitri di tampone saponinico in ogni pozzetto.Centrifugare la piastra a 500 g per sei minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone saponina. Successivamente, preparare i controlli di compensazione aggiungendo 20 microlitri di perle a 11 pozzetti vuoti.Per preparare la miscela di colorazione intracellulare degli anticorpi, centrifugare le provette stock degli anticorpi a 10.000 g per rimuovere potenziali aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare il volume richiesto dal surnatante. Regolare il volume a 50 microlitri utilizzando il tampone saponina.Quindi, risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di miscela di anticorpi intracellulari. Aggiungere un microlitro di ciascun anticorpo ai rispettivi pozzetti delle microsfere e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Senza mescolare, aggiungere 150 microlitri di tampone saponina a ciascun pozzetto contenente campioni di cellule.Aggiungere 100 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato a fluorescenza a ciascun pozzetto di controllo di compensazione per lavare le perle. Una volta centrifugata la piastra, risospendere il pellet cellulare e controllare rispettivamente 200 microlitri di tampone saponina e tampone di selezione cellulare attivato da fluorescenza. Centrifugare la piastra a 500 g per sei minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.Risospendere sia i campioni cellulari che i controlli di compensazione in 200 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Trasferire le sospensioni in provette di smistamento cellulare attivate con fluorescenza marcate. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha identificato un cluster microgliale distinto separato da altri tipi di cellule cerebrali in base ai profili trascrizionali.L'analisi dell'espressione differenziale ha rivelato geni significativamente sovraregolati nelle microglia, tra cui Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 e P2ry12. Le cellule microgliali sono state isolate con successo da campioni di cervello vivo in base alla loro distinta espressione dei marcatori CD45 e CD11b. Sono state identificate sottopopolazioni microgliali distinte sulla base di combinazioni di marcatori di attivazione, tra cui CD80, CD86, iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 e CD163 con CD206.L'espressione genica marcatore di Ptprc e Itgam è stata localizzata specificamente nel cluster microgliale nella proiezione umap, confermando l'identità di queste cellule. L'analisi del diagramma di violino ha mostrato una minore espressione di marcatori antinfiammatori, come Fcgr1 e Cd86, nelle microglia trattate rispetto al controllo del veicolo.

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Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

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Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

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Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

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Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

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Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

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Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

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Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare lattivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale (Video) | JoVE Journal

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

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