Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale
October 3rd, 2025
Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.
La nostra ricerca esplora il modo in cui le microglia influenzano la riparazione cerebrale dopo una lesione cerebrale prenatale. E miriamo a determinare se la modulazione dell'attività delle cellule microgliali può migliorare gli esiti neurologici a lungo termine. Credo che sia la complessità delle risposte delle cellule microgliali e le sfide di descrivere tali risposte nel modo più accurato per rappresentare le risposte fisiologiche, ma anche patologiche e le malattie.
Stiamo utilizzando diverse modalità, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e gli esperimenti di citometria a flusso, per caratterizzare gli stati e la funzione microgliale nel cervello in via di sviluppo dopo un danno prenatale. Una delle principali sfide è preservare la vitalità cellulare e l'identità microgliale durante l'isolamento, specialmente nei momenti neonatali quando il numero di cellule cerebellari è limitato. Solleva interrogativi su come gli insulti cerebellari nei primi anni di vita portino ad alterazioni trascrizionali nella sottopopolazione microgliale e su come le terapie mirate possano modulare questi cambiamenti.
Per iniziare, seziona la regione specifica del cervello dei topi secondo necessità. Usando una pinza, trasferire il tessuto in una piccola capsula di Petri contenente terreno di coltura cellulare microgliale posto su ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. Utilizzando una pipetta, rimuovere il terreno di coltura cellulare microgliale dalla piastra di Petri.
Quindi, usando un bisturi, taglia finemente il tessuto cerebrale nella stessa capsula di Petri. Trasferire il tessuto cerebrale omogeneizzato in provette da cinque millilitri per la digestione enzimatica. Aggiungere due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks integrata con collagenasi D e DNasi 1 a ciascuna provetta e sigillare ermeticamente i tappi con Parafilm.
Quindi, incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, agitandole ogni cinque minuti. Per fermare la digestione, posizionare i tubi sul ghiaccio. Quindi, passare l'omogeneizzato attraverso un filtro a rete metallica da 140 micrometri per rimuovere i detriti di grandi dimensioni.
Utilizzando un pestello di vetro, dissociare delicatamente le celle rimanenti sul filtro. Lavare più volte il filtro a rete metallica con tre millilitri di terreno di coltura cellulare microgliale per ogni lavaggio. Ora, utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere il filtrato e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri.
Quindi, centrifugare la provetta a 500 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, capovolgere con cura il tubo per scartare il surnatante. Utilizzando una griglia, raschiare delicatamente il tubo per risospendere il pellet.
Quindi, aggiungere 10 millilitri di una soluzione di terreno colloidale a base di silice al 37% alle cellule risospese. Centrifugare la soluzione a 500 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con una forza di rottura minima. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, aspirare lo strato di mielina dalla parte superiore della soluzione.
Per lavare le cellule, aggiungere 10 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks e centrifugare la provetta a 500 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante e risospeso il pellet, aggiungere 10 millilitri di tampone di selezione cellulare attivato con fluorescenza nella provetta. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet finale nel tampone rimanente per le applicazioni a valle.
Trasferire tutte le celle isolate in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico. Centrifugare la piastra a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Capovolgere rapidamente la piastra con un solo movimento per scartare il surnatante.
Quindi, risospendere il pellet cellulare in 25 microlitri di soluzione bloccante e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Per preparare la miscela di colorazione extracellulare degli anticorpi, centrifugare le provette stock degli anticorpi a 10.000 g per rimuovere gli aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare il volume richiesto dal surnatante.
Utilizzando il tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza, regolare il volume totale a 25 microlitri. Ora, aggiungi 25 microlitri della miscela di colorazione anticorpale extracellulare a ciascun pozzetto e incuba la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. Senza mescolare, aggiungere 150 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato con fluorescenza in ciascun pozzetto.
Centrifugare la piastra a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, capovolgere rapidamente la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento. Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato a fluorescenza e centrifugare come dimostrato in precedenza.
Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone saponina-paraformaldeide per fissare e permealizzare le cellule. Quindi, incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Senza mescolare, aggiungere 100 microlitri di tampone saponinico in ogni pozzetto.
Centrifugare la piastra a 500 g per sei minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone saponina. Successivamente, preparare i controlli di compensazione aggiungendo 20 microlitri di perle a 11 pozzetti vuoti.
Per preparare la miscela di colorazione intracellulare degli anticorpi, centrifugare le provette stock degli anticorpi a 10.000 g per rimuovere potenziali aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare il volume richiesto dal surnatante. Regolare il volume a 50 microlitri utilizzando il tampone saponina.
Quindi, risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di miscela di anticorpi intracellulari. Aggiungere un microlitro di ciascun anticorpo ai rispettivi pozzetti delle microsfere e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Senza mescolare, aggiungere 150 microlitri di tampone saponina a ciascun pozzetto contenente campioni di cellule.
Aggiungere 100 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato a fluorescenza a ciascun pozzetto di controllo di compensazione per lavare le perle. Una volta centrifugata la piastra, risospendere il pellet cellulare e controllare rispettivamente 200 microlitri di tampone saponina e tampone di selezione cellulare attivato da fluorescenza. Centrifugare la piastra a 500 g per sei minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Risospendere sia i campioni cellulari che i controlli di compensazione in 200 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Trasferire le sospensioni in provette di smistamento cellulare attivate con fluorescenza marcate. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha identificato un cluster microgliale distinto separato da altri tipi di cellule cerebrali in base ai profili trascrizionali.
L'analisi dell'espressione differenziale ha rivelato geni significativamente sovraregolati nelle microglia, tra cui Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 e P2ry12. Le cellule microgliali sono state isolate con successo da campioni di cervello vivo in base alla loro distinta espressione dei marcatori CD45 e CD11b. Sono state identificate sottopopolazioni microgliali distinte sulla base di combinazioni di marcatori di attivazione, tra cui CD80, CD86, iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 e CD163 con CD206.
L'espressione genica marcatore di Ptprc e Itgam è stata localizzata specificamente nel cluster microgliale nella proiezione umap, confermando l'identità di queste cellule. L'analisi del diagramma di violino ha mostrato una minore espressione di marcatori antinfiammatori, come Fcgr1 e Cd86, nelle microglia trattate rispetto al controllo del veicolo.
Panoramica
Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati cellulari microgliali nel cervelletto dei cervelli di topi nei primi giorni post-natali. Si avvale della dissociazione enzimatica e della centrifugazione su Percoll, insieme all'immunomarcatura, per rivelare l'eterogeneità microgliale, migliorando la comprensione dei loro ruoli nello sviluppo e nelle malattie del cervelletto.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Biologia dello Sviluppo
Sfondo
- La microglia è fondamentale nello sviluppo e nella funzione del cervello.
- Comprendere le dinamiche microgliali può illuminare i loro ruoli in varie malattie.
- Caratterizzare gli stati microgliali è essenziale per sviluppare terapie mirate.
- Le analisi a singola cellula forniscono informazioni sull'eterogeneità cellulare.
Scopo dello Studio
- Isolare e caratterizzare gli stati microgliali nel cervelletto.
- Migliorare la comprensione del ruolo della microglia nello sviluppo del cervello.
- Contribuire alla conoscenza del coinvolgimento microgliale nei processi di malattia.
Metodi Utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è la citometria a flusso combinata con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
- Il modello biologico consiste in cervelli di topi nei primi giorni post-natali, concentrandosi sulla microglia del cervelletto.
- I passaggi importanti includono la dissociazione enzimatica e la centrifugazione su Percoll per isolare le cellule.
- Le tecniche di immunomarcatura sono impiegate per analizzare ulteriormente le caratteristiche microgliali.
Risultati Principali
- Lo studio ha isolato con successo gli stati cellulari microgliali, rivelando la loro eterogeneità.
- Sono state ottenute informazioni sui ruoli microgliali durante lo sviluppo del cervelletto.
- È stata migliorata la comprensione delle implicazioni microgliali nei meccanismi di malattia.
Conclusioni
- Questo studio dimostra una metodologia robusta per analizzare gli stati microgliali.
- Contribuisce significativamente alla comprensione dei meccanismi neuronali e potenziali modelli di malattia.
- I risultati potrebbero aprire la strada a future strategie terapeutiche mirate alle funzioni microgliali.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
High-resolution characterization of microglial activation states in early postnatal mouse brain development is critical for de-risking neuroinflammation targets and understanding developmental mechanisms. Integrating flow cytometry and single-cell RNA sequencing enables robust, quantitative profiling of microglial heterogeneity, supporting predictive confidence in target validation and translational research. These methods provide a reproducible framework for advancing neuroimmune discovery programs and informing portfolio decisions in neurodevelopmental and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microglial activation states and population diversity.
- Supports functional target validation by linking surface marker expression to transcriptomic profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroimmune pathways in early development.
- Provides quantitative data for triaging neuroinflammation targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated cell isolation and gating strategies for reproducible microglia assays.
- Standardizes live/dead discrimination and marker profiling for downstream screening workflows.
- Enables scalable preparation of high-quality neural cell suspensions for compound evaluation.
- Supports platform reuse across multiple experimental conditions and perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial phenotyping with disease-relevant transcriptomic signatures.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of neurodevelopmental and neurodegenerative models.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in microglia-driven pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-method workflow bridges early discovery and preclinical research by enabling robust microglial profiling from cell isolation to transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and diversity during brain development.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for microglial marker expression and viability.
- Analytics: Delivers high-dimensional single-cell data and differential gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects microglial phenotypes to disease-relevant states and experimental perturbations.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable protocols for diverse brain regions and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of microglial profiling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroimmune targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, single-cell RNA sequencing, and neural tissue handling.
- Demands access to advanced instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell isolation and gating protocols.
- Adaptable to other brain regions with protocol optimization for tissue-specific characteristics.
- Dependent on validated antibodies and careful control of cell viability and state during processing.
