Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare i cambiamenti nei biofilm in risposta all'espettorato e agli antibiotici. Questo metodo può essere utilizzato dai ricercatori per comprendere domande chiave, come ad esempio come l'efficacia di vari antibiotici contro i biofilm batterici possa essere influenzata dalla presenza di espettorato. Il vantaggio principale di questa metodologia è che consente agli individui di vedere i cambiamenti che si verificano nei biofilm in risposta a diversi fattori.

Per iniziare l'esperimento, registrare il volume del campione di espettorato precedentemente ottenuto. Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, aggiungere due volte il volume del campione. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per miscelare accuratamente il campione.

Agitare il campione sull'impostazione più alta per un minuto per mescolarlo completamente. Aliquotare un millilitro della miscela in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare i tubi.

Dopo la centrifugazione, conservare il surnatante e scartare il pellet. Filtro: sterilizzare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micron e raccoglierlo in una provetta da microcentrifuga pulita. Conservare il surnatante dell'espettorato a 80 gradi Celsius per un uso futuro.

Mettere 40 microlitri di coltura precedentemente preparata in quattro millilitri di brodo Luria fresco, o terreno LB, e far crescere i batteri per ottenere una coltura con una densità ottica di 0,55 a 600 nanometri. Successivamente, diluire 100 microlitri di coltura 0,5 OD in 400 microlitri di filtrati di espettorato al 10% preparati in LB. Utilizzare 200 microlitri di diluizione per seminare i pozzetti delle camere dei vetrini. Lasciare che i batteri si attacchino per quattro ore a 37 gradi Celsius senza agitare.

Dopo quattro ore, rimuovere il terreno e lavare delicatamente il biofilm con 1X fresh LB. Sostituire il terreno rimanente con 200 microlitri di libbra fresca. Lascia che i biofilm crescano a 37 gradi Celsius senza scuotersi. Sostituire il terreno ogni 12 ore senza lavarlo fino a quando il biofilm non è pronto per la microscopia. È molto importante lavare delicatamente i vetrini in modo da non interrompere i batteri attaccati.

Dopo la crescita, rimuovere il terreno dai pozzetti della camera e lavare delicatamente ogni camera due volte con 300 microlitri di PBS sterile. Successivamente, per preparare la miscela di colorazione del biofilm, aggiungere un microlitro di ciascun colorante fornito nel kit di vitalità a ciascun millilitro di soluzione necessaria e mescolare la soluzione. La quantità ottimale di colorante e il tempo di colorazione sono determinati empiricamente per ogni organismo.

Aggiungere 200 microlitri della miscela colorante a ciascun pozzetto del vetro di copertura a camera. Incubare il vetro di copertura. Dopo l'incubazione, rimuovere la miscela colorante dalle camere e lavare ogni pozzetto con 300 microlitri di PBS sterile.

Sostituire il PBS con un nuovo supporto. Infine, procedere con la visualizzazione tramite microscopia confocale. Immagini rappresentative del complesso di Burkholderia cepacia, o isolati clinici BCC, dopo 48 ore di crescita in vetro di copertura a camera con terreni da soli o in presenza di filtrati di espettorato al 10% dimostrano che la loro presenza può modificare l'architettura del biofilm.

Le immagini sono state analizzate con il software Comstat per ottenere i parametri chiave del biofilm, tra cui lo spessore medio del biofilm, che è stato aumentato quando trattato con espettorato al 10%. Al fine di valutare gli effetti dei diversi fattori sulla crescita del biofilm, gli isolati clinici sono stati coltivati solo in terreno di coltura o con espettorato e sono stati trattati con o senza antibiotici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare e trattare i biofilm su un vetro di copertura a camera e prepararli per la colorazione e l'analisi confocale.