Name: Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Scopri come visualizzare e quantificare gli effetti dell'espettorato e degli antibiotici sui biofilm utilizzando un modello a camera su vetrino. Questo metodo consente l'osservazione diretta delle modifiche strutturali.

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TB riconosce un assegno di ricerca da Fibrosi Cistica Canada.

Si noti che la ricerca Consiglio di etica (REB) è necessario per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani. Questi studi sono stati approvati dal Hospital for Sick Children REB # 1.000.019,444 mila. 1. preparazione dei campioni dell&#39;espettorato CF <ol><li> Raccogliere campione di espettorato dai pazienti durante le visite di routine alla clinica fibrosi cistica e tenere in ghiaccio. </li><li> Trasporto del campione di espettorato sul ghiaccio entro la prima ora di raccolta, al laboratorio di ricerca, di sottoporsi a trattamento. </li></ol> 2. dell&#39;espettorato Processing <ol><li> Registrare il volume del campione di espettorato ottenuti. Aggiungere tampone fosfato salino (PBS) per 2 volte il volume del campione (ad esempio, 2 parti di PBS, 1 parte di campione). </li><li> Mescolare il campione bene con una pipetta di trasferimento. Vortex il campione sul valore massimo per 1 minuto per miscelare completamente. </li><li> Aliquota 1 ml della miscela sopra nel numero provette da 1,5 ml microcentrifuga appropriati e spin down a 5.000 xg per20 min a 4 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e scartare il pellet. </li><li> Filtro sterilizzare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron e raccogliere in una provetta pulita. NOTA: La sterilità del filtrato viene testato da placcatura su LB agar e inoculando mezzi liquidi. </li><li> Conservare il surnatante dell&#39;espettorato a -80 ° C per un uso futuro. NOTA: L&#39;espettorato da più pazienti possono anche essere raggruppati dopo la filtrazione. </li><li> Prima dell&#39;uso, diluire espettorato filtrato 1/10 v / v (100 ml di espettorato, 900 l di media) a supporto desiderato. NOTA: Qui, è stato utilizzato il brodo lisogenia standard (LB) media. </li></ol> 3. Metodo Chambered coprioggetti per la formazione di biofilm <ol><li> Crescere isolato batterico di interesse overnight a supporto desiderato a 37 ° C con agitazione (200 rpm). Nota: sono stati utilizzati una serie di diversi batteri, tra isolati clinici Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complesso Burkholderia cepacia e xylosoxidans Achromobacter. Scelta dei supporti dipende dalle tensioni e le condizioni di interesse, ma i media LB possono essere utilizzati per gli esperimenti iniziali. </li><li> Dalla cultura overnight, inserire 40 ml di coltura in 4 ml di mezzi freschi e crescere per 3-4 ore a 37 ° C con agitazione (200 rpm) per ottenere una coltura con una densità ottica a 600 nm (OD 600) di circa 0,5 -0.6. </li><li> Diluire la cultura dal punto 3.2 a 1/5 nel supporto desiderato con il 10% espettorato filtrato o senza filtrato espettorato (come controllo). Altro concentrazione di espettorato filtrato può essere testato (cioè, 50% o 100%). </li><li> Utilizzare 200 ml di diluizione per seminare pozzi di camere di diapositive. </li><li> Permettere ai batteri di attaccare per 4 ore a 37 ° C senza agitazione. </li><li> Dopo 4 ore, rimuovere il supporto e lavare delicatamente il biofilm con mezzi freschi 1x. Sostituire con 200 ml di mezzi freschi. NOTA: Per studiare gli effetti della sputo sul biofilm, i fresh media dovrebbero contenere espettorato surnatante. </li><li> Consentire biofilm di crescere per quantità desiderata di tempo a 37 ° C senza agitazione, sostituirà supporti ogni 12 ore, senza lavaggio fino al momento per microscopia. NOTA: Per studiare l&#39;effetto dei sovranatanti di espettorato su biofilm sensibilità agli antibiotici, gli antibiotici vengono aggiunti ai media dopo 24 ore di crescita di biofilm e sono mantenute nella media fino a quando la colorazione e l&#39;imaging di biofilm. </li></ol> 4. colorazione biofilm e Microscopia confocale <ol><li> Dopo il tempo di crescita desiderato (24-48 hr funziona meglio), rimuovere i supporti da pozzi da camera e lavare delicatamente ciascuna camera due volte con 300 ml di PBS sterile. </li><li> Preparare la miscela di colorazione per biofilm mescolando 1 ml di ciascun colorante (fornito nel kit fattibilità) per ogni ml di soluzione necessaria. Fai la tintura in acqua o mezzi soluzione. NOTA: L&#39;acqua è consigliato dal produttore. </li><li> Aggiungere 200 ul di miscela colorante in ciascun pozzetto della covergla chamberedss ed incubare a temperatura ambiente, al buio per 45 min. </li><li> Rimuovere miscela colorazione dalle camere e lavare bene ogni con 300 ml di PBS sterile. Rimuovere PBS e sostituirlo con acqua dolce o media. </li><li> Procedere con la visualizzazione di biofilm mediante microscopia confocale. </li></ol> 5. Visualizzazione biofilm con Microscopia confocale <ol><li> Leggi biofilm macchiati in camere immediatamente dopo la colorazione (entro 1 ora). Minimizzare ritardo nella visualizzazione delle diapositive colorando 1 a 2 camere 8 pozzetti alla volta. </li><li> Eseguire l&#39;imaging utilizzando microscopio confocale con i laser per l&#39;eccitazione e di filtro set per l&#39;acquisizione. NOTA: Qui, il disco di sistema confocale di filatura con i laser Borealis spettrali (Verde: 491nm, colore rosso: 561 nm) sono stati utilizzati per l&#39;eccitazione. filtro per le emissioni set di 515/40 e 624/40 sono stati usati per visualizzare le macchie dal kit biofilm viabilità. </li><li> Prendere le immagini utilizzando un obiettivo 25X acqua sul microscopio confocale con la macchina fotografica. </li><li&gt; Usa Z-Stack per modellare il biofilm. Prendere immagini ogni 0,5-1 micron a partire dal primo piano di messa a fuoco per l&#39;ultimo fotogramma di messa a fuoco del biofilm (in genere si estende 30-80 micron per 48 biofilm hr) </li><li> Prendere 3-5 immagini da ogni pozzetto. NOTA: Così per un 8 coprioggetti ben camerata, 24-40 immagini saranno generate. </li><li> Salvare le immagini per l&#39;analisi. NOTA: Le immagini devono essere salvati come file OME-TIFF per essere analizzati utilizzando COMSTAT 18,19. Istruzioni per l&#39;analisi delle immagini biofilm possono essere trovati a http://www.comstat.dk/. Una volta che le immagini vengono importate, parametri come spessore medio, biomassa e la copertura di superficie per ogni canale (rosso e verde) possono essere analizzati. </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
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<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
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<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
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<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
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<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dei biofilm batterici cresciute in presenza di prodotti esogeni. Non sorprendentemente, la produzione dei exoproducts è di importanza quando si utilizza questo tipo di sistema. Per esempio, ditiotreitolo (DTT), è spesso usato su campioni di espettorato umani per aiutare a liquefare i campioni. Tuttavia, l&#39;effetto di DTT solo può diminuire sviluppo biofilm e vitalità (dati non mostrati). Quindi, controlli appropriati per tutte le condizioni sono necessarie. Inoltre...

biofilm batterici sono gruppi di microrganismi che sono attaccati l&#39;uno all&#39;altro e racchiuso in una matrice di auto-secreta. 1,2 Classicamente, rappresentano i batteri fisicamente collegati a una superficie abiotico o biotico formata in condizioni di flusso. I biofilm hanno anche dimostrato di crescere in condizioni statiche (assenza di flusso) e distale da superfici, come ad esempio all&#39;interfaccia aria-liquido di piscine termali o pellicole formate in provetta. Questi biofilm sono da tempo riconosciuti nell&#39;ambiente e sono un grande danno per processi industriali, in quanto possono formare in serbatoi di acqua o in tubi, con conseguente biofouling, corrosione e blocchi. 3,4 I biofilm sono anche critici in ambienti sanitari, in quanto è stato dimostrato essere coinvolti nelle infezioni correlate al catetere, infezioni polmonari nei pazienti affetti da fibrosi cistica, così come in numerose altre infezioni. 5,6 Una delle caratteristiche di infezioni biofilm è la desgualcita sensibilità dei batteri agli antibiotici e compromessa rinvio del sistema immunitario innato. 7-9 Il più studiati, scenari clinicamente rilevanti che coinvolgono infezione biofilm-based si verifica in pazienti affetti da fibrosi cistica (FC), che sono cronicamente infettati con Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa può subire una serie di modifiche durante la creazione di infezione cronica che lo rendono molto difficile da trattare. 10,11 I biofilm possono differenziale attivare l&#39;immunità innata e guidare l&#39;infiammazione. 12-14 Poiché queste infezioni portano ad un aumento della morbilità e mortalità nei pazienti con FC, è fondamentale per capire i fattori che possono influenzare lo sviluppo del biofilm in questo contesto. Un recente studio suggerisce che ospitano-fattori critici nella formazione di P. aeruginosa aggregati biofilm. 15 Questi biofilm contribuiscono alla ridotta sensibilità agli antibiotici e meccanismi di difesa dell&#39;ospite. il PreseSNO di fattori dell&#39;ospite-derivati, come elastasi neutrofila, così come i prodotti secreti da microrganismi presenti nel polmone CF, hanno il potenziale di modulare notevolmente la formazione di biofilm e sviluppo. 16 Inoltre, biofilm interagiscono con l&#39;host di modulare l&#39;espressione di numerosi percorsi e avviare l&#39;infiammazione. Mentre i metodi high throughput, quali il test cristalvioletto standard possono fornire alcune informazioni per quanto riguarda il processo di biofilm, visualizzazione del biofilm in risposta a questi fattori fornire informazioni più approfondite. In questo manoscritto si descrive un metodo per l&#39;utilizzo di fattori dalla nell&#39;espettorato di pazienti con FC per studiare lo sviluppo di biofilm in vitro. Questo metodo consente la visualizzazione rapida dei biofilm esposti a espettorato contenente fattori host utilizzando un kit di biofilm redditività commerciale. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare visivamente i cambiamenti che si verificano durante la crescita di biofilm in presenza di exogenonoi prodotti, e rappresenta un metodo migliore per analizzare i cambiamenti nello sviluppo del biofilm in varie condizioni.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Coverglass a camera, borosilicato #1.5, 8 pozzetti</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per agar sanguigno</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Conferma della vitalità tramite conta CFU o selezione di colonie per l'inoculazione</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Software disponibile online</td><td></td><td>COMSTAT è un software per l'analisi delle immagini del biofilm. Disponibile www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Terreni standard per la crescita notturna di gowth/biofilm</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe Millex-GV</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtraggio dei supernants dell'espettorato</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Lavaggio delle camere del biofilm dopo la rimozione del terreno</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Le istruzioni per questo software sono disponibili all'indirizzo: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello chambered coprioggetti

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

I biofilm sono costituiti da gruppi di batteri racchiusi in una matrice di auto-secreto. Essi svolgono un ruolo importante nella contaminazione industriale e nello sviluppo e la persistenza di molte infezioni salute correlati. Uno dei biofilm più ben descritti e studiati nelle malattie umane avviene in infezione cronica polmonare dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Studiando biofilm nel contesto dell&#39;ospite, molti fattori possono influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Al fine di individuare come fattori dell&#39;ospite possono influenzare la formazione di biofilm e sviluppo, abbiamo usato un metodo coprioggetti Chambered statica a crescere biofilm in presenza di fattori dell&#39;ospite-derivati ​​in forma di surnatanti espettorato. I batteri sono seminate nelle camere e esposti a filtrati espettorato. Dopo 48 ore di crescita, biofilm sono macchiate di un biofilm kit commerciale viabilità prima di microscopia e analisi confocale. A seguito di acquisizione delle immagini, le proprietà biofilm possono essere valutati utilizzando piattaforme software differenti.Questo metodo ci permette di visualizzare le proprietà principali della crescita di biofilm in presenza di sostanze diverse, tra cui antibiotici.

Il disegno complessivo di questo esperimento è rappresentata in figura 1. L&#39;uso di questo protocollo fornisce un metodo conveniente per visualizzare le variazioni di biofilm coltivate per diversi periodi di tempo (ad esempio, 24, 48 o 72 hr). È importante sottolineare che i segnali esogeni, quali espettorato filtrati, possono essere aggiunti per visualizzare i cambiamenti nello sviluppo biofilm. Come si vede nella figura 2, la presenza del 1...

Questo protocollo descrive la visualizzazione dello sviluppo del biofilm in seguito all'esposizione a fattori ospiti utilizzando un modello a camera di vetrini. Questo modello consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del biofilm e l'analisi dei parametri del biofilm utilizzando programmi software per computer.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare e quantificare i cambiamenti nei biofilm in risposta allo sputo e agli antibiotici. Questo metodo può essere utilizzato dai ricercatori per comprendere domande fondamentali, come ad esempio in che modo l'efficacia di diversi antibiotici contro i biofilm batterici possa essere influenzata dalla presenza di sputo. Il principale vantaggio di questa metodologia è che consente di osservare i cambiamenti che avvengono nei biofilm in risposta a diversi fattori.Per iniziare l'esperimento, registrare il volume del campione di espettorato ottenuto in precedenza. Aggiungere soluzione salina tamponata al fosfato, o PBS, in una quantità pari a due volte il volume del campione. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento per mescolare accuratamente il campione.Agitare il campione al massimo regime per un minuto per mescolarlo completamente. Aliquotare un millilitro della miscela in provette microcentrifughe da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare le provette.Dopo la centrifugazione, conservare il soprannatante e scartare il pellet. Sterilizzare il soprannatante mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,22 micron e raccoglierlo in un tubo microcentrifuga pulito. Conservare il soprannatante dell'espettorato a 80 gradi Celsius per utilizzi futuri.Aggiungere 40 microlitri di coltura precedentemente preparata in quattro millilitri di brodo Luria fresco, o terreno LB, e coltivare i batteri fino al raggiungimento di una densità ottica pari a 0,55 a 600 nanometri. Successivamente, diluire 100 microlitri di coltura a OD 0,5 in 400 microlitri di filtrati di espettorato al 10% preparati in LB. Utilizzare 200 microlitri della diluizione per inoculare le camere del vetrino. Lasciare aderire i batteri per quattro ore a 37 gradi Celsius senza agitazione.Dopo quattro ore, rimuovere il mezzo e lavare delicatamente il biofilm con LB fresco 1X. Sostituire il mezzo residuo con 200 microlitri di LB fresco. Lasciare crescere i biofilm a 37 gradi Celsius senza agitazione. Sostituire il mezzo ogni 12 ore senza lavaggio, fino a quando il biofilm è pronto per la microscopia. È molto importante lavare le lamelle delicatamente per non disturbare i batteri aderenti.Dopo la crescita, rimuovere il mezzo dai pozzetti della camera e lavare delicatamente ogni camera due volte con 300 microlitri di PBS sterile. Successivamente, per preparare la miscela di colorazione del biofilm, aggiungere un microlitro di ciascun colorante fornito nel kit di vitalità per ogni millilitro di soluzione necessaria e mescolare la soluzione. La quantità ottimale di colorante e il tempo di colorazione vengono determinati empiricamente per ciascun organismo.Aggiungere 200 microlitri della miscela di colorazione in ciascun pozzetto della camera con coprivetro. Incubare il coprivetro. Al termine dell'incubazione, rimuovere la miscela di colorazione dalle camere e lavare ogni pozzetto con 300 microlitri di PBS sterile.Sostituire il PBS con del mezzo fresco. Infine, procedere alla visualizzazione mediante microscopia confocale. Immagini rappresentative del complesso di Burkholderia cepacia, o isolati clinici BCC, dopo 48 ore di crescita su camere porta-oggetti in vetro con mezzo solo o in presenza di filtrati di espettorato al 10%, dimostrano che la loro presenza può modificare l'architettura del biofilm.Le immagini sono state analizzate con il software Comstat per ottenere parametri chiave del biofilm, tra cui lo spessore medio del biofilm, che è aumentato quando trattato con il 10% di espettorato. Al fine di valutare gli effetti dei diversi fattori sulla crescita del biofilm, sono stati coltivati isolati clinici in terreno solo o con espettorato, e ciascuno è stato trattato o meno con antibiotico. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come formare e trattare i biofilm su vetrini a camera e prepararli per la colorazione e l'analisi confocale.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo articolo descrive diversi metodi di...

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Questo articolo descrive la procedura per la formazione e la visualizzazione di un biofilm batterico cresciuto all'interno di un 8-scivolo e da...

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizzazione degli effetti dell'expectorone sullo sviluppo del biofilm utilizzando un modello a coverglass camerato. J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra l'uso di un coverglass a camera per studiare l'effetto dei fattori dell'espettorato derivati dal paziente sul sviluppo del biofilm batterico.

Un metodo di coverglass a camera per la formazione in vitro di biofilm batterico

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizzazione degli effetti dell'expectorone sullo sviluppo del biofilm utilizzando un modello a coverglass camerato. J. Vis. Esp. (2016)Questo video mostra un metodo in vitro per valutare come la fibrosi cistica derivata dal paziente influenzi la formazione di biofilm batterico. Utilizzando vetri da camera, colorazione fluorescente e microscopia confocale, rivela uno spessore aumentato, un'architettura alterata e una biomassa vitale più elevata nei biofilm...

Imaging confocale di biofilm batterici indotti da filtrati dell'expectorato in pazienti con fibrosi cistica

Vengono discussi i protocolli per lo studio della formazione di biofilm in un dispositivo microfluidico che imita i mezzi porosi. Il dispositivo microfluidico è costituito da una serie di micro-pilastri e viene studiata la formazione di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens in questo dispositivo.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Questo studio presenta lo sviluppo di metodologie riproducibili per studiare gli inibitori del biofilm e i loro effetti sulla multicellularità del Bacillus subtilis.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

Le vie respiratorie del flusso mucoso di fibrosi cistica (CF) sono un ambiente ideale per i patogeni microbici a prosperare. Il manoscritto descrive un nuovo metodo per studiare il microbioma polmonare CF in un ambiente che imita dove provocano malattie e come le alterazioni delle condizioni chimiche possano guidare la dinamica microbica.

Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Descriviamo l'assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

Le alterazioni indotte da antimicrobici dell'architettura del biofilm di Pseudomonas aeruginosa differiscono tra gli isolati clinici coltivati da pazienti con fibrosi cistica e infezione polmonare cronica. Dopo la microscopia confocale, il software COMSTAT può essere utilizzato per quantificare le variazioni nell'architettura del biofilm (ad esempio, area superficiale, spessore, biomassa) per i singoli isolati per valutare l'efficacia degli agenti anti-infettivi.

Quantificazione degli effetti degli antimicrobici sull'architettura del biofilm in vitro utilizzando il software COMSTAT

Scopri come visualizzare e quantificare gli effetti dell'espettorato e degli antibiotici sui biofilm utilizzando un modello a camera su vetrino. Questo metodo consente l'osservazione diretta delle modifiche strutturali.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

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