Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti
14 dicembre 2016
Questo protocollo descrive la visualizzazione dello sviluppo del biofilm in seguito all'esposizione a fattori ospiti utilizzando un modello a camera di vetrini. Questo modello consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del biofilm e l'analisi dei parametri del biofilm utilizzando programmi software per computer.
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare i cambiamenti nei biofilm in risposta all'espettorato e agli antibiotici. Questo metodo può essere utilizzato dai ricercatori per comprendere domande chiave, come ad esempio come l'efficacia di vari antibiotici contro i biofilm batterici possa essere influenzata dalla presenza di espettorato. Il vantaggio principale di questa metodologia è che consente agli individui di vedere i cambiamenti che si verificano nei biofilm in risposta a diversi fattori.
Per iniziare l'esperimento, registrare il volume del campione di espettorato precedentemente ottenuto. Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, aggiungere due volte il volume del campione. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per miscelare accuratamente il campione.
Agitare il campione sull'impostazione più alta per un minuto per mescolarlo completamente. Aliquotare un millilitro della miscela in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare i tubi.
Dopo la centrifugazione, conservare il surnatante e scartare il pellet. Filtro: sterilizzare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micron e raccoglierlo in una provetta da microcentrifuga pulita. Conservare il surnatante dell'espettorato a 80 gradi Celsius per un uso futuro.
Mettere 40 microlitri di coltura precedentemente preparata in quattro millilitri di brodo Luria fresco, o terreno LB, e far crescere i batteri per ottenere una coltura con una densità ottica di 0,55 a 600 nanometri. Successivamente, diluire 100 microlitri di coltura 0,5 OD in 400 microlitri di filtrati di espettorato al 10% preparati in LB. Utilizzare 200 microlitri di diluizione per seminare i pozzetti delle camere dei vetrini. Lasciare che i batteri si attacchino per quattro ore a 37 gradi Celsius senza agitare.
Dopo quattro ore, rimuovere il terreno e lavare delicatamente il biofilm con 1X fresh LB. Sostituire il terreno rimanente con 200 microlitri di libbra fresca. Lascia che i biofilm crescano a 37 gradi Celsius senza scuotersi. Sostituire il terreno ogni 12 ore senza lavarlo fino a quando il biofilm non è pronto per la microscopia. È molto importante lavare delicatamente i vetrini in modo da non interrompere i batteri attaccati.
Dopo la crescita, rimuovere il terreno dai pozzetti della camera e lavare delicatamente ogni camera due volte con 300 microlitri di PBS sterile. Successivamente, per preparare la miscela di colorazione del biofilm, aggiungere un microlitro di ciascun colorante fornito nel kit di vitalità a ciascun millilitro di soluzione necessaria e mescolare la soluzione. La quantità ottimale di colorante e il tempo di colorazione sono determinati empiricamente per ogni organismo.
Aggiungere 200 microlitri della miscela colorante a ciascun pozzetto del vetro di copertura a camera. Incubare il vetro di copertura. Dopo l'incubazione, rimuovere la miscela colorante dalle camere e lavare ogni pozzetto con 300 microlitri di PBS sterile.
Sostituire il PBS con un nuovo supporto. Infine, procedere con la visualizzazione tramite microscopia confocale. Immagini rappresentative del complesso di Burkholderia cepacia, o isolati clinici BCC, dopo 48 ore di crescita in vetro di copertura a camera con terreni da soli o in presenza di filtrati di espettorato al 10% dimostrano che la loro presenza può modificare l'architettura del biofilm.
Le immagini sono state analizzate con il software Comstat per ottenere i parametri chiave del biofilm, tra cui lo spessore medio del biofilm, che è stato aumentato quando trattato con espettorato al 10%. Al fine di valutare gli effetti dei diversi fattori sulla crescita del biofilm, gli isolati clinici sono stati coltivati solo in terreno di coltura o con espettorato e sono stati trattati con o senza antibiotici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare e trattare i biofilm su un vetro di copertura a camera e prepararli per la colorazione e l'analisi confocale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la visualizzazione e la quantificazione dello sviluppo del biofilm in risposta a espettorato e antibiotici, utilizzando un modello a camera per vetrino. Questo modello consente l'osservazione diretta delle modifiche del biofilm e permette un'analisi dettagliata mediante software informatico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Ricerca sui biofilm
- Efficacia degli antibiotici
Sfondo
- I biofilm sono comunità complesse di microrganismi.
- Comprendere la risposta dei biofilm agli antibiotici è fondamentale per le strategie terapeutiche.
- L’espettorato può influenzare l’efficacia degli antibiotici nei confronti dei biofilm.
- Questo studio mira a visualizzare efficacemente queste interazioni.
Scopo dello studio
- Visualizzare i cambiamenti nei biofilm a seguito dell'esposizione a espettorato e antibiotici.
- Quantificare l'impatto dei fattori dell'ospite sullo sviluppo dei biofilm.
- Migliorare la comprensione dell'efficacia degli antibiotici contro i biofilm.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni di espettorato.
- Diluizione dell'espettorato con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS).
- Mescolamento dei campioni per garantire uniformità.
- Visualizzazione dello sviluppo del biofilm mediante un modello a camera portavetrino.
Risultati principali
- Visualizzazione diretta dei cambiamenti del biofilm in risposta agli antibiotici.
- Analisi quantitativa dei parametri del biofilm.
- Informazioni sull'interazione tra espettorato e risposta del biofilm.
- Dimostrazione dell'efficacia di diversi antibiotici.
Conclusioni
- Il modello con camera da microscopio è efficace per lo studio della dinamica dei biofilm.
- Fattori dell'ospite come l'espettorato influenzano in modo significativo il comportamento del biofilm.
- Questa metodologia può fornire indicazioni per future strategie di trattamento antibiotico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione quantitativa dello sviluppo del biofilm in presenza di espettorato di origine ospite e antibiotici affronta una sfida fondamentale nella scoperta di agenti anti-infettivi e nella fedeltà del modello traslazionale. Questo approccio consente una riduzione del rischio meccanicistica, rivelando come i fattori dell'ospite modulino l'efficacia degli antibiotici e l'architettura del biofilm, fornendo informazioni per la validazione precoce dei bersagli e per le strategie di screening. Il metodo sostiene un livello predittivo di affidabilità nelle decisioni di portafoglio per la ricerca e sviluppo in malattie infettive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardo l'influenza dei fattori dell'ospite sulla resilienza del biofilm.
- Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando la risposta del biofilm agli antibiotici in matrici rilevanti per la malattia.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi misurando la vitalità e l'architettura del biofilm in condizioni definite.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di biofilm validati per lo screening di composti in condizioni di rilevanza clinica.
- Standardizza le condizioni del saggio per garantire riproducibilità e confronti quantitativi tra i diversi bracci sperimentali.
- Genera output robusti e quantitativi, come lo spessore del biofilm e la vitalità, per una valutazione affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli di biofilm in vitro ad ambienti ospite rilevanti per la malattia, migliorando la continuità traslazionale.
- Permette un avanzamento proporzionato al rischio rivelando le prestazioni degli antibiotici in matrici biologiche complesse.
- Fornisce informazioni meccanicistiche sulle interazioni ospite-patogeno-farmaco per una riduzione predittiva del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello di coprivetrino a camere si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test basati su ipotesi dell'efficacia degli antibiotici in sistemi di biofilm mimetici dell'ospite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'impatto dei fattori dell'ospite e la chiarificazione dei percorsi coinvolti nello sviluppo del biofilm.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per la priorizzazione di composti in contesti di biofilm.
- Analisi: Offre misurazioni basate su immagini e risultati statistici per il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici mediante l'incorporazione di matrici rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e adattabile per la valutazione ripetuta di strategie anti-biofilm.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca e sviluppo di agenti anti-infettivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi sui biofilm.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza del capitale rivelando l'efficacia contestuale dei farmaci.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati corretta per il rischio in base alle prestazioni in sistemi mimetici dell'ospite.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di biofilm, nella microscopia confocale e nell'analisi quantitativa delle immagini.
- Necessita dell'accesso a sistemi con camere di coltura su vetrino, kit per la colorazione della vitalità e software analitici come Comstat.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dei campioni e di acquisizione delle immagini.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse specie batteriche o matrici di origine ospite.
- Dipende dall'ottimizzazione empirica dei parametri di colorazione e di acquisizione per ciascun organismo.
