Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti
December 14th, 2016
Questo protocollo descrive la visualizzazione dello sviluppo del biofilm in seguito all'esposizione a fattori ospiti utilizzando un modello a camera di vetrini. Questo modello consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del biofilm e l'analisi dei parametri del biofilm utilizzando programmi software per computer.
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare i cambiamenti nei biofilm in risposta all'espettorato e agli antibiotici. Questo metodo può essere utilizzato dai ricercatori per comprendere domande chiave, come ad esempio come l'efficacia di vari antibiotici contro i biofilm batterici possa essere influenzata dalla presenza di espettorato. Il vantaggio principale di questa metodologia è che consente agli individui di vedere i cambiamenti che si verificano nei biofilm in risposta a diversi fattori.
Per iniziare l'esperimento, registrare il volume del campione di espettorato precedentemente ottenuto. Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, aggiungere due volte il volume del campione. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per miscelare accuratamente il campione.
Agitare il campione sull'impostazione più alta per un minuto per mescolarlo completamente. Aliquotare un millilitro della miscela in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare i tubi.
Dopo la centrifugazione, conservare il surnatante e scartare il pellet. Filtro: sterilizzare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micron e raccoglierlo in una provetta da microcentrifuga pulita. Conservare il surnatante dell'espettorato a 80 gradi Celsius per un uso futuro.
Mettere 40 microlitri di coltura precedentemente preparata in quattro millilitri di brodo Luria fresco, o terreno LB, e far crescere i batteri per ottenere una coltura con una densità ottica di 0,55 a 600 nanometri. Successivamente, diluire 100 microlitri di coltura 0,5 OD in 400 microlitri di filtrati di espettorato al 10% preparati in LB. Utilizzare 200 microlitri di diluizione per seminare i pozzetti delle camere dei vetrini. Lasciare che i batteri si attacchino per quattro ore a 37 gradi Celsius senza agitare.
Dopo quattro ore, rimuovere il terreno e lavare delicatamente il biofilm con 1X fresh LB. Sostituire il terreno rimanente con 200 microlitri di libbra fresca. Lascia che i biofilm crescano a 37 gradi Celsius senza scuotersi. Sostituire il terreno ogni 12 ore senza lavarlo fino a quando il biofilm non è pronto per la microscopia. È molto importante lavare delicatamente i vetrini in modo da non interrompere i batteri attaccati.
Dopo la crescita, rimuovere il terreno dai pozzetti della camera e lavare delicatamente ogni camera due volte con 300 microlitri di PBS sterile. Successivamente, per preparare la miscela di colorazione del biofilm, aggiungere un microlitro di ciascun colorante fornito nel kit di vitalità a ciascun millilitro di soluzione necessaria e mescolare la soluzione. La quantità ottimale di colorante e il tempo di colorazione sono determinati empiricamente per ogni organismo.
Aggiungere 200 microlitri della miscela colorante a ciascun pozzetto del vetro di copertura a camera. Incubare il vetro di copertura. Dopo l'incubazione, rimuovere la miscela colorante dalle camere e lavare ogni pozzetto con 300 microlitri di PBS sterile.
Sostituire il PBS con un nuovo supporto. Infine, procedere con la visualizzazione tramite microscopia confocale. Immagini rappresentative del complesso di Burkholderia cepacia, o isolati clinici BCC, dopo 48 ore di crescita in vetro di copertura a camera con terreni da soli o in presenza di filtrati di espettorato al 10% dimostrano che la loro presenza può modificare l'architettura del biofilm.
Le immagini sono state analizzate con il software Comstat per ottenere i parametri chiave del biofilm, tra cui lo spessore medio del biofilm, che è stato aumentato quando trattato con espettorato al 10%. Al fine di valutare gli effetti dei diversi fattori sulla crescita del biofilm, gli isolati clinici sono stati coltivati solo in terreno di coltura o con espettorato e sono stati trattati con o senza antibiotici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare e trattare i biofilm su un vetro di copertura a camera e prepararli per la colorazione e l'analisi confocale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la visualizzazione e la quantificazione dello sviluppo del biofilm in risposta allo sputo e agli antibiotici utilizzando un modello di camera su diapositiva. Questo modello facilita l'osservazione diretta dei cambiamenti del biofilm e permette un'analisi dettagliata utilizzando software per computer.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Microbiologia
- Ricerca sul biofilm
- Efficacia degli antibiotici
Contesto
- I biofilm sono comunità complesse di microrganismi.
- Comprendere la risposta del biofilm agli antibiotici è cruciale per le strategie di trattamento.
- Lo sputo può influenzare l'efficacia degli antibiotici contro i biofilm.
- Questo studio mira a visualizzare efficacemente queste interazioni.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare i cambiamenti nei biofilm dovuti all'esposizione allo sputo e agli antibiotici.
- Quantificare l'impatto dei fattori ospite sullo sviluppo del biofilm.
- Migliorare la comprensione dell'efficacia degli antibiotici contro i biofilm.
Metodi utilizzati
- Raccolta di campioni di sputo.
- Diluzione dello sputo con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Miscela dei campioni per uniformità.
- Visualizzazione dello sviluppo del biofilm utilizzando un modello di camera su diapositiva.
Principali risultati
- Visualizzazione diretta dei cambiamenti del biofilm in risposta agli antibiotici.
- Analisi quantitativa dei parametri del biofilm.
- Approfondimenti sull'interazione tra lo sputo e la risposta del biofilm.
- Dimostrazione dell'efficacia di diversi antibiotici.
Conclusioni
- Il modello di camera su diapositiva è efficace per studiare le dinamiche del biofilm.
- Fattori ospite come lo sputo influenzano significativamente il comportamento del biofilm.
- Questa metodologia può informare le future strategie di trattamento con antibiotici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of biofilm development in the presence of host-derived sputum and antibiotics addresses a critical challenge in anti-infective discovery and translational model fidelity. This approach enables mechanistic de-risking by revealing how host factors modulate antibiotic efficacy and biofilm architecture, informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding host factor influence on biofilm resilience.
- Supports biological de-risking by quantifying biofilm response to antibiotics in disease-relevant matrices.
- Facilitates functional target validation by measuring biofilm viability and architecture under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biofilm systems for downstream compound screening in the presence of clinically relevant factors.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and quantitative comparison across experimental arms.
- Generates robust, quantitative outputs such as biofilm thickness and viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant host environments, enhancing translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing antibiotic performance in complex biological matrices.
- Provides mechanistic insight into host-pathogen-drug interactions for predictive de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This chambered coverglass model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of antibiotic efficacy in host-mimetic biofilm systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on host factor impact and pathway clarification in biofilm development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound prioritization in biofilm contexts.
- Analytics: Provides image-based measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by incorporating disease-relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated evaluation of anti-biofilm strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective R&D.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biofilm assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing context-dependent drug efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on performance in host-mimetic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biofilm culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to chambered coverglass systems, viability staining kits, and analytical software such as Comstat.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different bacterial species or host-derived matrices.
- Dependent on empirical optimization of staining and imaging parameters for each organism.
