Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in Staphylococcus aureus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una metodologia dettagliata per studiare la trasmissione orizzontale del DNA nello stafilococco aureo affrontando le tre principali vie di trasferimento. Coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale. Questo metodo riguarda il trasferimento orizzontale di geni resistenti agli antibiotici nel patogeno umano stafilococco aureo.

Il vantaggio principale delle tecniche qui presentate è che possiamo testare tre principali modalità di trasferimento, tra cui la trasformazione genetica naturale scoperta di recente. A dimostrare la procedura sarà Le Thuy, uno studente di dottorato del nostro laboratorio. Per iniziare l'esperimento, preparare cinque millilitri di coltura notturna del donatore e dei batteri riceventi in brodo di soia triptico. O TSB medio con e senza 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo, rispettivamente.

Con agitazione a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, regolare la densità ottica delle colture notturne su una con terreno TSB fresco. Mescolare 0,5 millilitri della coltura del donatore con 0,5 millilitri della coltura ricevente.

E aggiungi un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, alla miscela. Quindi, utilizzando un sistema a pompa a vuoto, trasferire la miscela di batteri su una membrana filtrante da 0,45 micrometri. Posizionare le membrane del filtro su una piastra di agar di sangue di pecora.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un giorno. Estrarre la membrana filtrante dalla piastra e sospenderla in 10 millilitri di PBS. Agitare la miscela per circa un minuto per raccogliere tutti i batteri attaccati alla membrana.

Effettuare una diluizione seriale di 10 volte della sospensione batterica con TSB fresco. Piastra 100 microlitri dei campioni diluiti 0, 10, 4 su agar TSB. O piastre TSA integrate con 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo e otto milligrammi per litro di tetraciclina per selezionare i transconiuganti.

Piastra 100 microlitri della sospensione diluita su piastre TSA con otto milligrammi per litro di tetraciclina da sola. Per contare il numero totale di destinatari. Dopo l'incubazione, analizzare le colonie a doppia resistenza per la presenza del gene CFR mediante PCR di colonia e i loro profili di suscettibilità.

Determinare l'antibiogramma misurando le concentrazioni inibitorie minime, MIC, di antibiotici appropriati secondo il metodo standard di microdiluizione o il metodo di diffusione del disco. Il profilo di suscettibilità dei transconiuganti deve essere identico a quello del ricevente. Ad eccezione del cloramfenicolo e di altri composti influenzati dal gene CFR.

Escludere la resistenza alla tetraciclina sviluppata dal ceppo donatore. Preparare una coltura notturna di N315-45 in cinque millilitri di brodo nutriente integrato con 3,6 millimolari di calcio. Preparare le sottocolture diluendo la coltura notturna da uno a 1.000 in un volume finale di 10 millilitri in fiale di vetro da 50 millilitri.

Far crescere i batteri per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione, 180 rotazioni al minuto. Successivamente, preparare una serie di fagi MR83a diluiti in terreno di cloruro di calcio NB. Aggiungere 20 microlitri di fago diluito nella coltura batterica.

Preparare una coltura di controllo senza infezione da fagi che funga da controllo positivo per la crescita delle cellule batteriche. Quindi far crescere le colture a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione a 100 rotazioni al minuto durante la notte. Il giorno successivo selezionare una o due fiale di coltura autorizzate con la massima diluizione del fago aggiunto.

Trasferire le colture in provette da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere 250 microlitri di cloroformio alle provette e mescolare accuratamente la coltura capovolgendole. Centrifugare la coltura a 5.000 volte G per 20 minuti a 4 gradi Celsius.

Trasferire i surnatanti in tubi freschi e conservarli a 4 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Preparare il brodo nutriente agar medium e tenerlo caldo a bagnomaria a 55 gradi Celsius. Aggiungere una soluzione autoclavata di cloruro di calcio 0,5 molare al terreno fino a una concentrazione finale di 3,6 millimolari.

Versarlo in piastre di cloruro di calcio NB da 90 millimetri. Preparare una coltura notturna di N315 in cinque millilitri di cloruro di calcio NB a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo aggiungere 10 microlitri di coltura notturna in 200 microlitri di cloruro di calcio NB e distribuirlo uniformemente sulla piastra di cloruro di calcio NB.

Interrompere lo spargimento quando la superficie della piastra è ricoperta di liquido. Quindi lasciare asciugare la piastra per cinque minuti. Effettuare una diluizione seriale da uno a 10 del fago precedentemente preparato utilizzando un terreno di cloruro di calcio NB.

Individuare tre microlitri di ciascuna diluizione dei fagi sulla piastra ricoperta di batteri. Incubare la piastra per una notte a 30 gradi Celsius. La mattina seguente, conta i numeri della placca e calcola il titolo dei fagi utilizzando la seguente equazione.

Preparare la coltura notturna di N315, COL o MU50, in cinque millilitri di cloruro di calcio NB a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 rotazioni al minuto. Dopo la coltura notturna, diluire il fago in NB cloruro di calcio a 109 PFU per millilitro. In una fiala di vetro da 50 millilitri, mescolare 500 microlitri di coltura notturna, 500 microlitri di cloruro di calcio NB fresco e un millilitro di fago 109 PFU per millilitro.

Incubare la miscela a 37 gradi Celsius agitando delicatamente a 100 rotazioni al minuto per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di citrato trisodico al 20% alle colture. Continuare l'agitazione delicata per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Preparare l'infuso di cuore di cervello fuso o il terreno di agar BHI e tenerlo a bagnomaria a 55 gradi Celsius e trattare il terreno di agar con 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo. Quindi trasferire la miscela di fagi batterici in un pallone da 100 millilitri. Aggiungere 50 millilitri di agar BHI caldo integrato con 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo e mescolare bene.

Versare il composto nelle piastre di Petri da 90 millimetri. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Testare ulteriormente la resistenza delle colonie generate, i trasduttori, trasferendo le colonie su nuove piastre di agar BHI integrate con 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo.

Confermare la presenza del gene CFR mediante PCR di colonia. Coltivare la cellula ricevente durante la notte, in cinque millilitri di TSB a 37 gradi Celsius con agitazione. La mattina seguente, trasferire 0,5 millilitri di coltura notturna in una provetta da 1,5 millilitri.

Precipitare le cellule per centrifugazione. Quindi sospendere le cellule con 10 millilitri di terreno CS2 in una provetta da 50 millilitri. Successivamente, far crescere i batteri a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 rotazioni al minuto per otto ore fino alla fase esponenziale tardiva.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno CS2 fresco. Aggiungere 10 microgrammi di plasmide purificato o DNA genomico alla sospensione cellulare.

Agitare la coltura a 180 rotazioni al minuto. Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno BHI.

Mescolare la sospensione cellulare con 90 millilitri di integratore di agar BHI fuso con 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo e cinque microgrammi per litro di tetraciclina nell'esperimento di controllo. Versare il composto nelle piastre di Petri da 90 millimetri e raffreddare rapidamente e lasciare solidificare l'agar. Replicare le colonie utilizzando stuzzicadenti su piastre contenenti antibiotici appropriati per confermare le loro caratteristiche di resistenza.

Il protocollo di coniugazione è utile per la trasmissione intra-specie in cui lo staphylococcus epidermidis è stato utilizzato come donatore di CFR. E il ceppo di stafilococco aureo N315 è stato utilizzato come ricevente. Il protocollo utilizzato per la trasmissione interspecie produce risultati simili utilizzando lo stesso vettore coniugativo in diversi donatori coniugativi.

Questo è il primo articolo in cui vengono descritti i dettagli della trasformazione naturale. La metodologia fornita sarebbe utile al ricercatore per studiare la trasmissione e la diffusione della resistenza agli antibiotici, nonché determinante primario nel patogeno umano stafilococco aureo.