Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Questo protocollo produce complessi stabilizzati covalentemente di peptidi transmembrana per studi strutturali volti a comprendere come le proteine di membrana interagiscono tra loro attraverso i loro domini lipidici incorporati. In primo luogo, esprimere una proteina di fusione con tag hist contenente la sequenza transmembrana di interesse in e coli. Quindi estrarre la proteina dalla frazione corporea di inclusione utilizzando la ghinea e il detergente utilizzando una matrice di affinità al nichel.

Concentrare la proteina di fusione con l'hist taged e reticolare il solfuro alla forma diametrale lavando la colonna in una soluzione contenente agenti ossidanti. Successivamente, eluire la proteina di fusione reticolata nell'acido acetico Tri Fluor e trattare con bromuro di cianogeno per rilasciare il partner di fusione, procedere all'isolamento del prodotto peptidico reticolato dalla miscela digest mediante HPLC in fase inversa. In definitiva, l'identità e la purezza dei prodotti sono verificate dalla pagina SDS e dalle analisi di spettrometria di massa.