Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Questo protocollo produce complessi stabilizzati covalentemente di peptidi transmembrana per studi strutturali volti a comprendere come le proteine di membrana interagiscono tra loro attraverso i loro domini lipidici incorporati. In primo luogo, esprimere una proteina di fusione con tag hist contenente la sequenza transmembrana di interesse in e coli. Quindi estrarre la proteina dalla frazione corporea di inclusione utilizzando la ghinea e il detergente utilizzando una matrice di affinità al nichel.

Concentrare la proteina di fusione con l'hist taged e reticolare il solfuro alla forma diametrale lavando la colonna in una soluzione contenente agenti ossidanti. Successivamente, eluire la proteina di fusione reticolata nell'acido acetico Tri Fluor e trattare con bromuro di cianogeno per rilasciare il partner di fusione, procedere all'isolamento del prodotto peptidico reticolato dalla miscela digest mediante HPLC in fase inversa. In definitiva, l'identità e la purezza dei prodotti sono verificate dalla pagina SDS e dalle analisi di spettrometria di massa.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che i complessi sociometrici puri vengono prodotti per studi strutturali utilizzando tecniche come la risonanza magnetica nucleare in soluzione o allo stato solido. Anche quando è noto che due domini transmembrana interagiscono, la solubilità dei peptidi e la formazione di complessi sono spesso in contrasto in condizioni sperimentali. Iniziare con un complesso stabilizzato covalentemente ben definito può ampliare significativamente la gamma di condizioni sperimentali che possono essere testate per la raccolta di dati di alta qualità.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a gestire questi frammenti proteici estremamente idrofobici. Questo protocollo e i consigli forniti nel manoscritto di accompagnamento sono progettati per fornire alcune semplici soluzioni ad alcune delle sfide più comuni nel processo di previsione e purificazione. Palato, una coltura di un litro di batteri che esprimono la fusione del peptide della trippa e la risospensione in 50 millilitri di tampone di lisi.

Quindi eseguire tre cicli di sonicazione alla massima potenza per un minuto e raffreddare su ghiaccio per cinque minuti. Raccogliere il materiale corporeo insolubile mediante centrifugazione a 20.000 g per 15 minuti, decantare e mettere da parte il surnatante. Le fasi di sonicazione e centrifugazione possono essere ripetute se è richiesta una maggiore purezza della frazione IB.

Riserva campioni del pellet e del materiale surnatante per l'analisi della pagina SDS per confermare il viaggio. La localizzazione della fusione TM nei corpi di inclusione ora dissolve i pellet del corpo di inclusione in una soluzione di guina utilizzando tra 25 e 50 millilitri per litro di coltura. Lavorato mescolare delicatamente a temperatura ambiente per diverse ore con sole occasionale.

Quindi, eliminare il lisato di corpi inclusi mediante centrifugazione a 75.000-100.000 volte G per un'ora. A temperatura ambiente, filtrare il supernat attraverso una membrana da 0,2 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Combinare il lisato di corpi di inclusione chiarificato con la resina di affinità al nichel che è stata bilanciata in una soluzione di guine per il legame in batch.

Mescolare delicatamente la sospensione per una notte a temperatura ambiente. Caricare la sospensione di resina di nichel lisato del corpo di inclusione in una colonna di flusso a gravità vuota con supporto a letto poroso fino a quando l'intero volume non scorre attraverso. Raccogliere e mettere da parte il flusso attraverso il quale può ancora contenere proteine di fusione non legate.

Quindi lavare la resina di nichel per gravità. Flusso con cinque volumi di letto di soluzione di urea contenente mercaptoetanolo a fascio millimolare di cinque millimolari. Eseguire un secondo lavaggio senza fascio di mercaptoetanolo per il terzo lavaggio.

Utilizzare una soluzione di urea integrata con solfato di rame e glutatione ossidato. Quindi chiudere l'uscita della colonna e incubare 30 minuti a temperatura ambiente per consentire la massima formazione di legami solfuro. Lavare la soluzione ossidante di urea con 10 volumi di letto d'acqua.

Quindi applicare una linea di aspirazione per asciugare il letto della colonna e chiudere l'uscita della colonna. Ora in una cappa di sicurezza chimica, aggiungere 1,5 volumi di letto di TFA pulito, mescolare la resina di nichel con una piccola spatola per garantire un'esposizione uniforme all'acido e incubare per cinque minuti. Raccogliere l'eluato acido, pressurizzando delicatamente con una linea d'aria compressa, se necessario, per espellere tutto il liquido.

Ripetere la fase di diluizione acida con altri 1,5 volumi di letto di TFA pulito Per misurare la resa proteica, diluire il TFA EIT in tri fluoroetanolo e misurare l'assorbanza a 280 nanometri contro A-T-F-A-T-E. Diluire l'acido elu all'80% della concentrazione finale di TFA goccia per goccia. Aggiunta di acqua mescolando delicatamente.

Se precipiti le forme, aggiungi di nuovo una piccola quantità di TFA fino a quando la soluzione non si chiarisce. Quindi correggere all'80% con acqua. Riservare un campione di predigesti da cinque microlitri per l'analisi della pagina SDS e congelarlo immediatamente in azoto liquido.

Quindi, pesare i cristalli di bromuro di cianogeno per circa 0,2 grammi per millilitro di campione. Facendo attenzione a pesare la sostanza chimica tossica in modo sicuro. Aggiungere il bromuro di cianogeno al campione in una cappa di sicurezza e mescolare delicatamente fino a completa dissoluzione.

Ora lavare il recipiente di reazione all'interno del sigillo di gas inerte e incubare per tre o quattro ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Riservare un campione post-digest da cinque microlitri per l'analisi della pagina SDS, congelarlo immediatamente in azoto liquido e liofilizzarlo insieme al campione predigestato. Quindi trasferire la reazione digestiva in una cassetta per dialisi in cellulosa rigenerata, consentendo un aumento significativo del volume.

Dializzare il campione durante la notte con quattro litri di acqua nel cappuccio chimico. La mattina successiva, rimuovere la soluzione di reazione dializzata con precipitato proteico sospeso dalla cassetta per dialisi e trasferire la sospensione in una provetta conica da 50 millilitri. Quindi congelare e liofilizzare il campione per diversi giorni per rimuovere l'acqua e qualsiasi traccia di cianogeno, bromuro e TFA dissolvono fino a 100 milligrammi di prodotti digestivi liofilizzati in tre millilitri di acido formico pulito mescolando fino a quando la soluzione non si limpida completamente.

Caricare il campione su una colonna bilancia preparativa zoax SB 300 C3 in un flusso di solvente A utilizzando un anello di campionamento da cinque millilitri. Quindi eluire i prodotti digestivi in un gradiente di solvente B, su almeno cinque volumi di colonna. Analizzare le frazioni HPLC mediante SDS page e spettrometria di massa MALDI TOF per identificare la specie di interesse e confermare la sua liofilizzazione di massa prevista.

Le frazioni HPLC contenenti il prodotto peptidico reticolato. Se il prodotto si asciuga in una pellicola piuttosto che in polvere, può essere nuovamente sciolto in un piccolo volume di HFIP congelato in liquido e liofilizzato. Ancora una volta, il risultato sarà un soffice cono bianco che può essere facilmente rovesciato e pesato Una sequenza di DNA che codifica per le regioni transmembrana e di segnalazione della molecola di segnalazione transmembrana del recettore immunitario.

DAP 12 è stato clonato nel vettore peptidico PMM utilizzando i siti di restrizione Hindi tre e BAM H uno. Il costrutto di espressione batterica risultante produce una proteina di fusione di viaggio marcata con residui interni unici di metionina e cistina per la scissione del bromuro di cianogeno e la reticolazione ossidativa. Il livello di espressione raggiunto per le fusioni di trippa varia a seconda della sequenza amminoacidica del peptide attaccato.

Questa preparazione ha prodotto circa 120 milligrammi di proteina di fusione pura intatta da un litro di coltura e quattro millilitri di matrice di nichel. Dopo la lisi cellulare, la proteina di fusione è stata localizzata nel pellet corporeo di inclusione. Circa il 70% della trippa purificata con nichel DAP 12 TM di fusione era disolfuro reticolato alla forma DME.

Sebbene i prodotti peptidici DAP 12 TM non siano facilmente identificabili nei campioni totali di digerito di bromuro di cianogeno, il confronto delle bande di fusione intatte e dei frammenti di viaggio nel campione di digestato ridotto indica che la digestione della fusione è stata completa di circa il 60% in questa tipica separazione dei prodotti digestativi. Su una colonna C3 su scala preparativa utilizzando HPLC in fase inversa, i prodotti legati alludono in un gradiente a due stadi del solvente B. Il prodotto peptidico reticolato diss solfuro è identificabile nell'analisi della pagina SDS delle principali frazioni HPLC in condizioni non riducenti e riducenti. L'analisi della spettrometria di massa Maldi Tof conferma l'identità del peptide deme nel picco quattro con il prodotto principale a 6729,2 Dalton.

Non dimenticare che lavorare con solventi organici a bromuro di cianogeno e acidi concentrati può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di queste procedure è necessario indossare indumenti protettivi adeguati e il bromuro di cianogeno non deve mai essere maneggiato al di fuori della cappa di sicurezza chimica approvata. Questa tecnica ha fornito il materiale di studio chiave per tre diverse strutture di soluzioni n mr di complessi peptidici transmembrana, dimostrando come i recettori immunitari multi-subunità si assemblano attraverso interazioni proteiche all'interno della membrana linfocitaria.

Riteniamo che l'applicazione di questa tecnica si rivelerà altrettanto preziosa per altri sistemi proteici di membrana.