Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti Drosophila Brains

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere una semplice procedura di dissezione in un'unica fase per cervelli adulti di Drosophila, in grado di produrre rapidamente cervelli con morfologia ben conservata adatti per l'analisi dell'intera montatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo delle neuroscienze e della genetica. Ciò include la mappatura fine dei circuiti cerebrali, lo studio degli effetti delle manipolazioni genetiche dei neuroni e la caratterizzazione funzionale dei geni.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che comporta una procedura facile da imparare. Può facilitare la dissezione di un cervello di mosca adulta con morfologia ben conservata in meno di 10 secondi. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, poiché il controllo dello slancio richiesto quando si rilascia la pinza per strappare via l'esoscheletro che circonda la testa della mosca richiede abilità e pratica.

Questi minuscoli e fastidiosi moscerini della frutta ci hanno insegnato molto sui principi biologici. Possono anche aiutarci a trovare le cause e le cure per le malattie umane, come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. Utilizzando un microscopio da dissezione impostato su un ingrandimento di 1,2X, immobilizzare una mosca anestetizzata e immergerla in una soluzione di dissezione fredda con l'addome rivolto verso l'alto.

Tenere la pinza a un angolo compreso tra 160 e 170 gradi rispetto alla placca di dissezione, quindi esercitare una piccola forza sull'addome della mosca. Questo dovrebbe immobilizzare la mosca, forzare la testa all'indietro da 15 a 25 gradi ed estendere la proboscide verso l'alto. Dopo questa manovra, dovrebbe diventare evidente una regione morbida e traslucida della cuticola sotto la proboscide.

Aumentare l'ingrandimento e regolare il piano focale su questa regione. Usando la mano dominante, prendi un paio di pinze da dissezione ed esercita pressione per chiudere le punte. Posizionare la pinza perpendicolarmente alla pinza che trattiene la mosca.

Forare le punte chiuse della pinza attraverso la regione morbida e traslucida della cuticola, facendo attenzione a non penetrare così in profondità da toccare il cervello. Quindi rapidamente, ma costantemente, rilascia la pinza, in modo che le punte si aprano, strappando via l'esoscheletro della testa della mosca. Usa lo slancio del rilascio delle punte delle pinze per rimuovere delicatamente l'esoscheletro e la maggior parte dell'occhio e della trachea associati alla custodia della testa dal tessuto cerebrale in un solo movimento.

Un cervello intatto dovrebbe ora essere visibile. Usando la pinza, rimuovere con cura i tessuti accessori rimanenti, come il tessuto tracheale fibroso bianco, facendo attenzione a non tirare o danneggiare il cervello vero e proprio. Posizionare i campioni di cervello sezionati con i torsi associati in circa un millilitro di paraformaldeide al 4% su ghiaccio per 40-60 minuti.

Rimuovere la paraformaldeide, quindi sciacquare i campioni con un millilitro di un X PBS pipettando la soluzione su e giù tre volte, facendo attenzione a non aspirare il cervello. Quindi, rimuovere il PBS e poi lavare cinque volte con un millilitro di un X PBT per cinque minuti ciascuno con nutazione. Aggiungere l'anticorpo primario di interesse alla diluizione appropriata.

E poi incubare i campioni per una notte a quattro gradi Celsius con nutazione. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare i campioni cinque volte con un millilitro di un X PBT per cinque-10 minuti ogni lavaggio con nutazione. Aggiungere l'anticorpo secondario ai campioni lavati al momento della diluizione e dell'incubazione appropriate.

Successivamente, lavare i campioni sei volte in un millilitro di un X PBT per 10 minuti ciascuno con nutazione. Questo passaggio è fondamentale per rimuovere eventuali anticorpi secondari non legati in modo specifico. Incubare i campioni in una diluizione da uno a 10.000 di un milligrammo per millilitro di DAPI in un millilitro di una soluzione di X PBT per 30-60 minuti con nutazione.

Infine, sciacquare i campioni aggiungendo un millilitro di un X PBS e quindi pipettare la soluzione su e giù tre volte. Posizionare un vetrino coprioggetti su una slitta di montaggio. Utilizzando una pipetta con punta tagliata, trasferire il cervello in una soluzione X PBS sul vetrino coprioggetti.

Successivamente, usando il forcipe, separa il cervello dai corpi. Utilizzare una punta di pipetta sottile per rimuovere il liquido intorno al tessuto cerebrale. Quindi, aggiungi da 20 a 40 microlitri di mezzo di montaggio anti-sbiadimento.

Allargare delicatamente il cervello, spostando il mezzo viscoso verso l'esterno. Iniziando da un lato, abbassare delicatamente un secondo vetrino coprioggetti sui campioni, facendo attenzione a ridurre al minimo il contatto cerebrale con le bolle. Lasciare che i vetrini si depositino, quindi rimuovere il liquido in eccesso dal bordo dei vetrini utilizzando un panno da laboratorio.

Utilizzare un piccolo pezzo di nastro adesivo per fissare temporaneamente la coppia di vetrini coprioggetti alla slitta di montaggio. Per l'imaging dei campioni, utilizzare un microscopio a fluorescenza composto o confocale. Queste immagini mostrano viste anteriori e posteriori della stessa Drosophila adulta.

I nuclei cellulari sono stati visualizzati mediante colorazione DAPI e i neuroni sono stati marcati utilizzando un marcatore panneuronale e anticorpi anti-ELAV. I neuroni dopaminergici, o DA, sono stati rivelati dalla colorazione anticorpale anti-TH. Livelli simili di intensità sono stati osservati tra i due lati del cervello per tutti i canali di immagine.

Le viste ingrandite della parte anteriore e posteriore del cervello consentono un esame dettagliato dei cluster neuronali DA. Il cluster mediale anteriore accoppiato può essere visto nelle immagini anteriori e i cluster mediali posteriori accoppiati e laterali posteriori accoppiati nella parte posteriore del cervello. La quantificazione di questi neuroni ha rivelato che i moscerini maschi di tre giorni hanno tipicamente 27 neuroni DA nel cluster PPM in tutto il cervello, 16 nel cluster PPL per emisfero e cinque nel cluster PAL per emisfero.

Una media di 97 neuroni DA è stata osservata in ciascuno dei clusters. 3D PAM La ricostruzione dei cluster PAL e PAM ha anche mostrato che i neuroni DA nel cluster PAM hanno dimensioni relativamente piccole e una colorazione TH più debole rispetto a quelli degli altri cluster, come il PAL. Sempre più studi si stanno concentrando sul cervello di mosca adulta per sezionare i percorsi molecolari e i circuiti neuronali alla base delle funzioni cerebrali superiori e per modellare le malattie del cervello umano.

In tali studi basati sul cervello sarà necessario preparare in modo efficiente campioni di cervello con morfologia ben conservata. Ciò potrebbe essere particolarmente importante negli schermi basati sul cervello su larga scala. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando lottavo per tenere le mosche nel forcipe.

Invece delle pinze con punte affilate che la maggior parte dei ricercatori di Drosophila usa, Shebna ha provato le pinze con estremità smussate e ha scoperto che era più facile sezionare il cervello. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 10 secondi se eseguita correttamente. Una volta, ho sezionato circa 100 cervelli di sei diversi genotipi per un esperimento in un solo giorno.

Sebbene questa procedura di dissezione possa sembrare semplice, è importante praticarla prima con mosche dispensabili. L'investigatore può anche avere difficoltà a posizionare il forcipe senza distruggere il cervello della mosca. I cervelli sezionati possono essere utilizzati per altri studi, come l'RNA, l'ibridazione in situ e l'estrazione di campioni di proteine e RNA dal tessuto cerebrale.

Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di sezionare cervelli di mosca con una morfologia ben conservata. Prevediamo che possano essere sviluppati miglioramenti per rendere questa procedura più semplice e veloce. Questo può potenzialmente essere automatizzato in futuro per studi su larga scala.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide e le pinze da dissezione affilate può essere pericoloso. Prendere precauzioni, come indossare guanti, quando si maneggiano soluzioni fissative e, una volta completata la dissezione, tappare immediatamente le pinze prima di metterle da parte.