Applicazione di MultiColor FlpOut tecnica per studiare ad alta risoluzione singola cella morfologie e interazioni delle cellule della Glia in Drosophila

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di visualizzare le morfologie di singole cellule in tessuti anatomici complessi, semplificando così lo studio dell'interazione cellula-cellula in Drosophila. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti morfologie complesse e interazioni cellulari con il moscerino della frutta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere adattata allo studio delle morfologie delle singole cellule in qualsiasi tessuto e in qualsiasi fase dello sviluppo.

A dimostrare la procedura sarà Anja Kieser, un tecnico del nostro laboratorio. La tecnica MCFO modifica la tecnica FlpOut standard come segue. Una FLP da shock termico ricombinasi e diversi reporter rimangono sotto il controllo UAS, tuttavia, ogni reporter ha una spina dorsale comune di una supercartella miristoilata GFP, in cui sono state inserite copie di un tag epitopo.

Le proteine non fluorescenti risultanti sono denominate GFP spaghetti monster e sono identificate con anticorpi. A seconda del numero di escissioni, viene espressa una diversa combinazione di epitopi. Poiché il promotore HSP è leggermente attivo a 25 gradi Celsius, posiziona le croci a 18 gradi Celsius dove è veramente inattivo.

Quindi, attendi circa 20 giorni per ottenere la generazione F1. Ordina le femmine e i maschi F1 in fiale separate. Per riscaldarli, trasferiscili prima in fiale di cibo fresco quando hanno tre o quattro giorni.

Le mosche più giovani possono essere troppo delicate per lo shock termico. Quindi, trasferire le fiale in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Immergerli in profondità per garantire uno shock termico omogeneo.

Per una marcatura sparsa delle cellule gliali, iniziare con cinque-otto minuti di shock termico e poi ottimizzare. Il tempo ottimale di shock termico etichetterà scarsamente le celle target e la sua relazione dipende dallo specifico driver GAL4 in uso. Dopo lo shock termico, adagiare le fiale orizzontalmente sul banco per qualche minuto per raffreddarle.

Ora, inizia a mantenere le mosche a 25 gradi Celsius nelle stesse fiale. Dopo due giorni, l'espressione del reporter sarà ottimale e le mosche potranno essere sezionate. In preparazione, metti tre pozzetti di depressione profonda sul ghiaccio.

Riempire un pozzetto con etanolo al 70%, uno con PBS e uno con terreno di coltura cellulare S2. Quindi, caricare un piatto da dissezione di tre centimetri rivestito di silicone nero con S2 freddo. Condurre l'intera dissezione in S2 per mantenere sani i tessuti. Ora, anestetizza le mosche con anidride carbonica.

Quindi, usando una pinza o una piuma, metti le mosche in etanolo freddo al 70% per circa 30 secondi seguito da PBS freddo per circa 30 secondi e poi trasferiscile in S2 freddo. Quindi, lavare tutte le mosche da sezionare. Di solito sono sufficienti fino a 10 mosche di un genotipo. Ora, entro 30 minuti, seziona tutti i cervelli.

Per prima cosa, stacca la testa dal resto del corpo e getta via il corpo. Tenere la testa tenuta con la mano secondaria per tutta la durata della dissezione, altrimenti sarà molto difficile riprenderla. Quindi, estrai un occhio afferrando il tessuto appena sotto la retina.

Quindi staccare l'altro occhio ed esporre così il cervello e i tessuti circostanti. Quindi, rimuovere tutto il tessuto tracheale e la cuticola rimanente intorno al cervello, fino a quando il tessuto cerebrale non appare pulito. Tutto il tessuto tracheale deve essere rimosso per ottenere risultati di colorazione ottimali.

Questo è tutto ciò che serve per preparare il cervello alla fissazione. Procedere con la dissezione di tutti i cervelli, mantenendo i cervelli sezionati in S2 freddo. Cerca di preparare fino a 10 cervelli per provetta da microcentrifuga per una colorazione ottimale. Trasferire i cervelli isolati utilizzando un puntale per pipetta P10 in una provetta da microcentrifuga da 200 microlitri con soluzione fissativa.

Non maneggiare mai il cervello usando il forcipe. Incubare i tessuti al riparo dalla luce. Evitare di aspirare il cervello durante i trasferimenti della soluzione.

Per rimuovere il fissativo, utilizzare tre o più lavaggi di 15 minuti con soluzione di lavaggio. Quindi bloccare i tessuti con una soluzione bloccante per 30 minuti o più. Successivamente, sostituire la soluzione bloccante con anticorpi primari diluiti in soluzione di lavaggio e incubare il cervello durante la notte a quattro gradi Celsius.

Per rimuovere gli anticorpi primari, utilizzare tre lavaggi di un'ora in soluzione di lavaggio. Successivamente, aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori secondari in una soluzione di lavaggio e incubare il cervello durante la notte a quattro gradi Celsius o per quattro ore a temperatura ambiente. Per eliminare completamente gli anticorpi non legati, utilizzare tre lavaggi di un'ora in soluzione di lavaggio seguiti da un lavaggio più lungo con PBS.

Quindi monta il cervello. Prepara due vetrini coprioggetto con un distanziatore immaginativo. Nel distanziatore e sul vetrino coprioggetti extra, applicare 10 microlitri di mezzo di montaggio con un agente anti-sbiadimento.

Successivamente, utilizzando una pipetta P10, trasferire i cervelli sul vetrino coprioggetto, depositandoli accanto al terreno insieme a un po' di PBS. Non lasciare che il fazzoletto si asciughi. Ora, sposta con cautela i cervelli nel mezzo di montaggio usando la pipetta e infine spostali nel mezzo nel distanziatore e disponili con una pinza.

Quindi, rimuovere il rivestimento adesivo sui distanziatori e applicare un vetrino coprioggetto. Fissare il vetrino coprioggetti esercitando una leggera pressione utilizzando una pinza e procedere immediatamente con l'imaging o conservare i vetrini a meno 20 gradi Celsius per un'analisi successiva. Utilizzando i metodi descritti, tre diversi reporter marcati con membrana sono mantenuti silenti da terminatori trascrizionali affiancati da siti FRT.

Quando gli animali sono stati sottoposti a shock termico, la FLP ricombinasi è stata espressa e ha rimosso casualmente i terminatori, portando all'espressione di diverse combinazioni di reporter. Nel complesso, le diverse combinazioni di reporter forniscono sette colori diversi, quindi è possibile visualizzare e studiare individualmente più morfologie di singole cellule. Con EG-GAL4 e ALG-GAL4 sono stati testati vari tempi di shock termico.

La marcatura di singole cellule è stata analizzata nella regione del lobo antennale del cervello. Il driver EG-GAL4 si esprime nell'inguainare le cellule gliali che si inguainano tutte sulla superficie del lobo antennale. In confronto, la glia astrocitaria bersaglio da ALG-GAL4 copriva per lo più aree non sovrapposte del lobo antennale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare le singole cellule in soluzione. Al fine di comprendere le loro complesse relazioni anatomiche utilizzando Drosophila e in linea di principio e in organismi modello in cui il sistema binario GAL4 UIS può essere applicato. Quando si tenta questa procedura per la prima volta, è importante ricordare innanzitutto di ottimizzare il tempo di shock termico e di seguire il più possibile i singoli passaggi del protocollo di colorazione per ottenere i migliori risultati.