Name: Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri come misurare la durata della vita e i fenotipi cellulari in singole cellule di lievito utilizzando dispositivi microfluidici. Questo metodo consente di tracciare le cellule madre e i marcatori molecolari correlati all'invecchiamento.

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Questa ricerca è stata supportata da NIH Grant AG043080 e dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC), n. 11434001. Ringraziamo Lucas Waldburger per la correzione delle bozze del manoscritto.

1. Silicon Wafer Mold Fabrication NOTA: La fotomaschera è stato progettato con il software AutoCAD e prodotto da una società commerciale. Questo disegno contiene tre strati di diversi modelli ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">File supplementare 1</a> ). Le altezze di primo, secondo, e terzo strato sono circa 4 pm, 10 pm e 50 um, rispettivamente. Lo stampo wafer di silicio è stata creata dalla fotomaschera mediante litografia soft 9, 10. <ol><li> Cuocere un wafer di silicio a 200 ° C per 10 minuti per evaporare il vapore acqueo. cappotto centrifuga fotoresist negativo SU-8 sul wafer di silicio. NOTA: coat Spin SU-8 3005 a 5.000 giri al minuto per 30 s per generare il primo strato, SU-8 2010 a 3.000 rpm per 30 s per generare il secondo strato, e SU-8 3025 a 2.000 giri al minuto per 30 s per generare il terzo strato. </li><li> Soft-cuocere il wafer rivestito prima di tegli trasferimento modello. Allineare e esporre il wafer in modalità &quot;contatto diretto&quot; utilizzando un allineatore maschera. NOTA: Soft-cuocere il wafer per 2 min a 95 ° C per il primo strato, 3 min a 95 ° C per il secondo strato, e 15 min a 95 ° C per il terzo strato. Utilizzare la dose di esposizione a 100 mJ / cm 2 per il primo strato, 130 mJ / cm 2 per il secondo strato, e 200 mJ / cm 2 per il terzo strato. </li><li> Dopo l&#39;esposizione, post-cuocere il wafer e sviluppare utilizzando SU-8 sviluppatore. Essiccare il wafer utilizza una pistola N 2 e duro-cuocere il wafer a 200 ° C per 30 min. NOTA: Lo stampo wafer di silicio è fissata a 15 cm di diametro plastica Petri piatto con del nastro adesivo, con il lato rivolto verso l&#39;alto modello. Solitamente, abbiamo messo diverse strutture identiche di chip sullo stesso stampo che permette a più chip microfluidici per essere fabbricati contemporaneamente. Ogni stampo può essere riutilizzato molte volte per fabbricare chip microfluidici. </li></ol> 2. Microfluidicfabbricazione di chip <ol><li> Mettere una barca pesa pulita su una bilancia e tarare la bilancia. Versare 50 g di base di PDMS nella barca pesare. </li><li> Aggiungere 5 g di PDMS agente di indurimento alla barca pesare (w / w rapporto di 1:10 alla base PDMS). NOTA: Questo volume è basato su 15 cm con piastra Petri con lo stampo. Regolare la quantità di reagente se si utilizza una piastra di Petri di dimensioni diverse. </li><li> Mescolare la base PDMS e l&#39;agente di indurimento con una pipetta monouso. Iniziare dal bordo della barca di pesatura e si muovono lentamente verso l&#39;interno. Mescolare accuratamente per alcuni minuti fino formano piccole bolle nella miscela; accurata miscelazione è essenziale per PDMS polimerizzazione. </li><li> Versare il composto lentamente nella capsula di Petri; la miscela deve coprire completamente lo stampo wafer di silicio. </li><li> Porre la capsula di Petri in un vuoto per 10 minuti per rimuovere tutte le bolle d&#39;aria dalla miscela PDMS. Se le bolle rimangono sulla superficie della miscela, utilizzare una pipetta per far saltare fuori. </li><li> Incubare il siliciostampo wafer con PDMS in un forno a 75 ° C per circa 2 ore. </li><li> buccia delicatamente lo strato di PDMS polimerizzate fuori stampo wafer di silicio, evitando danni alla costruzione dello stampo wafer. In alternativa, tagliare il PDMS direttamente dallo stampo wafer di silicio con un margine minimo di 5 mm intorno al pattern usando una lama di rasoio industriale singolo bordo; buccia delicatamente lo strato PDMS dallo stampo wafer. </li><li> Posizionare il livello PDMS sul banco con il lato rivolto verso l&#39;alto modello. Asportare accuratamente il chip individuo con una lama di rasoio industriale singolo bordo, mantenendo un adeguato margine dal bordo di ogni singolo chip per evitare danni costruzione. </li><li> Con il lato rivolto verso l&#39;alto modello, utilizzare una penna punzone (ID 0,75 mm) per perforare verso il basso attraverso i cerchi ingresso e di uscita su ciascun lato dei canali. NOTA: Questi fori creano il percorso per il passaggio del fluido. Pertanto, è fondamentale passare attraverso i cerchi e punzone tutto il percorso attraverso lo strato PDMS. Assicurati cherimuovere le colonne PDMS dal foro. </li><li> Controllare ogni buco perforato inserendo di nuovo l&#39;ago penna pugno nel foro. Assicurarsi che l&#39;ago può uscire dall&#39;altra parte, che indica che non v&#39;è alcun blocco. Applicare del nastro alla superficie del modello, quindi rimuovere delicatamente il nastro per pulire le particelle di polvere. Ripetere questa operazione almeno tre volte. Lascia un pezzo pulito di nastro adesivo sui PDMS per mantenere la sterilizzazione. </li><li> Ripetere questa procedura sul lato opposto delle PDMS e lasciare l&#39;ultimo pezzo di nastro adesivo sulla pure. </li><li> Preparare un vetro di copertura 24 mm x 30 mm con uno spessore di 0.13-0.17 mm. Spruzzare etanolo al 70% sul vetro e secco con depolveratore per sterilizzare la superficie; Inoltre, il vetro può essere lavato con acqua ed essiccato in autoclave con depolveratore. </li><li> Trasferire il vetrino coprioggetto e PDMS ad una piastra di plastica. Rimuovere il nastro adesivo dal PDMS e posizionare il lato modello rivolto verso l&#39;alto. Evitare il contatto con la superficie del modello durante il trasferimento. </li><li&gt; Posizionare la piastra di plastica nella macchina plasma. Applicare un trattamento al plasma di ossigeno per il PDMS e il vetrino coprioggetto per rendere le superfici idrofile con i seguenti parametri di funzionamento: esposizione, 75 s; stabilizzazione gas, 20 cc / min; pressione, 200; e potenza, 100 W. </li><li> posizionare accuratamente il PDMS sul vetro di copertura, che collega entrambe le superfici idrofile (le superfici affrontate durante il trattamento al plasma). Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria tra il PDMS e il vetro di copertura. </li><li> Incubare il chip PDMS in un forno a 75 ° C per almeno 2 ore. NOTA: microfluidica carenti possono causare perdite di liquido sul microscopio durante l&#39;esperimento. Pertanto, è importante controllare il legame tra il PDMS e il vetro di copertura sollevando leggermente il PDMS dai bordi con pinzette. Delicatamente sollevando le PDMS non dovrebbero separarla dal vetro di copertura, che indica un legame di successo. </li></ol> 3. Preparazione per l&#39;esperimento <ol><li&gt; preparazione del tubo. <ol><li> Immergere i tubi di ingresso e uscita in soluzione di etanolo al 70% separatamente 1 giorno prima preparazione di chip PDMS. </li><li> Riempire una siringa da 5 ml con acqua in autoclave per lavare i tubi. Lavare ciascun tubo collegando il tubo sulla siringa e il lavaggio del tubo con acqua. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio, almeno 3 volte per pulire residui etanolo. </li></ol></li><li> Esaminare i canali PDMS sotto un microscopio ottico con un obiettivo 10X per assicurarsi che la struttura è coerente e intatto. Stabilizzare il chip PDMS sulla piattaforma microscopio utilizzando nastro adesivo. NOTA: Fare chip multipli in una sola volta in fase 2 per garantire che non ci sono chip di backup, soprattutto se rendendo il dispositivo per la prima volta. </li><li> Riempire una siringa da 5 ml con acqua in autoclave. Fissare la siringa ad una pompa a siringa e inserire i tubi di ingresso e uscita corrispondenti. Impostare la velocità di lavaggio a 750 microlitri / h per risciacquare il chip per circa 10 min. Le bolle d&#39;aria sui canali ramodevono essere lavati via durante questo periodo; se vi sono bolle rimanenti, regolare manualmente la velocità per eliminare le bolle. </li><li> Lievito preparazione del campione. <ol><li> Trasferire 1 ml di campione preparato lievito (OD 600 0,6-0,8) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare per 5 min a 3000 x g. </li><li> Rimuovere la maggioranza del surnatante da ogni provetta e combinare il resto per formare un campione da 0,5 mL. </li></ol></li><li> Sospendere la pompa a siringa e rimuovere i tubi di ingresso dal chip PDMS. </li><li> invertire manualmente la pompa a siringa per aspirare una piccola bolla d&#39;aria (1 a 2 cm di lunghezza) in ogni provetta di ingresso. Passare a succhiare nel campione di lievito; la bolla d&#39;aria mostrerà il confine campione e indicare la quantità di campione è stato elaborato. NOTA: Evitare di succhiare il campione nella siringa. </li><li> Inserire il tubo di ingresso posteriore nel chip PDMS e riavviare la pompa per caricare le cellule ad una velocità di 750 ml / h. </li><li> Lasciare la siringa pompa per 10 min lan ed esamina la progressione carico cella sotto il microscopio; un carico di successo sarà cellule intrappolare inferiore più del 60% di sospendere pilastro. </li><li> Passare alla soluzione di alimentazione e regolare la velocità a 400 microlitri / h per la coltura delle cellule. </li><li> posizioni di osservazione Select per il microscopio. NOTA: Per le misure di durata della vita, le immagini sono state scattate una volta ogni 15 minuti da un microscopio ottico con un obiettivo 40x. Per l&#39;analisi reporter fluorescente, immagini sono state prese una volta ogni 15 minuti con un microscopio a fluorescenza con un obiettivo olio 60X. </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
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<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il dispositivo PDMS deve essere preparata. Altrimenti, le bolle d&#39;aria causate inserendo tubi nel dispositivo saranno difficili da rimuovere. Fase 3.4 è importante per migliorare l&#39;efficienza di carico delle cellule concentrando le cellule. Per aumentare la velocità dell&#39;esperimento, da 4 a 6 moduli sullo stesso chip PDMS collegati a pompe indipendentemente operativi sono tipicamente utilizzati per eseguire 4 a 6 diversi esperimenti (ceppi diversi o composizioni media) simultaneamente. <p class="jove_con...

Erba lievito è un potente organismo modello nella ricerca sull&#39;invecchiamento. Tuttavia, un test di durata della vita convenzionale nel lievito si basa su microdissezione, che non è solo lavoro intensivo, ma anche a basso throughput di 1, 2. Inoltre, l&#39;approccio tradizionale microdissezione non fornisce una vista dettagliata di varie caratteristiche cellulari e molecolari nelle cellule madri singole che invecchiano. Lo sviluppo di dispositivi microfluidici ha permesso una procedura automatizzata per misurare durata lievito nonché a seguire marcatori molecolari e diversi fenotipi cellulari per tutta la durata delle cellule madri 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dopo che le cellule di lievito vengono caricati in un dispositivo microfluidico, possono essere monitorati sotto un microscopio utilizzando temporali giri automaticie di imaging. Con l&#39;aiuto di strumenti di elaborazione di imaging, diversi fenotipi cellulari e molecolari possono essere estratti 3, 6, 8, compresa durata, dimensioni, reporter fluorescente, morfologia cellulare, le dinamiche del ciclo cellulare, ecc, molti dei quali sono difficili o impossibili da ottenere utilizzando il metodo microdissezione tradizionale. Dispositivi microfluidici hanno assunto un rilievo nella ricerca affinamento sui lieviti in quanto il loro sviluppo di successo di qualche anno fa 3, 4, 6, 7. Diversi gruppi hanno pubblicato successivamente sulle variazioni dei disegni precedenti 5, e molti laboratori di lievito hanno impiegato dispositivi microfluidici per il loro studio. In una cultura di cellule in fase di crescita esponenziale, il numero di cellule madri di età compresa tra che sono disponibili per l&#39;osservazione è miniscule. Pertanto, il principio di progettazione generale del dispositivo microfluidica per le misure di durata della vita è quello di mantenere le cellule madre e per rimuovere le cellule figlie. Uno di questi disegni si avvale del fatto che il lievito subisce divisione cellulare asimmetrica. Le strutture a cellule madri trappola dispositivo volontà grandi e permettono cellule figlie piccole per essere lavato via. Il chip microfluidico descritto in questo articolo utilizza un tampone morbido polidimetilsilossano (PDMS) (colonne pensili verticali) per intrappolare cellule madri (Figura 1). Dispositivi di tipo analogo sono stati riportati precedentemente 3, 4, 6, 7. Questo protocollo utilizza una procedura semplice da fabbricare dispositivi microfluidici e un metodo cella di carico semplice che è ottimizzato per gli esperimenti time-lapse imaging. Uno dei parametri chiave del dispositivo microfluidico è la larghezza delle pastiglie PDMS utilizzati per cellule madri trappola. Il nostro device usa pastiglie più ampi che possono tenere più cellule madri sotto ogni pad, tra cui una frazione significativa di cellule madri fresche che possono essere monitorati per tutta la loro durata di vita. Oltre alle misurazioni durata della vita, questo protocollo è utile per esperimenti di imaging singola cellula time lapse quando le cellule devono essere monitorati per molte generazioni o quando un&#39;osservazione tutta la durata della vita è necessaria.

<table><tbody><tr><td>3'' < Wafer di silicio 111></td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Serie 2000 e 3000</td> Kit di elastomeri siliconici <td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard® 184</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Include la base di elastomero siliconico Sylgard® e l'agente indurente piastre</td></tr><tr><td>Petri</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; punch (D.I. 0,75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm Vetro di copertura SLIP-RITE®</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch</td><td>Tape ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Lamette da barba</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>etanolo puro, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>Siringa BD da 5 ml (Luer-Lock&trade; Suggerimento)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Tubi a parete standard in PTFE (100 piedi, dimensioni AWG: 22, ID nominale: 0,028)</td><td>Azienda di fornitura di componenti</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Assortimento di aghi Azienda</td><td>di fornitura di componenti</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Forno da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon TE2000 con obiettivo 40X e 60X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 con obiettivo 40X e 60X</td> Pompa a <td>siringa Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un importante organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento. Gli studi genetici hanno rivelato molti geni con effetti conservati sulla durata della vita in tutte le specie. Tuttavia, le cause molecolari dell'invecchiamento e della morte rimangono sfuggenti. Per ottenere una comprensione sistematica dei meccanismi molecolari alla base dell'invecchiamento del lievito, abbiamo bisogno di metodi ad alto rendimento per misurare la durata della vita e quantificare vari fenotipi cellulari e molecolari in singole cellule. In precedenza, abbiamo sviluppato dispositivi microfluidici per tracciare le cellule madri di lievito in erba per tutta la loro durata di vita, eliminando le cellule figlie appena nate. Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di chip microfluidici e per l'impostazione di esperimenti microfluidici. È possibile utilizzare più canali per tracciare contemporaneamente le cellule in condizioni diverse o da diversi ceppi di lievito. Una configurazione tipica può tracciare centinaia di cellule per canale e consentire l'imaging al microscopio ad alta risoluzione per tutta la durata della vita delle cellule. Il nostro metodo consente anche una caratterizzazione dettagliata della durata della vita, dei marcatori molecolari, della morfologia cellulare e della dinamica del ciclo cellulare delle singole cellule. Inoltre, il nostro dispositivo microfluidico è in grado di intrappolare una quantità significativa di cellule madri fresche che possono essere identificate mediante analisi delle immagini a valle, rendendo possibile misurare la durata della vita con maggiore precisione.

Dopo gli esperimenti, le durate di vita di cellule e molti fenotipi cellulari e molecolari possono essere estratti dalle immagini time-lapse registrate. Poiché ci sono un certo numero di diverse caratteristiche che possono essere estratti da ciascuna cella, il primo passo dell&#39;analisi è di annotare le cellule ed eventi, tra le posizioni ei confini delle celle e la tempistica dei vari eventi che vengono monitorati, quali come gli eventi in erba. Queste annotazioni che renderà più faci...

Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per la produzione di chip microfluidici e la configurazione degli esperimenti microfluidici per misurare la durata di vita e fenotipi cellulari delle singole cellule di lievito.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è realizzare un dispositivo microfluidico specializzato e utilizzarlo per misurare la durata di vita e i fenotipi cellulari di una singola cellula di lievito. Questo metodo può contribuire a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo dell'invecchiamento dei lieviti, come ad esempio perché le cellule madri invecchiano e muoiono, e quali sono i primi eventi molecolari che portano alla perdita dell'omeostasi cellulare e, infine, all'invecchiamento e alla morte cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo seguire le cellule madri, monitorarne la durata di vita e contemporaneamente osservare diversi marcatori molecolari, consentendoci di individuare eventi molecolari correlati alla durata della vita.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invecchiamento del lievito, può essere applicato anche ad altre aree, come il monitoraggio delle risposte secondarie alla partecipazione che richiede il controllo cellulare per molte generazioni. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la fabbricazione del dispositivo microfluidico, il caricamento delle cellule e l'allestimento del microscopio richiedono molta pratica per essere eseguiti con successo. Una dimostrazione preliminare di questo metodo è fondamentale, poiché risulta difficile caricare correttamente il dispositivo microfluidico con il lievito.Per iniziare, fabbricare un mold in wafer di silicio per il dispositivo utilizzando tecniche standard come descritto nel protocollo di testo allegato. Posizionarlo con la superficie strutturata rivolta verso l'alto in una piastra di Petri da 15 centimetri. Fissare il mold sulla piastra di Petri con del nastro adesivo.Posizionare successivamente un contenitore per pesatura pulito su una bilancia e tarare la bilancia. Versare 50 grammi di base PDMS nel contenitore per pesatura e quindi aggiungere cinque grammi di agente indurente PDMS. Mescolare la base PDMS e l'agente indurente con una pipetta monouso.Partire dal bordo della barchetta di pesatura e muoversi lentamente verso l'interno. Mescolare accuratamente la miscela per alcuni minuti fino a quando si formano piccole bolle in tutta la miscela. Versare lentamente la miscela nella piastra di Petri, in modo che copra completamente il mold in wafer di silicio.Quindi posizionare la piastra di Petri sotto vuoto per 10 minuti per rimuovere tutte le bolle d'aria dalla miscela di PDMS. Se dopo la rimozione dal vuoto rimangono bolle sulla superficie della miscela, utilizzare una pipetta per eliminarle. Successivamente, cuocere il dispositivo a 75 gradi Celsius per due ore.Dopo aver riportato la temperatura a temperatura ambiente, tagliare con attenzione il PDMS intorno allo stampo e quindi staccare delicatamente lo strato di PDMS polimerizzato dallo stampo in wafer di silicio, evitando qualsiasi danneggiamento della struttura dello stampo. Posizionare lo strato di PDMS sul banco con la superficie strutturata rivolta verso l'alto. Tagliare con cura il singolo chip utilizzando una lama industriale monouso, lasciando un margine sufficiente rispetto al bordo di ciascun chip per evitare danni alla struttura.Con il lato del modello rivolto verso l'alto, utilizzare una perforatrice per fare dei fori direttamente nei cerchi di ingresso e di uscita su ciascun lato dei canali. Verificare ogni foro inserendo nuovamente l'ago della perforatrice nel foro. Assicurarsi che l'ago possa uscire dal lato opposto, indicando l'assenza di ostruzioni.Successivamente, utilizzare il nastro per rimuovere le particelle di polvere e i detriti dalla superficie superiore. Ripetere questo passaggio almeno tre volte e lasciare un pezzo pulito di nastro adesivo Scotch sulla PDMS per mantenere una superficie priva di polvere. Quindi capovolgere il dispositivo e ripetere questa procedura sul lato opposto della PDMS.Lasciare anche l'ultimo pezzo di nastro adesivo su questo lato. Preparare ora una superficie di vetro per la base del dispositivo. Selezionare il pezzo di vetrino coprioggetto di 24 millimetri per 30 millimetri con uno spessore compreso tra 13 e 17 millimetri.Spruzzare etanolo al 70% sul vetro e asciugare con un panno privo di polvere per sterilizzare la superficie. Successivamente, trasferire il vetrino e il PDMS su una piastra di plastica. Rimuovere il nastro adesivo dal PDMS e posizionare il lato con il motivo rivolto verso l'alto nella piastra, senza toccare la superficie superiore.Quindi trasferire la piastra in una camera a plasma. Applicare un trattamento al plasma di ossigeno al PDMS e al vetrino per rendere le superfici idrofile. Successivamente, rimuovere la piastra dalla camera a plasma e collegare con attenzione le superfici trattate al plasma del PDMS con quelle del vetrino.Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria tra il PDMS e il vetrino. Infine, trasferire il dispositivo in un forno e cuocere a 75 gradi Celsius per almeno due ore. Immergere i tubi di ingresso e di uscita in una soluzione di etanolo al 70% un giorno prima della preparazione del chip in PDMS.Il giorno successivo, riempire una siringa da cinque millilitri con acqua autoclavata e lavare ogni tubo posizionando il tubo sulla siringa e spingendo acqua attraverso il tubo. Ripetere il passaggio di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'etanolo residuo. Successivamente, esaminare i canali in PDMS al microscopio ottico.Utilizzando un obiettivo 10 X, verificare che le strutture siano coerenti e integre. Stabilizzare il chip in PDMS integro sulla piattaforma del microscopio utilizzando nastro adesivo Scotch. Fissare una siringa da cinque millilitri riempita con acqua sterile a una pompa per siringhe e inserire i tubi di ingresso e uscita corrispondenti nel dispositivo.Impostare la portata a 750 microlitri all'ora e risciacquare il chip per circa 10 minuti. Osservare i canali per assicurarsi che eventuali bolle d'aria vengano eliminate. Se dopo il risciacquo di 10 minuti rimangono ancora bolle, regolare manualmente la velocità per rimuoverle.Trasferire un millilitro di un campione di lievito preparato in due provette microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare i campioni per cinque minuti a 3.000 ×g. Rimuovere la maggior parte del soprannatante da ciascuna provetta e combinare il residuo per ottenere un campione da 5 millilitri. Una volta pronto il campione di lievito, rimuovere le provette di ingresso dal chip in PDMS. Invertire manualmente la pompa a siringa per aspirare una piccola bolla d'aria lunga da uno a due centimetri in ciascuna provetta di ingresso, quindi aspirare le colture cellulari.Quindi reinserire il tubo di ingresso nel chip in PDMS e riavviare la pompa per caricare le cellule a una velocità di 750 microlitri all'ora. Lasciare la pompa a siringa in funzione per 10 minuti, quindi esaminare l'avanzamento del caricamento cellulare al microscopio. Un caricamento corretto intrappolerà le cellule sotto più del 60% dei pilastri sospesi.Per mantenere le cellule di lievito, sostituire la soluzione nella siringa con una soluzione nutritiva e regolare la velocità a 400 microlitri all'ora. Il fenotipo di durata della vita del lievito può essere ottenuto contando il numero di gemme prodotte da ciascuna cellula madre intrappolata e stimando il relativo stimatore di Kaplan-Meier. Utilizzando questo protocollo, il dispositivo intrappola di frequente nuove cellule figlie gemmate dalle cellule già intrappolate.Queste cellule diventano quindi nuove cellule madri, che possono essere identificate mediante software di analisi dell'immagine a valle. Queste nuove cellule madri consentono una misurazione più accurata della durata della vita. In questo esperimento, la durata media della vita delle nuove cellule madri era leggermente maggiore, di circa due generazioni.Oltre al numero di gemme, dall'analisi delle immagini è possibile estrarre l'intervallo di tempo tra due eventi successivi di gemmazione. La gemmazione rallenta notevolmente verso la fine del loro ciclo vitale, indicando lo stato di salute compromesso di queste cellule anziane. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un chip appena preparato per ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria e di aumentare la concentrazione cellulare al fine di migliorare l'efficienza di caricamento delle cellule, quando necessario.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori del campo dell'invecchiamento nei lieviti per esplorare i primi cambiamenti molecolari alla base del fenotipo d'invecchiamento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare questo dispositivo microfluidico e di come utilizzarlo per misurare la durata della vita e i fenotipi cellulari in singole cellule.

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