Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di realizzare un dispositivo microfluidico specializzato e utilizzarlo per misurare la durata della vita e i fenotipi cellulari di una singola cellula di lievito. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune delle domande chiave nel campo dell'invecchiamento del lievito, come ad esempio perché le cellule madri invecchiano e muoiono e quali sono gli eventi molecolari precoci che guidano la perdita dell'omeostasi cellulare e infine l'invecchiamento e la morte cellulare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo tracciare le cellule madri, tracciare la loro durata di vita e i vari marcatori molecolari allo stesso tempo, in modo da poter cercare eventi molecolari correlati alla durata della vita.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invecchiamento del lievito, può essere applicato anche ad altre aree, come il monitoraggio delle risposte secondarie alla partecipazione che richiede il controllo cellulare per molte generazioni. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la fabbricazione di dispositivi microfluidici, il caricamento delle cellule, l'installazione del microscopio richiedono molta pratica per essere eseguiti con successo. La dimostrazione preliminare di questo metodo è fondamentale in quanto è difficile caricare correttamente il dispositivo microfluidico con lievito.

Per iniziare, fabbricare uno stampo per wafer di silicone per il dispositivo utilizzando tecniche standard come descritto nel protocollo di testo allegato. Metterlo con il lato opposto rivolto verso l'alto in una capsula di Petri da 15 centimetri. Fissare lo stampo sulla capsula di Petri con dei nastri adesivi.

Quindi posizionare una barca per pesare pulita su una bilancia e strappare la bilancia. Versare 50 grammi di base PDMS nella pesa e poi aggiungere cinque grammi di agente indurente PDMS. Mescolare la base PDMS e l'agente indurente con una pipetta monouso.

Inizia dal bordo della pesa e spostati lentamente verso l'interno. Mescolare bene il composto per alcuni minuti fino a quando non si formano piccole bolle in tutto il composto. Versare lentamente il composto nella capsula di Petri, in modo che copra completamente lo stampo per cialda di silicone.

Quindi posizionare la capsula di Petri nel vuoto per 10 minuti per rimuovere tutte le bolle d'aria dalla miscela PDMS. Se rimangono delle bolle sulla superficie della miscela una volta tolte dal vuoto, utilizzare una pipetta per soffiarle fuori. Quindi, cuocere il dispositivo a 75 gradi Celsius per due ore.

Una volta raffreddato a temperatura ambiente, tagliare con cura il PDMS attorno allo stampo e quindi staccare delicatamente lo strato di PDMS polimerizzato dallo stampo per wafer di silicone, evitando danni alla costruzione dello stampo per wafer. Posizionare il livello PDMS sul banco con il lato del modello rivolto verso l'alto. Ritagliare con cura il singolo truciolo con una lama di rasoio industriale a filo singolo, mantenendo un margine adeguato dal bordo di ogni singolo truciolo per evitare danni alla costruzione.

Con il lato del modello rivolto verso l'alto, utilizzare una penna da punzone per praticare dei fori attraverso i cerchi di ingresso e uscita su ciascun lato dei canali. Controllare ogni foro inserendo nuovamente l'ago della penna da punzone nel foro. Assicurati che l'ago possa fuoriuscire dall'altro lato, indicando che non ci sono ostruzioni.

Quindi, usa il nastro per pulire le particelle di polvere e i detriti dalla superficie superiore. Ripetere questo passaggio almeno tre volte e lasciare un pezzo di scotch pulito sul PDMS per mantenere una superficie priva di polvere. Quindi capovolgere il dispositivo e ripetere questa procedura sul sito opposto del PDMS.

Lascia anche l'ultimo pezzo di nastro adesivo su questo lato. Ora prepara una superficie di vetro per la base del dispositivo. Seleziona il pezzo di vetro di copertura da 24 millimetri per 30 millimetri con uno spessore compreso tra 13 e 17 millimetri.

Spruzzare etanolo al 70% sul vetro e asciugarlo con un depolveratore per sterilizzare la superficie. Quindi trasferire il vetro di copertura e il PDMS su una piastra di plastica. Rimuovere lo scotch dal PDMS e posizionare il lato del modello rivolto verso l'alto nella piastra, senza entrare in contatto con la superficie superiore.

Quindi trasferire la piastra in una camera al plasma. Applicare un trattamento al plasma di ossigeno al PDMS e al vetro di copertura per rendere le superfici idrofile. Quindi rimuovere la piastra dalla camera al plasma e collegare con cura le superfici trattate al plasma del PDMS nel vetro di copertura.

Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria tra il PDMS e il vetro di copertura. Infine, trasferisci il dispositivo in un forno e inforna a 75 gradi Celsius per almeno due ore. Immergere i tubi di ingresso e di uscita in una soluzione di etanolo al 70% un giorno prima della preparazione del chip PDMS.

Il giorno successivo riempire una siringa da cinque millilitri con acqua sterilizzata in autoclave e lavare ogni tubo posizionando il tubo sulla siringa e sciacquando il tubo con acqua. Ripetere la fase di lavaggio almeno tre volte per rimuovere l'etanolo residuo. Successivamente, esaminare i canali PDMS al microscopio ottico.

Utilizzando un obiettivo 10 X assicurarsi che le strutture siano coerenti e integre. Stabilizzare il chip PDMS intatto sulla piattaforma del microscopio utilizzando lo scotch. Fissare una siringa da cinque millilitri caricata con acqua sterile a una pompa a siringa e inserire i tubi di ingresso e uscita corrispondenti nel dispositivo.

Impostare la portata a 750 microlitri all'ora e sciacquare il chip per circa 10 minuti. Guarda i canali per assicurarti che eventuali bolle d'aria vengano lavate via. Se dopo i 10 minuti di risciacquo rimangono delle bolle, regolare manualmente la velocità per eliminare le bolle.

Trasferire un millilitro di un campione di lievito preparato in due provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare i campioni per cinque minuti a 3.000 volte G.Rimuovere la maggior parte del surnatante da ciascuna provetta e combinare il resto per formare un campione da 5 millilitri. Con il campione di lievito ora pronto, rimuovere le provette di ingresso dal chip PDMS. Invertire manualmente la pompa a siringa per aspirare una piccola bolla d'aria lunga da uno a due centimetri, ciascun tubo di ingresso, quindi aspirare le colture cellulari.

Quindi reinserire il tubo di ingresso nel chip PDMS e riavviare la pompa per caricare le celle a una velocità di 750 microlitri all'ora. Lasciare accesa la pompa a siringa per 10 minuti, quindi esaminare la progressione del carico cellulare al microscopio. Un caricamento riuscito intrappolerà le celle sotto oltre il 60% del pilastro di sospensione.

Per mantenere le cellule di lievito, passare la soluzione nella siringa a una soluzione nutrizionale e regolare la velocità a 400 microlitri all'ora. Il fenotipo della durata della vita del lievito può essere ottenuto contando il numero di gemme prodotte da ciascuna cellula madre intrappolata e stimando lo stimatore di Kaplan-Meier. Utilizzando questo protocollo, il dispositivo intrappola spesso le cellule figlie fresche che si sono staccate dalle cellule già intrappolate.

Queste cellule si trasformano quindi in cellule madri fresche che possono essere identificate utilizzando il software di analisi delle immagini a valle. Queste cellule madri fresche forniscono una misurazione più accurata della durata della vita. In questo esperimento, la durata media della vita delle cellule madri fresche era leggermente più lunga di circa due generazioni.

Oltre al numero di gemme, dai dati di imaging è possibile estrarre l'intervallo di tempo tra due eventi di gemmazione successivi. La gemmazione rallenta drasticamente verso la fine della loro vita, indicando lo stato malsano di queste cellule invecchiate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare sia di utilizzare un chip appena fatto per evitare bolle, sia di aumentare la concentrazione delle celle per migliorare l'efficienza del caricamento delle celle quando necessario.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento del lievito per esplorare i primi cambiamenti molecolari che sono causali del fenotipo dell'invecchiamento. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come realizzare questo dispositivo microfluidico e di come usarlo per misurare la durata della vita e i fenotipi cellulari nelle singole cellule.