ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

L'obiettivo generale di ODELAY è misurare i fenotipi di crescita di singole cellule che si sviluppano in colonie in modo ad alto rendimento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in microbiologia, genetica e biologia dei sistemi, come gli effetti delle perturbazioni genetiche e delle interazioni tra farmaci sui fenotipi di crescita di qualsiasi microorganismo formante colonie. Il vantaggio principale di ODELAY è che consente al ricercatore di osservare e quantificare direttamente l'eterogeneità della popolazione all'interno di un elevato numero di individui.

Prima di assemblare lo stampo in agar, pulire gli stampi in acrilico con etanolo al 70% ed asciugarli utilizzando aria forzata. Ci sono tre pezzi inferiori e due pezzi verticali. Per iniziare l'assemblaggio dello stampo in agar, prendere i tre pezzi inferiori e assemblarli in modo che i due pezzi identici incornicino il terzo pezzo.

Utilizzare due fermagli piccoli per bloccare le parti inferiori su ciascun lato. Inserire i montanti nello stampo assicurandosi che la curva del laser sia posizionata correttamente. Posizionare un vetrino pulito e asciutto sullo stampo e tenerlo fermo mentre si posiziona un secondo vetrino sull'altro lato.

Fissare l'assemblaggio con una graffetta da ufficio più grande. Fissare entrambi i vetrini con graffette da ufficio più grandi, assicurandosi che ogni graffetta superiore sia a contatto con il vetrino di vetro, sovrapponendosi all'acrilico. Prima di riempire lo stampo assemblato con agar fuso, assicurarsi che i bordi siano sigillati pipettando circa 70 microlitri di terreno agar fuso lungo il lato interno dello stampo.

Riempire lo stampo senza intrappolare bolle d'aria, pipettando lentamente l'agar fuso lungo il bordo dello stampo. Dopo aver riempito lo stampo, lasciarlo raffreddare a una temperatura ambiente di circa 23 gradi Celsius per 40-60 minuti. Il passaggio successivo è la separazione dello stampo.

Iniziare rimuovendo la graffetta inferiore. Quindi rimuovere la parte inferiore dello stampo, costituita dalle tre parti sovrapposte. Tenere ferme le lamelle comprimendole, quindi rimuovere con cura le graffette.

Posizionare lo stampo sul bordo del piano del bancone in modo che il lato dello stampo con il punto blu sia rivolto verso l'alto. Posizionare entrambi i pollici sotto l'acrilico e le prime dita sulla parte superiore, verso il bordo interno dello stampo, e spingere lentamente e con attenzione verso l'alto con i pollici contro lo stampo, come se si dovesse far ruotare lo spessore dello stampo attorno al suo bordo inferiore. Applicare una pressione costante ma gradualmente crescente.

Dovrebbe apparire una rottura e una bolla d'aria lungo la linea in cui il vetro superiore copre lo spaziatore del stampo. Dopo aver visto la linea iniziale di rottura, continuare a spingere verso l'alto con entrambi i pollici ed esercitare una pressione costante. L'agar inizierà a staccarsi dal vetro.

Continuare a ruotare lo stampo verso l'alto. Quando il vetro si stacca completamente, afferrarlo ed eliminarlo del tutto dallo stampo. Quindi rimuovere l'altro pezzo dello stampo utilizzando un movimento simile per sollevare il pezzo senza spostare l'agar.

Posizionare i vetrini in una scatola sterile per punte con un po' di acqua sterile ad alta purezza sul fondo. Chiudere la scatola e conservare a 4 gradi Celsius durante la notte per l'utilizzo il giorno successivo. Iniziare questa procedura preparando i ceppi in una piastra a 96 pozzetti come descritto nel protocollo testuale.

Utilizzare un lettore di piastre per misurare la densità ottica a 600 nanometri di ciascuna coltura. Successivamente, utilizzare un protocollo di diluizione automatico per diluire le colture nella piastra fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,1. Una volta configurato il programma di diluizione, caricare le piastre, i tubi e le punte sul deck del robot per la manipolazione dei liquidi secondo quanto indicato dal layout del deck.

Fare clic sul pulsante di riproduzione per eseguire il programma di diluizione. Selezionare il numero corretto di punte da 50 microlitri e il numero corretto di punte da 300 microlitri. Al termine della diluizione, rimuovere la piastra di diluizione dal robot e coltivare la piastra a 30 gradi Celsius, mantenendo l'umidità per evitare che la piastra si secchi, per cinque-sei ore.

Circa una o due ore prima del completamento dell'incubazione della piastra di coltura, accendere le camere di incubazione per il microscopio e lasciarle equilibrare a 30 gradi Celsius. Diluire nuovamente la coltura fino a un'assorbanza a 600 nanometri compresa tra 0,01 e 0,02, utilizzando lo stesso protocollo di diluizione automatica. Coprire la piastra di diluizione con un sigillo metallico per congelatore ed eseguire la sonificazione in un bagno di ghiaccio per 30 secondi, con la piastra che galleggia nell'acqua ghiacciata.

Etichettare quattro piastre a 96 pozzetti con fondo piatto come uno, due, tre e quattro. Trasferire 150 microlitri di ciascuna coltura sonificata dalla piastra di diluizione alle piastre con fondo piatto seguendo questo schema. Pozzetti A1 a D6 nei pozzetti C4 a F9 della Piastra Uno.

Pozzetti A7-D12 nei pozzetti C4-F9 della Piastra Due. Pozzetti E1-H6 nei pozzetti C4-F9 della Piastra Tre. E pozzetti E7-H12 nei pozzetti C4-F9 della Piastra Quattro.

Per iniziare questa procedura, posizionare correttamente il vetrino in agarosio nella camera per vetrini. Successivamente, posizionare le piastre a 96 pozzetti con fondo piatto sul tavolo in ordine di quadrante. Piastra Uno, Due, Tre e Quattro da sinistra a destra.

Disporre le punte in quattro contenitori vuoti per punte in modo che i 24 pozzetti interni di ciascun contenitore siano occupati da punte. In un quinto contenitore, posizionare una punta nella posizione C10 e punte con l'estremità tagliata nelle posizioni A1, A12, H1 e H12. Queste quattro punte tagliate forniranno stabilità per la pinza della piastra delle punte.

Posizionare il primo punzone nel sito iniziale del programma di controllo del robot per effettuare un foro nell'agarosio, da utilizzare successivamente per allineare le coordinate dell'origine. Posizionare la Piastra Uno sul robot per la manipolazione di liquidi per eseguire il puntamento del primo quadrante. Rimuovere il coperchio e proseguire con il programma di puntamento.

Verificare che tutti i punti siano presenti. Svuotare le punte usate nel contenitore per rifiuti biologici e posizionare punte nuove sul robot. Attendere circa 30 secondi perché i punti si asciughino fino a un diametro di circa un millimetro, quindi proseguire con il programma.

Sostituire la Piastra Uno con la Piastra Due e continuare il programma di inoculo. Una volta inoculati tutti e quattro i quadranti e asciugati i punti, riposizionare il coperchio della camera per vetrini e capovolgere l'apparecchio. Posizionare un vetrino in vetro sul lato superiore della camera per vetrini.

Caricare innanzitutto la camera per vetrino sul microscopio. La microscopia a intervalli è eseguita tramite l'esecuzione di uno script appositamente progettato. Fare clic sull'otturatore per aprire l'otturatore della luce trasmessa, quindi sul pulsante di messa a fuoco per avviare la velocità elevata della fotocamera.

Fare clic su "Go Origin" e spostare la piastra per individuare il segno di origine impresso nell'agar, quindi spostarsi leggermente a destra per mettere a fuoco le cellule posizionate nell'area E7. Tornare al foro di origine e centrarlo nel campo visivo. Impostare l'origine su questo valore premendo il pulsante "Set". Spostarsi sulla posizione H18 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a tale posizione.

Quindi spostarsi sulla posizione L7 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a tale posizione. Infine, spostarsi sulla posizione E7 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a tale posizione. Verificare il fuoco al centro e ai bordi nei punti E12, H12 e L12, e regolare l'intervallo di messa a fuoco automatica se i valori z del fuoco, indicati dal valore z, sono superiori al più o meno l'intervallo di messa a fuoco automatica.

Premere il pulsante Reset e quindi premere ODELAY. Scegliere la directory in cui salvare i dati. Il microscopio acquisirà i dati per 48 ore o fino a quando il programma non verrà chiuso.

Queste immagini rappresentative in time-lapse mostrano cellule di lievito che crescono su mezzo solido a zero ore, tre ore, sei ore e nove ore dopo il posizionamento. Qui viene mostrato un insieme di dati rappresentativo che confronta due ceppi di lievito dopo l'elaborazione delle immagini in time-lapse. I tempi di raddoppio relativamente uniformi riflettono la preparazione accurata della piastra in agarosio, tuttavia i tempi di latenza variano notevolmente a causa delle impostazioni dell'autofocus non ottimali.

Qui viene mostrato un insieme di dati più coerente, in cui tutti i tempi di raddoppio sembrano sovrapporsi bene e i tempi di latenza appaiono consistenti. Una volta acquisita padronanza, l'allestimento di ODELAY può essere completato in tre o quattro ore se eseguito correttamente. I passaggi più critici per ottenere misurazioni ODELAY ripetibili sono la preparazione costante del mezzo e l'evitare di deformare meccanicamente il mezzo durante la separazione dei vetrini.

ODELAY è un saggio molto sensibile. Ad esempio, può rilevare difetti di crescita in ceppi di lievito sensibili alla temperatura a temperatura ambiente, mentre i saggi comunemente usati basati su spot richiedono la coltivazione del lievito a 37 gradi centigradi per evidenziare un difetto di crescita. Sebbene ODELAY sia stato sviluppato nel lievito, il metodo è applicabile a qualsiasi organismo formante colonie, inclusi patogeni, per esplorare un'ampia gamma di condizioni ambientali e genetiche al fine di comprendere il comportamento dei microrganismi.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'ODELAY per misurare i fenotipi di crescita di microrganismi unicellulari che formano colonie su terreni solidi. Non dimenticare che lavorare con microrganismi può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati agli organismi studiati.