Name: ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Impara il metodo ODELAY per quantificare i fenotipi di crescita del lievito su terreno solido mediante microscopia time-lapse. Questa tecnica ad alto rendimento consente di osservare l'eterogeneità della popolazione cellulare.

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Gli autori riconoscono il sostegno di questo lavoro con borse U54 RR022220 e P50 GM076547 a JDA presso gli Istituti Nazionali di Salute degli Stati Uniti. FDM è un collega postdoctoral con gli Istituti Canadesi per la Ricerca sulla Salute. Ringraziamo inoltre il Centro di Lussemburgo per la Sistemi Biomedicina e l&#39;Università di Lussemburgo per il supporto.

<ol><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li>
<li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mass%2C+density%2C+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li>
<li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scan-o-matic%3A+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li>
<li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+%27omics%27%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177(2014).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325(2012).</li>
<li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22ODELAY%21+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li>
<li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25225336">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4297649/">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il test ODELAY ha diversi punti critici per garantire misure fenotipiche riproducibili e affidabili. Il primo punto critico è la preparazione costante delle colture di lievito. Occorre prestare attenzione a raccogliere le cellule del lievito dalla crescita logaritmica. Se le culture sono saturate, la loro eterogeneità della popolazione sarà aumentata, che può offuscare l&#39;eterogeneità causata da fattori genetici o ambientali ( ad esempio, fonte di carbonio) 11 . Il secondo punto critico è la preparazione coerente dei supporti. In generale, è necessario generare un ampio volume di 10X media media solution e quindi utilizzare nel tempo per ridurre al minimo gli effetti batch. Formulare i supporti in peso, quando possibile, aiuta a migliorare la consistenza del mezzo nel tempo assicurando la densità di agar e il tenore totale dell&#39;acqua dell&#39;agarosio può essere strettamente monitorato. Il terzo punto critico comporta minimizzare o eliminare qualsiasi deformazione meccanica dell&#39;agarosio media. La deformazione meccanica dei supporti si verifica più frequentemente durante la separazione dell&#39;agarosio dalle vetrate. Come per molte tecniche di laboratorio, è necessaria la pratica per capire questo passo. La variazione del tempo di ritardo come mostrato nella figura 4 è spesso correlata a uno dei tre fattori: deformazione meccanica del mezzo agarosio, variazione dello spessore agarizzato o una sorgente luminosa instabile. Se il mezzo di agarosio varia in altezza Z attraverso l&#39;array spotted, la variazione di altezza può superare l&#39;intervallo della routine di autofocus, causando che le immagini iniziali siano leggermente fuori fuoco. Per questo motivo, controllare l&#39;altezza di messa a fuoco in più punti al centro e lungo i bordi della matrice macchiata per assicurare che la routine di autofocus abbia una sufficiente gamma di Z per trovare la messa a fuoco. Se necessario, utilizzare il pannello Autofocus per aumentare l&#39;intervallo di messa a fuoco e aumentare il numero di passi di messa a fuoco. Un terzo possibile conditIone che può portare a un cattivo fuoco è una sorgente luminosa instabile o sfarfallante che può interrompere il punteggio di focalizzazione calcolato per una specifica altezza Z. Le lampade alogene del tungsteno tendono a sfarfallare ben prima che le lampadine bruciano. L&#39;effetto di scarsa attenzione viene osservato in un esempio in cui le curve di crescita inumidiscono tra il primo e il secondo punto temporale ( Figura 5 A ), mentre il punto adiacente non ha lo stesso tuffo ( Figura 5 B ). In questo caso, la scarsa condizione di messa a fuoco è stata alleviata sostituendo la sorgente di luce alogena al tungsteno. In pratica, gli autori hanno scoperto che per ridurre il sfarfallio di lampadine alogene da 100W, le lampadine devono essere sostituite ogni 500 ore circa ogni due mesi quando i microscopi sono sotto uso pesante. Per evitare problemi di messa a fuoco poveri da una lampadina di sfarfallio, sostituire spesso la fonte di luce alogena al tungsteno o sostituire la lampada alogena con una sorgente luminosa a diodi. UnEsempio di un set di dati che mostra una scarsa variabilità dei tempi di raddoppiamento e tempi di ritardo più uniformi è mostrato in Figura 6 . Questo set di dati è stato scattato con un diodo illuminante che fornisce un&#39;illuminazione più stabile nel tempo durante l&#39;esecuzione dell&#39;autofocus. Mentre molti dei punti menzionati qui per ottimizzare la preparazione dei media potrebbero apparire evidenti, nella letteratura gli schermi di grandi dimensioni non si replicano bene tra loro 8 , 11 . Di conseguenza, abbiamo descritto con cura la preparazione di culture e agarosi in modo da generare schermature fenotipiche più riproducibili. Il test ODELAY è attualmente limitato nel throughput se confrontato con i test basati sul pinning come gli array genetici sintetici o il dosaggio Scan-O-Matic. Mentre questi metodi aumentano il numero di ceppi misurati, non hanno la capacità di risolvere singole cellule aE quindi non è possibile misurare l&#39;eterogeneità della popolazione che osserviamo nei ceppi di lievito clonale. L&#39;origine di questa eterogeneità della popolazione non è attualmente compresa, ma la fusione della tecnologia e del calcolo come qui dimostrato offre un&#39;opportunità per affrontare oggettivamente i meccanismi cellulari sottostanti 12 . Gli autori vogliono notare che ODELAY è attualmente ottimizzato solo per uno specifico marchio e tipo di corpo del microscopio. La modifica di ODELAY per altri sistemi di microscopio è diretta, ma richiede la conoscenza dell&#39;API open source 13 . Tuttavia, sia l&#39;API che gli script ODELAY sono scritti per essere facilmente adattati a diversi sistemi e test sperimentali. Mentre ODELAY è stato originariamente sviluppato per il lievito, siamo stati in grado di utilizzarlo senza modifiche per osservare la crescita di Mycobacterium smegmatis . Osservazione dell&#39;altra colonia che formano microrganismi èPossibile con modifiche al codice sorgente fornito 11 . In generale, ODELAY è uno strumento potente e flessibile per confrontare i microrganismi coltivati ​​in condizioni ambientali differenti e perturbazioni genetiche.

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un forte indicatore della loro forma genetica sottostante a una determinata condizione ambientale. La crescita è classicamente segregata in 3 diversi regimi di crescita: la fase a ritardo, la fase log-fase e la fase stazionaria 1 . Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che dipendono da varie condizioni ambientali e genetiche. Ad esempio, il tempo di ritardo o la lunghezza di tempo che un organismo trascorre in fase di ritardo prima dell&#39;inizio della crescita esponenziale può essere indicativo della capacità di un organismo di rispondere alle condizioni ambientali alterate 2 . Il tempo di raddoppiamento durante la fase di fase log-phase, la metrica più comune di idoneità cellulare, rivela l&#39;efficienza complessiva dell&#39;abilità di un organismo di dividere metabolizzando e utilizzando materiali ambientali per la replica. La fase stazionaria, in cui la crescita dopo la fase log-fase è rapidamente ridotta, è un altro indicatore di idoneità, che è regolareUtilizzata come punto finale di crescita nei test di crescita del lievito a base di spot. Sono attualmente disponibili diversi test di crescita del lievito e considerati metodi standard per la valutazione dei fenotipi di crescita nel lievito 3 , 4 , 5 . Questi dosaggi sono basati principalmente sui metodi per la coltivazione di lieviti sia su supporti solidi che liquidi. Sui supporti solidi, i test di colonizzazione della colonia trasferiscono un piccolo numero di cellule su agar solido con un perno e le cellule di lievito sono lasciate crescere per un determinato periodo di tempo. Le colonie vengono poi visualizzate e le loro dimensioni vengono confrontate ad un terminale terminale 6 . Questi test di colonizzazione della colonia sono stati dimostrati robusti e scalabili per generare schermi di genoma. Più recentemente, in questi saggi sono state incorporate immagini periodiche con scanner a piatto e telecamere a riflessione a lenti singole (SLR) per registrare la crescita della colonia nel tempo 7 , 8, 9 . Tuttavia, la risoluzione di questi dispositivi impedisce loro di individuare singole celle e, di conseguenza, questi dosaggi della colonia non osservano direttamente il ritardo e non possono osservare variazioni tra le singole cellule che crescono in colonie. I test di crescita a base liquida sono stati impiegati anche per eseguire schermi a livello genomico 3 . Accoppiare un test di crescita liquido con la microscopia a tempo trascorso ha rivelato l&#39;eterogeneità della popolazione nel tempo di raddoppiamento delle cellule geneticamente identiche, che offre una prospettiva importante per comprendere la regolazione genetica e l&#39;adattamento ambientale. Tuttavia, questo dosaggio non misura altri aspetti della crescita, come il tempo di ritardo e la capacità di trasporto 10 . Qui presentiamo un metodo per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita dei microrganismi che formano la colonia su supporti solidi usando un saggio di cui abbiamo termine ODELAY 11 . ODELAY consiste di utiliZing la microscopia ad alta velocità di throughput per registrare le immagini delle cellule singole che crescono in colonie su supporti solidi. Questa popolazione di singole cellule che crescono in colonie rivela l&#39;eterogeneità della popolazione che non è rilevata da altre misurazioni meno sensibili come il punteggio finale di terminale. Noi dimostriamo il metodo sul lievito, ma ODELAY può essere applicato a qualsiasi organismo che mostra il contrasto in microscopia a campo luminoso.

<table><tbody><tr><td>Agarosio UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1,2 g/kmq</td></tr><tr><td>Estratto di lievito Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo di lievito BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo di lievito BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 valigetta</td></tr><tr><td>Provette Falcon da 15 mL</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 vetrini da 3 pollici di spessore 1,0 mm 1/2 lordo</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti fondo piatto</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Robot per la manipolazione dei liquidi Hydra</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Robot per la manipolazione dei liquidi</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL punte per freccette a lunghezza estesa</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Lettore di piastre</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo Leica 10X/0.3NA</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Fotocamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB con cassetta degli attrezzi per l'elaborazione delle immagini</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY Microscope Control (script MATLAB e GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY per script e software Matlab</td></tr><tr><td>ODELAY Camera per microscopio</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY per disegni meccanici</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY per disegni di stampi</td></tr></tbody></table>

odelay: metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un indicatore forte della loro forma genetica sottostante e possono essere segregati in 3 regimi di crescita: fase a fase di fase, fase log-fase e fase stazionaria. Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che sono legati a varie condizioni ambientali e genetiche. Le misurazioni ad alta risoluzione e quantitativa di tutte e tre le fasi di crescita sono generalmente difficili da ottenere. Qui presentiamo un metodo dettagliato per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita su supporti solidi usando un saggio chiamato Valutazione delle matrici viventi di lieviti (ODELAY) di una sola cellula. ODELAY ha quantificato i fenotipi di crescita di singole cellule che crescono in colonie su supporti solidi utilizzando microscopia a tempo trascorso. Questo metodo può osservare direttamente l&#39;eterogeneità della popolazione con ogni parametro di crescita in cellule geneticamente identiche che crescono in colonie. Questa eterogeneità della popolazione offre una prospettiva unica per comprendere la regolazione genetica e epigenetica, e le risposte aPerturbazioni genetiche e ambientali. Mentre il metodo ODELAY è dimostrato utilizzando il lievito, può essere utilizzato su qualsiasi microrganismo che produce la colonia che è visibile dalla microscopia a campo luminoso.

<html> Le immagini esemplari di lieviti che crescono in microscopia a tempo trascorso sono mostrate nella Figura 3B . Dopo aver elaborato le immagini di time-lapse, è mostrato in Figura 4 un insieme di dati rappresentativo che confronta i ceppi di lievito BY4741 &amp; BY4742. In questo set di dati di esempio, vi è una scarsa variazione nel tempo di raddoppiamento tra diverse posizioni sulla piastra. Se il mezzo agarosio è preparato male, allora una evidente deviazione sia nel tempo di raddoppiamento che nel tempo di ritardo sarebbe apparente nelle posizioni di scatto che coincidono con la regione deformata del gel agarosio. Mentre i tempi di raddoppiamento sembrano essere relativamente uniformi, questo esempio mostra variazioni nelle misurazioni del tempo di ritardo. Un insieme di dati più coerente è mostrato in Figura 6 . In questo set di dati, sia il tempo di ritardo che il tempo di raddoppiamento sono uniformi. File / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Assemblaggio della muffa di agar. I componenti dello stampo agar sono mostrati in ( A ). Montare la base come illustrato in ( B ) e quindi fissare la base con piccoli fermi di legante. Posizionare i pezzi più in posizione longitudinale nella cavità della base ( C ) e quindi incollare le diapositive nello stampo come mostrato in ( D ). Una vista laterale che mostra l&#39;angolo dello stampo e l&#39;orientamento del cerchio di stampo necessario per una separazione uniforme dell&#39;agar dalla slitta di vetro ( E ). Notare la posizione del pollice e dei forefingers, così come la linea retta dell&#39;agar che separa dalla diapositiva ( F ) e nota la freccia orizzontale. La linea di separazione deve spostarsi uniformemente in direzione delle frecce verticali. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; per: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Metodo di Sonication e Spotting. Sonicare la piastra in acqua di ghiaccio e utilizzare un supporto per secchi di centrifuga per aiutare a sostenere la piastra ( A ). Posare le piastre dalle fasi 3.8.1 fuori per la macchia sulla piastra agarosa ( B ). Inoltre, predisporre le punte in modo che la scatola sinistra più punta ha una punta nella posizione C10 e poi quattro altri punta con le loro estremità tagliate in modo che non rompino il supporto piastra ( C ). Posizionare i rimanenti rimanenti in quattro scatole in modo che le posizioni interne 24 punte siano occupate ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interfaccia utente grafica ODELAY. Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Questa interfaccia consente di monitorare la fotocamera e di regolare le impostazioni di illuminazione del microscopio per le modalità epifluorescenti e quelle a campo luminoso. Le frecce rosse puntano sui pulsanti Focus e Transmitted che attivano la fotocamera per acquisire rapidamente le immagini e aprire rispettivamente l&#39;otturatore luminoso trasmesso. Le frecce blu vengono utilizzate per spostare lo stadio per l&#39;origine e quindi impostare l&#39;origine con il pulsante &quot;Go Origin&quot; e il pulsante &quot;Set&quot;. Le frecce verdi puntano a &quot;Reset&quot; e &quot;ODELAY !!!&quot; Pulsanti che ripristina le modalità di immagine ODELAY alle condizioni attuali e inizia la collezione di immagini ODELAY. Immagini di lieviti che si coltivano su un mezzo solido a 0, 3, 6 e 9 ore dopo la comparsa ( B ). Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_IPT.m&quot; o th<html> E ODELAY Strumento di elaborazione delle immagini ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Esempio ODELAY Output. Questo insieme di dati confronta i ceppi BY4741 e BY4742 su supporti YPD. Questa figura è un esempio di uno scivolo agarosico ben preparato; Tuttavia, le impostazioni di autofocus non sono ottimali. I dati presentati in ciascuna colonna, da sinistra a destra, sono: la capacità di carico nel log 2 dell&#39;area colonia; Il tempo di raddoppiamento, dato in min; E tempi di ritardo, dati in min. In questo esempio, i tempi di raddoppiamento di tutti i punti sulla linea di agar si allineano bene con una piccola quantità di tempo di raddoppiamento aumentato verso la colonna. Tuttavia, i tempi di ritardo variano notevolmente in questo set di dati._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Esempi di curva di crescita. Questo esempio dimostra come la focalizzazione iniziale scarsa può causare il tempo di ritardo stimato (t lag ) per aumentare ( A ), mentre la posizione adiacente mostra un tempo di ritardo più breve ( B ). T d è il tempo di raddoppiamento in min e t lag è il tempo di ritardo in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Esempio di esperimento di prova eseguito bene. Un eEsemplare del ceppo BY4742 testato dopo aver sostituito una lampadina alogena al tungsteno con un diodo illuminante e assicurando che l&#39;autofocus sia impostato correttamente. Tutti i tempi di raddoppiamento sembrano sovrapporsi bene ei tempi di ritardo sembrano essere coerenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata &quot;Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito&quot; (ODELAY). L&#39;eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

L'obiettivo generale di ODELAY è misurare i fenotipi di crescita di singole cellule che si sviluppano in colonie in modo ad alto rendimento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in microbiologia, genetica e biologia dei sistemi, come gli effetti delle perturbazioni genetiche e delle interazioni tra farmaci sui fenotipi di crescita di qualsiasi microorganismo formante colonie. Il vantaggio principale di ODELAY è che consente al ricercatore di osservare e quantificare direttamente l'eterogeneità della popolazione all'interno di un elevato numero di individui.Prima di assemblare lo stampo in agar, pulire gli stampi in acrilico con etanolo al 70% ed asciugarli utilizzando aria forzata. Ci sono tre pezzi inferiori e due pezzi verticali. Per iniziare l'assemblaggio dello stampo in agar, prendere i tre pezzi inferiori e assemblarli in modo che i due pezzi identici incornicino il terzo pezzo.Utilizzare due fermagli piccoli per bloccare le parti inferiori su ciascun lato. Inserire i montanti nello stampo assicurandosi che la curva del laser sia posizionata correttamente. Posizionare un vetrino pulito e asciutto sullo stampo e tenerlo fermo mentre si posiziona un secondo vetrino sull'altro lato.Fissare l'assemblaggio con una graffetta da ufficio più grande. Fissare entrambi i vetrini con graffette da ufficio più grandi, assicurandosi che ogni graffetta superiore sia a contatto con il vetrino di vetro, sovrapponendosi all'acrilico. Prima di riempire lo stampo assemblato con agar fuso, assicurarsi che i bordi siano sigillati pipettando circa 70 microlitri di terreno agar fuso lungo il lato interno dello stampo.Riempire lo stampo senza intrappolare bolle d'aria, pipettando lentamente l'agar fuso lungo il bordo dello stampo. Dopo aver riempito lo stampo, lasciarlo raffreddare a una temperatura ambiente di circa 23 gradi Celsius per 40-60 minuti. Il passaggio successivo è la separazione dello stampo.Iniziare rimuovendo la graffetta inferiore. Quindi rimuovere la parte inferiore dello stampo, costituita dalle tre parti sovrapposte. Tenere ferme le lamelle comprimendole, quindi rimuovere con cura le graffette.Posizionare lo stampo sul bordo del piano del bancone in modo che il lato dello stampo con il punto blu sia rivolto verso l'alto. Posizionare entrambi i pollici sotto l'acrilico e le prime dita sulla parte superiore, verso il bordo interno dello stampo, e spingere lentamente e con attenzione verso l'alto con i pollici contro lo stampo, come se si dovesse far ruotare lo spessore dello stampo attorno al suo bordo inferiore. Applicare una pressione costante ma gradualmente crescente.Dovrebbe apparire una rottura e una bolla d'aria lungo la linea in cui il vetro superiore copre lo spaziatore del stampo. Dopo aver visto la linea iniziale di rottura, continuare a spingere verso l'alto con entrambi i pollici ed esercitare una pressione costante. L'agar inizierà a staccarsi dal vetro.Continuare a ruotare lo stampo verso l'alto. Quando il vetro si stacca completamente, afferrarlo ed eliminarlo del tutto dallo stampo. Quindi rimuovere l'altro pezzo dello stampo utilizzando un movimento simile per sollevare il pezzo senza spostare l'agar. Posizionare i vetrini in una scatola sterile per punte con un po' di acqua sterile ad alta purezza sul fondo. Chiudere la scatola e conservare a 4 gradi Celsius durante la notte per l'utilizzo il giorno successivo. Iniziare questa procedura preparando i ceppi in una piastra a 96 pozzetti come descritto nel protocollo testuale.Utilizzare un lettore di piastre per misurare la densità ottica a 600 nanometri di ciascuna coltura. Successivamente, utilizzare un protocollo di diluizione automatico per diluire le colture nella piastra fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,1. Una volta configurato il programma di diluizione, caricare le piastre, i tubi e le punte sul deck del robot per la manipolazione dei liquidi secondo quanto indicato dal layout del deck.Fare clic sul pulsante di riproduzione per eseguire il programma di diluizione. Selezionare il numero corretto di punte da 50 microlitri e il numero corretto di punte da 300 microlitri. Al termine della diluizione, rimuovere la piastra di diluizione dal robot e coltivare la piastra a 30 gradi Celsius, mantenendo l'umidità per evitare che la piastra si secchi, per cinque-sei ore.Circa una o due ore prima del completamento dell'incubazione della piastra di coltura, accendere le camere di incubazione per il microscopio e lasciarle equilibrare a 30 gradi Celsius. Diluire nuovamente la coltura fino a un'assorbanza a 600 nanometri compresa tra 0,01 e 0,02, utilizzando lo stesso protocollo di diluizione automatica. Coprire la piastra di diluizione con un sigillo metallico per congelatore ed eseguire la sonificazione in un bagno di ghiaccio per 30 secondi, con la piastra che galleggia nell'acqua ghiacciata.Etichettare quattro piastre a 96 pozzetti con fondo piatto come uno, due, tre e quattro. Trasferire 150 microlitri di ciascuna coltura sonificata dalla piastra di diluizione alle piastre con fondo piatto seguendo questo schema. Pozzetti A1 a D6 nei pozzetti C4 a F9 della Piastra Uno.Pozzetti A7-D12 nei pozzetti C4-F9 della Piastra Due. Pozzetti E1-H6 nei pozzetti C4-F9 della Piastra Tre. E pozzetti E7-H12 nei pozzetti C4-F9 della Piastra Quattro.Per iniziare questa procedura, posizionare correttamente il vetrino in agarosio nella camera per vetrini. Successivamente, posizionare le piastre a 96 pozzetti con fondo piatto sul tavolo in ordine di quadrante. Piastra Uno, Due, Tre e Quattro da sinistra a destra.Disporre le punte in quattro contenitori vuoti per punte in modo che i 24 pozzetti interni di ciascun contenitore siano occupati da punte. In un quinto contenitore, posizionare una punta nella posizione C10 e punte con l'estremità tagliata nelle posizioni A1, A12, H1 e H12. Queste quattro punte tagliate forniranno stabilità per la pinza della piastra delle punte.Posizionare il primo punzone nel sito iniziale del programma di controllo del robot per effettuare un foro nell'agarosio, da utilizzare successivamente per allineare le coordinate dell'origine. Posizionare la Piastra Uno sul robot per la manipolazione di liquidi per eseguire il puntamento del primo quadrante. Rimuovere il coperchio e proseguire con il programma di puntamento.Verificare che tutti i punti siano presenti. Svuotare le punte usate nel contenitore per rifiuti biologici e posizionare punte nuove sul robot. Attendere circa 30 secondi perché i punti si asciughino fino a un diametro di circa un millimetro, quindi proseguire con il programma.Sostituire la Piastra Uno con la Piastra Due e continuare il programma di inoculo. Una volta inoculati tutti e quattro i quadranti e asciugati i punti, riposizionare il coperchio della camera per vetrini e capovolgere l'apparecchio. Posizionare un vetrino in vetro sul lato superiore della camera per vetrini.Caricare innanzitutto la camera per vetrino sul microscopio. La microscopia a intervalli è eseguita tramite l'esecuzione di uno script appositamente progettato. Fare clic sull'otturatore per aprire l'otturatore della luce trasmessa, quindi sul pulsante di messa a fuoco per avviare la velocità elevata della fotocamera.Fare clic su "Go Origin" e spostare la piastra per individuare il segno di origine impresso nell'agar, quindi spostarsi leggermente a destra per mettere a fuoco le cellule posizionate nell'area E7. Tornare al foro di origine e centrarlo nel campo visivo. Impostare l'origine su questo valore premendo il pulsante "Set". Spostarsi sulla posizione H18 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a tale posizione.Quindi spostarsi sulla posizione L7 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a tale posizione. Infine, spostarsi sulla posizione E7 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a tale posizione. Verificare il fuoco al centro e ai bordi nei punti E12, H12 e L12, e regolare l'intervallo di messa a fuoco automatica se i valori z del fuoco, indicati dal valore z, sono superiori al più o meno l'intervallo di messa a fuoco automatica.Premere il pulsante Reset e quindi premere ODELAY. Scegliere la directory in cui salvare i dati. Il microscopio acquisirà i dati per 48 ore o fino a quando il programma non verrà chiuso.Queste immagini rappresentative in time-lapse mostrano cellule di lievito che crescono su mezzo solido a zero ore, tre ore, sei ore e nove ore dopo il posizionamento. Qui viene mostrato un insieme di dati rappresentativo che confronta due ceppi di lievito dopo l'elaborazione delle immagini in time-lapse. I tempi di raddoppio relativamente uniformi riflettono la preparazione accurata della piastra in agarosio, tuttavia i tempi di latenza variano notevolmente a causa delle impostazioni dell'autofocus non ottimali.Qui viene mostrato un insieme di dati più coerente, in cui tutti i tempi di raddoppio sembrano sovrapporsi bene e i tempi di latenza appaiono consistenti. Una volta acquisita padronanza, l'allestimento di ODELAY può essere completato in tre o quattro ore se eseguito correttamente. I passaggi più critici per ottenere misurazioni ODELAY ripetibili sono la preparazione costante del mezzo e l'evitare di deformare meccanicamente il mezzo durante la separazione dei vetrini.ODELAY è un saggio molto sensibile. Ad esempio, può rilevare difetti di crescita in ceppi di lievito sensibili alla temperatura a temperatura ambiente, mentre i saggi comunemente usati basati su spot richiedono la coltivazione del lievito a 37 gradi centigradi per evidenziare un difetto di crescita. Sebbene ODELAY sia stato sviluppato nel lievito, il metodo è applicabile a qualsiasi organismo formante colonie, inclusi patogeni, per esplorare un'ampia gamma di condizioni ambientali e genetiche al fine di comprendere il comportamento dei microrganismi.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'ODELAY per misurare i fenotipi di crescita di microrganismi unicellulari che formano colonie su terreni solidi. Non dimenticare che lavorare con microrganismi può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati agli organismi studiati.

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