ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

L'obiettivo generale di ODELAY è misurare i fenotipi di crescita delle singole cellule che crescono in colonie in modo ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in microbiologia, genetica e biologia dei sistemi, come gli effetti delle perturbazioni genetiche e delle interazioni farmacologiche sui fenotipi di crescita di qualsiasi microrganismo formante colonie. Il vantaggio principale di ODELAY è che consente al ricercatore di osservare e quantificare direttamente l'eterogeneità della popolazione tra un gran numero di individui.

Prima di assemblare lo stampo per agar, pulire gli stampi in acrilico con etanolo al 70% e asciugarli con aria forzata. Ci sono tre pezzi inferiori e due pezzi verticali. Per iniziare il montaggio dello stampo per agar, prendere i tre pezzi inferiori e assemblarli in modo che i due pezzi identici racchiudano il terzo pezzo.

Utilizzare due piccole clip per legare per bloccare i pezzi di base su ciascun lato. Posizionare i montanti nello stampo assicurandosi che la curva laser sia posizionata correttamente. Posizionare un vetrino pulito e asciutto sullo stampo e tenerlo in posizione mentre si posiziona un secondo vetrino sull'altro lato.

Bloccare il gruppo con una clip per legante più grande. Fissare entrambe le diapositive con clip per raccoglitori più grandi, assicurandosi che ciascuna clip per raccoglitore superiore sia a contatto con il vetrino sovrapposto all'acrilico. Prima di riempire lo stampo assemblato con agar fuso, assicurarsi che i bordi siano sigillati pipettando circa 70 microlitri di terreno di agar fuso lungo il lato interno dello stampo.

Riempi lo stampo senza intrappolare bolle d'aria all'interno pipettando lentamente l'agar fuso lungo il bordo dello stampo. Dopo che lo stampo è stato riempito, lasciarlo raffreddare a circa 23 gradi Celsius a temperatura ambiente per 40-60 minuti. Il passo successivo è la separazione dello stampo.

Inizia rimuovendo la clip del raccoglitore inferiore. Togliete quindi la parte inferiore dello stampo che consiste nei tre pezzi a sandwich. Tenere le diapositive comprimendole, quindi rimuovere con cautela le clip del raccoglitore.

Posiziona lo stampo sul bordo del piano di lavoro in modo che il lato dello stampo con il punto blu sia rivolto verso l'alto. Posiziona entrambi i pollici sotto l'acrilico e le prime dita in alto verso il bordo interno dello stampo e spingi lentamente e con attenzione verso l'alto con i pollici contro lo stampo come se ruotassi il distanziatore dello stampo attorno al bordo inferiore. Applicare una pressione costante ma lentamente crescente.

Una rottura e una bolla d'aria dovrebbero apparire lungo una linea in cui il vetro superiore copre il distanziatore dello stampo. Dopo aver visto la linea di rottura iniziale, continua a spingere verso l'alto con entrambi i pollici e applica una pressione costante. L'agar dovrebbe iniziare a staccarsi dal bicchiere.

Continuare a ruotare lo stampo verso l'alto. Poiché il bicchiere è completamente libero, afferralo e rimuovilo completamente dallo stampo. Quindi rimuovere l'altro pezzo di stampo usando un movimento simile per sollevare il pezzo senza muovere l'agar.

Posizionare i vetrini in una scatola sterile con un po' di acqua sterile ad alta purezza sul fondo. Chiudere la scatola e conservare a 4 gradi Celsius durante la notte per utilizzarla il giorno successivo. Iniziare questa procedura preparando i ceppi in una piastra a 96 pozzetti come descritto nel protocollo di testo.

Utilizzo di un lettore di piastre per misurare la densità ottica a 600 nanometri di ogni coltura. Successivamente, utilizzare un protocollo di diluizione automatizzato per diluire le colture nella piastra a una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,1. Una volta impostato il programma di diluizione, caricare piastre, tubi e punte sul ponte del robot per la manipolazione dei liquidi come indicato dal layout del piatto.

Fare clic sul pulsante di riproduzione per eseguire il programma di diluizione. Selezionare il numero corretto di puntali da 50 microlitri e il numero corretto di puntali da 300 microlitri. Al termine della diluizione, rimuovere la piastra di diluizione dal robot e coltivare la piastra a 30 gradi Celsius mantenendo l'umidità per evitare che la piastra si asciughi per cinque o sei ore.

Circa una o due ore prima del completamento dell'incubazione della piastra di coltura, accendere le camere di incubazione per il microscopio e lasciarle equilibrare a 30 gradi Celsius. Diluire la coltura una seconda volta a una densità ottica a 600 nanometri da 0,01 a 0,02 utilizzando lo stesso protocollo di diluizione automatizzato. Coprire la piastra di diluizione con un sigillo metallico per congelatore e sonicare in un bagno di ghiaccio per 30 secondi con la piastra che galleggia in acqua ghiacciata.

Etichettare quattro piastre a fondo piatto da 96 pozzetti come una, due, tre e quattro. Trasferire 150 microlitri di ciascuna coltura sonicata dalla piastra di diluizione alle piastre a fondo piatto seguendo questo schema. Pozzetti da A1 a D6 nei pozzetti da C4 a F9 della Piastra Uno.

Pozzetti da A7 a D12 nei pozzetti da C4 a F9 della Piastra Due. Pozzetti da E1 a H6 nei pozzetti da C4 a F9 della Piastra Tre. E i pozzetti da E7 a H12 nei pozzetti da C4 a F9 della Piastra Quattro.

Per iniziare questa procedura, posizionare correttamente il vetrino di agarosio nella camera del vetrino. Quindi posiziona le 96 piastre a fondo piatto sul tavolo nell'ordine del loro quadrante. Tavole Uno, Due, Tre e Quattro da sinistra a destra.

Disporre le punte in quattro scatole vuote in modo che i 24 pozzetti interni di ciascuna scatola siano occupati dalle punte. In una quinta scatola, posizionare una punta in posizione C10 e le punte con l'estremità tagliata nelle posizioni A1, A12, H1 e H12. Queste quattro punte tagliate forniranno stabilità al morsetto della piastra di punta.

Posizionare il primo punzone di punta nel sito iniziale del programma di puntamento del controllo del robot per praticare un foro nell'agarosio da utilizzare successivamente per allineare le coordinate di origine. Posiziona la piastra uno sul robot di manipolazione dei liquidi per individuare il primo quadrante. Togliete il coperchio e continuate il programma di spotting.

Verificare che tutti i punti siano presenti. Svuotare le punte usate nel contenitore del rischio biologico e posizionare le punte fresche sul robot. Attendere circa 30 secondi affinché le macchie si asciughino a circa un millimetro di diametro e poi continuare il programma.

Sostituire la piastra uno con la piastra due e continuare il programma di spotting. Quando tutti e quattro i quadranti sono stati individuati e le macchie sono asciutte, riposizionare il coperchio della camera del vetrino e capovolgere l'apparato. Posizionare un vetrino sul lato superiore della camera del vetrino.

Per prima cosa caricare la camera del vetrino nel microscopio. La microscopia time lapse viene eseguita eseguendo uno script progettato su misura. Fare clic sull'otturatore per aprire l'otturatore a luce trasmessa e quindi sul pulsante di messa a fuoco per avviare l'elevata frequenza della fotocamera.

Clicca su Vai Origine"e sposta il palco per trovare il segno di origine che è stato perforato nell'agar, quindi spostati leggermente a destra per concentrarti sulle cellule individuate nell'area E7. Torna al punzone di origine e centralo nel campo visivo. Impostare l'origine su questo valore premendo il pulsante Imposta. Spostarsi in posizione H18 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a quella posizione.

Quindi spostarsi in posizione L7 e mettere a fuoco utilizzando la vite esagonale più vicina a quella posizione. Infine, spostati in posizione E7 e metti a fuoco usando la vite esagonale più vicina a quella posizione. Controllare la messa a fuoco al centro e ai bordi nei punti E12, H12 e L12 regolare la gamma di messa a fuoco automatica se i valori z di messa a fuoco indicati dal valore z sono maggiori di più o meno la gamma di messa a fuoco automatica.

Premere il pulsante Reset" e quindi premere ODELAY. Scegliere la directory in cui salvare i dati. Il microscopio raccoglierà dati per 48 ore o fino alla chiusura del programma.

Queste immagini timelapse rappresentative mostrano cellule di lievito che crescono su un terreno solido come zero ora, tre ore, sei ore e nove ore dopo lo spotting. Qui è mostrato un set di dati rappresentativo che confronta due ceppi di lievito dopo l'elaborazione delle immagini timelapse. I tempi di raddoppio relativamente uniformi riflettono il vetrino di agarosio ben preparato, tuttavia i tempi di ritardo variano notevolmente a causa delle impostazioni di messa a fuoco automatica non ottimali.

Qui viene mostrato un set di dati più coerente in cui tutti i tempi di raddoppio sembrano sovrapporsi bene e i tempi di ritardo sembrano essere coerenti. Una volta padroneggiato, l'installazione di ODELAY può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. I passaggi più critici per le misure ripetibili di ODELAY sono la preparazione coerente del fluido e l'evitare di deformare meccanicamente il supporto durante la separazione dei vetrini.

L'ODELAY è un test molto sensibile. Ad esempio, può osservare difetti di crescita in ceppi di lievito sensibili alla temperatura a temperatura ambiente, dove i saggi basati su spot comunemente usati richiedono la coltura del lievito a 37 gradi centigradi per rivelare un difetto di crescita. Sebbene ODELAY sia stato sviluppato nel lievito, il metodo è applicabile a qualsiasi organismo formante colonie, compresi i patogeni, per esplorare un'ampia gamma di condizioni ambientali e genetiche per comprendere il comportamento dei microrganismi.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire ODELAY per misurare i fenotipi di crescita di microrganismi unicellulari che formano colonie su terreni solidi. Non dimenticare che lavorare con i microrganismi può essere pericoloso e devono essere sempre prese precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adatti agli organismi studiati.