Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

L'obiettivo generale di queste procedure è valutare la specificità e l'efficacia dei coniugati anticorpali per l'accumulo all'interno delle cellule bersaglio e dei tumori durante le fasi iniziali di sviluppo, in modo che possano essere utilizzati in clinica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla risposta ai campi coniugati, come l'efficienza della localizzazione nucleare e l'accumulo intercellulare complessivo. Un vantaggio di questa tecnica è che tramite l'imaging PET i ricercatori possono valutare l'efficacia e la selettività dei coniugati anticorpali candidati.

Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla terapia e alla diagnosi del cancro, perché l'accumulo inefficace di cellule tumorali è una delle principali limitazioni con queste applicazioni per i coniugati anticorpali. Dopo aver sintetizzato un coniugato di anticorpi della sequenza di localizzazione nucleare dell'acido colico secondo il protocollo di testo, trattare le cellule TF1A bersaglio con 200 nanomolari di coniugato di anticorpi MLS dell'acido colico 7G3. Includere cellule trattate con anticorpi monoclonali di controllo modificati.

Incubare cinque volte da 10 a sesta cellula antigene-positiva con i coniugati a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi rimuovere il surnatante e utilizzare un millilitro di PBS ghiacciato per lavare le cellule tre volte. Aggiungere un terreno fresco e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'altra ora.

Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di PBS, contenente lo 0,25% di tripsina e EDTA, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un massimo di 30 minuti. Quindi utilizzare 1,5 millilitri di RPMI1640 terreno con il 10% di FBS per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti, rimuovere il surnatante e utilizzare 0,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare nuovamente le cellule tre volte.

Aggiungi 0,5 millilitri di 1% di PFA e 1% di saccarosio e PBS alle cellule e mettile sul ghiaccio per 30 minuti per fissarle. Quindi utilizzare 0,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le celle tre volte e centrifugare i campioni a 250 volte G per cinque minuti. Quindi, aggiungi lo 0,15% di Triton X-100 e PBS alle cellule e lasciale permeare sul ghiaccio per cinque minuti.

Quindi, con PBS ghiacciato, lavare le celle e ripetere la centrifugazione. Sospendere le cellule in 0,1 millilitri di PBS, contenente due microgrammi per millilitro di un anticorpo policlonale secondario FC antimirroring coniugato ad Alexa Fluor 647, e incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare le cellule a 250 volte G per cinque minuti e utilizzare 0,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule tre volte.

Quindi sospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio alle cellule. Quindi utilizzare il mezzo di montaggio per montare una volta 10 alla quinta cella su vetrini prima di coprire il campione con un vetrino coprivetro.

Esaminare le cellule con un obiettivo a immersione in olio Plan APO 60X, apertura numerica 1,42, su un microscopio confocale a scansione laser invertita. Rileva la fluorescenza PI utilizzando il laser ad argon a 488 nanometri e il prisma a scansione spettrale impostato da 600 a 650 nanometri. Per la fluorescenza AF 647, utilizzare il laser elio-neon a 633 nanometri e il prisma a scansione spettrale impostato da 650 a 700 nanometri.

Raccogli immagini da PI e AF 647 in sequenza, 1024 x 1024 pixel, con una media delle linee 2X, scattate a intervalli di 0,5 micron attraverso l'intero spessore della cella. Presenta le immagini come proiezioni Z. Per analizzare le cellule, valutare e registrare se la fluorescenza intracellulare nel citoplasma è raggruppata e vicina alla superficie cellulare o diffusa e omogenea.

Valutare anche l'intensità relativa della fluorescenza per cellula. Dopo aver preparato e concentrato il coniugato di anticorpi NLS dell'acido colico radiomarcato secondo il protocollo di testo, determinare l'efficienza della radiomarcatura applicando 0,5 microlitri di citrato di sodio PH5,5 molare 0,1-molare, o eluente ITLC, a una striscia ITLC. Formare un'autoradiografia della striscia e ottenere un'immagine digitale.

Eseguire la densitometria per ottenere la proporzione di Rame-64 legato e libero. Se il contenuto di rame-64 libero è superiore al 5%, concentrare ulteriormente il campione. Per gli studi sull'accumulo cellulare di rame-64, trattare le cellule con 100 nanomolari di coniugati A14 marcati con rame-64 a 37 gradi Celsius per una, sei e 24 ore, come descritto in precedenza.

Trattare le cellule con A14 non modificato per bloccare gli alfaciti IL5R e a quattro gradi Celsius per bloccare l'internalizzazione mediata dal recettore. Dopo aver lavato le cellule e incubato con terreno fresco, come dimostrato in precedenza in questo video, aggiungere 0,5 millilitri di PBS contenente lo 0,25% di tripsina e EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, dopo aver neutralizzato e lavato le cellule come prima, aggiungere alle cellule un tampone di lisi della membrana plasmatica e incubarle su ghiaccio per 10 minuti.

Centrifugare le cellule lisate con membrana plasmatica a 90 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e trasferirlo in un tubo nuovo. Questo rappresenta la frazione citoplasmatica.

Quindi utilizzare il PBS ghiacciato per lavare i nuclei tre volte e aggiungere i lavaggi alla frazione citoplasmatica. Assicurarsi che le fiale contenenti le frazioni nucleari e citoplasmatiche siano sigillate, quindi inserirle in un contatore gamma calibrato per il rame-64 al fine di convertire le conte grezze in megabecaril. Determinare la qualità dell'isolamento dei nuclei eseguendo l'analisi Western-Blot per la lamina AC, una proteina nucleare ristretta; e Rab-7, un'abbondante proteina citoplasmatica, su frazioni di lisato, nucleari e citoplasmatiche.

Trattare da cinque a 10 su sei cellule con 500 microlitri di saggio di radio-amminoprecipitazione, o tampone RIPA, e tampone di lisi della membrana plasmatica contenente l'1%2% e il 4%NP-40. Inoltre, trattare i nuclei isolati con 500 microlitri di tampone RIPA per ottenere proteine nucleari isolate. Aggiungere quattro volte il volume del campione di acetone freddo alle proteine nucleari, citoplasmatiche e all'ingrosso isolate e incubare per 60 minuti a meno 20 gradi Celsius.

Centrifugare i campioni a 13.000 volte G per 10 minuti. Decantare il surnatante, facendo attenzione a non rimuovere il pellet proteico. Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS per sciogliere le proteine.

Dopo aver eseguito il Western Blotting come descritto in precedenza, tagliare la membrana a metà in corrispondenza del marcatore del peso molecolare di 40 kilodalton. Utilizzare anticorpi specifici per la lamina AC per sondare il blot contenente le proteine a peso molecolare più elevato e utilizzare anticorpi specifici per Rab-7 per sondare la metà inferiore della membrana. Nei gruppi contenenti quattro topi nodskit, iniettare nella vena caudale da 20 a 30 microgrammi di coniugato di anticorpi NLS con acido colico radiomarcato A14, NLS radiomarcato con A14 e radiomarcato A14.

Lo stesso giorno, posizionare un fantoccio cilindrico contenente cinque megabecaril di rame-64 nello scanner PET per convertire la conta radioattiva al secondo in dose iniettata per grammo di tessuto. 48 ore dopo, dopo aver anestetizzato i topi secondo il protocollo di testo, trasferire rapidamente un topo su un tavolo dello scanner PET in posizione prona con una conchina per l'isoflurano. Avviare l'acquisizione dei dati PET utilizzando una normale impostazione della modalità di campionamento e una finestra di energia da 250 a 650 kiloelettronvolt.

Dopo la scansione, rimuovere il mouse dallo scanner e rimetterlo nella gabbia. Come mostrato in questa figura, le frecce mostrano la differenza quando si valuta l'accumulo di anticorpi coniugati con e senza tripsinizzazione. Nelle cellule che non sono tripsinizzate, l'accumulo e la distribuzione intracellulare sono difficili da valutare a causa della sovraespressione dei recettori di superficie della cellula bersaglio.

Le frecce mostrano la differenza nell'accumulo intracellulare e nella distribuzione di due candidati coniugati anticorpali quando le cellule sono correttamente tripsinizzate. Il coniugato radiomarcato dell'anticorpo NLS dell'acido colico A14 mostra affinità nanomolare per IL5R alfa. Con l'aumentare delle concentrazioni di coniugato radiomarcato dell'anticorpo NLS dell'acido colico A14, il legame specifico del coniugato dell'anticorpo NLS dell'acido colico A14 si è avvicinato alla saturazione a concentrazioni di 3,5 nanomolari in entrambe le cellule HT-1376 e HT-B9.

La conta gamma rivela che l'aumento della radioattività nel nucleo e nel citoplasma dal coniugato radiomarcato con anticorpi NLS dell'acido colico A14 è specifico e aumenta nel tempo. Le cellule HT-1376 e HT-B9 sono state incubate con tampone di lisi della membrana plasmatica contenente l'1%2% o il 4%NP-40. Per le cellule HT-1376 e HT-B9, il tampone di lisi contenente uno o il 2% di NP-40 Rap-7 non è stato rilevato nella frazione nucleare e la lamina AC non è stata rilevata nella frazione citoplasmatica.

L'imaging PET consente la valutazione dei coniugati di anticorpi candidati per la loro capacità di colpire i tumori antigene-positivi, frecce rosse e blu, e le loro proprietà di biodistribuzione associate rispetto all'anticorpo parentale non modificato con peptidi. Si può vedere l'accumulo di segnale nel tumore per aiutare a selezionare il potenziale per un coniugato anticorpale sviluppato. L'imaging PET consente anche la valutazione dell'assorbimento del coniugato di anticorpi candidati in tessuti sani come il fegato.

Dopo aver padroneggiato queste tecniche, i ricercatori nel campo della somministrazione mirata di carichi utili molecolari da parte del tumore saranno in grado di esplorare ulteriori agenti in cui l'accumulo di cellule tumorali è ostacolato a causa dell'intrappolamento degli endosomi.