Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare gli organi steroidogenici e i loro organi interattivi nelle larve o nelle femmine adulte del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster. Questo metodo può aiutare a comprendere la biosintesi degli ormoni steroidei degli insetti e il meccanismo di regolazione neuronale alla base dell'accoppiamento e della metamorfosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'innervazione degli organi steroidogenici e la relativa porzione dei loro organi interattivi rimane intatta.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché gli organi steroidogenici nelle larve di mosca sono piuttosto piccoli e trasparenti. Io e il mio laboratorio siamo lieti di condividere i nostri protocolli di dissezione. Quindi, iniziamo.

Dopo aver preparato le larve, iniziare la dissezione in un piatto di tre centimetri riempito di PBS, al microscopio da dissezione. Per prima cosa, afferra il gancio della bocca con una pinza. Quindi, usando le micro forbici, recidere il corpo a circa un terzo della lunghezza dalla punta anteriore.

Quindi, tieni la lunghezza anteriore con un paio di pinze e usa un secondo paio per spingere delicatamente la punta della testa nel corpo, per capovolgere infine il corpo larvale. Preparare fino a 20 larve in questo modo entro 10 minuti, quindi trasferirle in soluzione fissativa. Trascorsi i 30 minuti, lavare i preparati e procedere con l'immunocolorazione.

Per iniziare, lasciare le larve immerse in acqua per circa un'ora, per asfissiare e immobilizzare così le larve. Quindi, posizionare una larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto in una goccia di PBS su un piatto rivestito di silicone. Il lato dorsale ha i due tubi tracheali.

Sotto un microscopio da dissezione, usa una pinza per inserire uno spillo per insetti nella punta anteriore. Quindi, allunga il corpo sul lato posteriore e inserisci un secondo perno nella punta posteriore. Quindi, fai una piccola incisione vicino alla coda usando le micro forbici.

Dall'incisione, tagliare con cura la cuticola dorsale longitudinalmente lungo la linea mediana dorsale, verso la testa, senza danneggiare nessuno dei tessuti sotto la cuticola. Dopo aver praticato l'incisione, allargare le pareti del corpo e fissarle con perni per insetti agli angoli. Quindi, usando una pinza, rimuovere il corpo adiposo anteriore e le ghiandole salivari, esponendo così il complesso ghiandola cerebrale sulla superficie.

Ora, aspirare il PBS e immergere il preparato in soluzione fissativa. Dopo 30 minuti, utilizzare una pinza per rimuovere i perni degli insetti e trasferire il preparato in una microprovetta riempita con 0,3% di PBT. Quindi, procedere con l'immunocolorazione.

Dopo l'immunocolorazione delle larve, utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni in un piatto riempito con PBT allo 0,3%. Sotto un microscopio da dissezione, afferrare la cuticola o il gancio della bocca con un paio di pinze. Quindi, utilizzare un ago calibro 27 collegato a una siringa da un millilitro, come un coltello, per rimuovere il complesso del disco oculare ghiandola dell'anello cerebrale dalla cuticola del corpo, tagliando via la punta anteriore dell'esofago e i dischi oculari.

Successivamente, usando una pinza, separare accuratamente l'esofago e l'intestino dal complesso del disco oculare della ghiandola cerebrale. Estrarre l'intestino verso il lato posteriore, poiché l'esofago passa attraverso il cervello sopra il cordone nervoso ventrale. Infine, per isolare il complesso ghiandola dell'anello cerebrale, tagliare con cura le connessioni tra il disco cerebrale, i dischi oculari e i dischi delle gambe, con un coltello ad ago.

È essenziale utilizzare una pinza fine con spigoli vivi durante la dissezione. Ti consiglio vivamente di affilare le pinze con un pezzo di mola per unire i loro bordi senza spazi vuoti. Per trasferire i campioni, utilizzare una micropipetta con una punta a foro largo.

Depositare i campioni al centro del vetrino. Quindi, usa una pinza per posizionare i campioni sui lati ventrali, in modo che la ghiandola anulare, che si trova sul lato dorsale del cervello, possa essere visualizzata. Quindi, inclinare la slitta e rimuovere il più possibile il PBT in eccesso.

Quindi, mettere una goccia di reagente di montaggio vicino ai campioni e utilizzare una pinza per abbassare lentamente un vetrino coprioggetto sul reagente e poi sui campioni. Per sezionare l'ovaio femminile adulto, anestetizzare le mosche con anidride carbonica. Quindi, taglia le loro teste e trasferisci i loro corpi in un piatto di tre centimetri pieno di PBS.

Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, afferrare il lato dorsale del torace con una pinza e afferrare il segmento addominale A-5 o A-6 con un secondo paio di pinze. Quindi, staccare la cuticola addominale verso il lato posteriore. Prima di procedere, pulire la cuticola appiccicosa dalla pinza.

Quindi, pizzica un ovadotto e isola l'ovaio. Quindi pettinare e allargare le punte dell'ovaio usando una pinza. Una volta stesa, immergere le ovaie in soluzione fissativa per 30 minuti, per prepararle alla colorazione.

Per realizzare una preparazione che mantenga l'innervazione dell'ovaio, trasferire le mosche femmina anestetizzate in un piatto rivestito di silicone riempito di PBS. Sotto il microscopio di dissezione, tenere la proboscide e staccare la cuticola della testa per esporre il cervello. Dal cervello, rimuovere la trachea attaccata, lasciando il cervello collegato al cordone nervoso ventrale.

Quindi, tieni il torace per il lato dorsale e rimuovi le zampe e le ali. Quindi, staccare la cuticola ventrale del torace, iniziando dalla base di ciascuna gamba. Una volta che il VNC è esposto, rimuovere con molta attenzione la cuticola dorsale residua e i muscoli attaccati al VNC, usando una pinza.

Non danneggiare le connessioni tra il cervello e il VNC. Successivamente, usando una pinza, stacca la cuticola addominale per esporre le ovaie e i loro organi interattivi, che includono l'oggetto, l'intestino, l'ovadotto, l'utero e la ghiandola accessoria. Infine, rimuovere tutti i tessuti residui, compresa la trachea, e il corpo adiposo.

Quindi, immergere i campioni in soluzione fissativa per 30 minuti, per prepararli all'immunocolorazione. Dopo l'immunocolorazione, trasferire i campioni su un vetrino con PBT allo 0,1% utilizzando una micropipetta. Quindi, visualizzare il vetrino con un microscopio e separare le stringhe degli ovarioli l'una dall'altra usando una pinza.

Non ferire le punte degli ovarioli durante questo processo. Contengono la germaria. Quando si prepara il cervello al complesso dell'organo riproduttivo, rimuovere qualsiasi cuticola residua e stendere le strutture sul vetrino.

Quindi, rimuovere la maggior parte del PBT in eccesso, quindi applicare una goccia di reagente di montaggio sul campione. Quindi, posizionare lentamente un vetrino coprioggetti sul vetrino usando una pinza e conservare il vetrino a quattro gradi Celsius al buio. Successivamente, osservare i campioni al microscopio e portare gli organi steroidogenici nel campo visivo.

Una volta fissata la vista, passare il sistema di imaging alla modalità di acquisizione delle immagini. Durante gli stadi larvali, la ghiandola protoracica è stata marcata con anticorpi contro gli enzimi ecdisteroidogeni, incluso l'anticorpo anti-sindone. Per visualizzare la connessione neuronale tra la ghiandola protoracica e il cervello, è stato sezionato il complesso ghiandola cerebrale-anello.

Il metodo di dissezione del filet mostra il sistema nervoso stomatogastrico, in cui un gruppo di neuroni serotoninergici proietta verso la ghiandola protoracica, il proventricolo e i muscoli faringei. Nelle femmine adulte, l'ecdisteroide ovarico influisce su molti aspetti dell'ovogenesi, come la proliferazione delle GSC. Le GSC si trovano nel germario all'estremità di ciascun ovariolo dell'ovaio.

All'interno del gerario, le GSC sono state specificamente marcate utilizzando due anticorpi, 1B1 e DE-caderina. Per visualizzare l'innervazione dell'ovaio, l'ovaio è stato sezionato, insieme al cervello, VNC, intestino, prop, utero e spermateca. I neuroni sono stati visualizzati da mCD8:GFP sotto il controllo del driver GAL4 n-sinaptobrevina.

Inoltre, la struttura dei muscoli è stata colorata utilizzando falloidina diconiugata. Sebbene la dissezione degli organi steroidogenici possa inizialmente sembrare difficile, usa questo film per imparare il punto di taglio dei tessuti per isolare più facilmente l'organo senza lesioni. Speriamo che il nostro protocollo sia informativo, non solo per i principianti, ma anche per i ricercatori esperti.

Una volta padroneggiata, puoi applicare questa procedura alla tua ricerca e rispolverare per adattarla alle tue esigenze. Speriamo che questo protocollo aiuti la comprensione completa della biosintesi degli ormoni steroidei. Protocolli più dettagliati passo dopo passo sono disponibili nel manoscritto.

Si prega di dare un'occhiata.