Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare gli organi steroidogeni e i loro organi interagenti nelle larve o nelle femmine adulte del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster. Questo metodo può contribuire a comprendere la biosintesi degli ormoni steroidei negli insetti e il meccanismo regolatorio neuronale alla base dell'accoppiamento e della metamorfosi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'innervazione degli organi steroidogeni e la posizione relativa dei loro organi interagenti rimangono intatte.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché gli organi steroidogeni nei larve di mosca sono molto piccoli e trasparenti. Il mio laboratorio e io siamo lieti di condividere i nostri protocolli di dissezione. Cominciamo dunque.

Dopo aver preparato le larve, iniziare la dissezione in una piastra di tre centimetri riempita con PBS, sotto un microscopio stereoscopico. In primo luogo, afferrare l'uncino boccale con una pinzetta. Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche, recidere il corpo a circa un terzo della lunghezza rispetto all'estremità anteriore.

Successivamente, tenere la lunghezza anteriore con una pinzetta e utilizzare una seconda pinzetta per spingere delicatamente la punta della testa all'interno del corpo, capovolgendo così completamente il corpo della larva. Preparare fino a 20 larve in questo modo entro 10 minuti, quindi trasferirle nella soluzione fissativa. Dopo 30 minuti, lavare i preparati ed eseguire la marcatura immunoistochimica.

Per iniziare, lasciare le larve immerse in acqua per circa un'ora, in modo da asfissiarle e quindi immobilizzarle. Successivamente, posizionare una larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto in una goccia di PBS su una piastra rivestita di silicone. Il lato dorsale presenta i due tubi tracheali.

Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pinzetta per inserire un ago da insetti nella punta anteriore. Successivamente, allungare il corpo verso il lato posteriore e inserire un secondo ago nella punta posteriore. Poi, praticare una piccola incisione vicino alla coda utilizzando forbici microchirurgiche.

Dall'incisione, tagliare con attenzione il tegumento dorsale longitudinalmente lungo la linea mediana dorsale, dirigendosi verso la testa, senza danneggiare i tessuti sottostanti al tegumento. Dopo aver effettuato l'incisione, allargare le pareti del corpo e fissarle con spilli entomologici agli angoli. Quindi, utilizzando una pinzetta, rimuovere il corpo adiposo anteriore e le ghiandole salivari, esponendo così il complesso cervello-ghiandola ad anello sulla superficie.

Ora, aspirare il PBS e immergere il preparato nella soluzione fissativa. Dopo 30 minuti, utilizzare pinzette per rimuovere i perni metallici per insetti e trasferire il preparato in una microprovetta riempita con PBT 0,3%. Procedere quindi con l'immunomarcatura.

Dopo la colorazione immunoistochimica delle larve, utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni in una piastra contenente PBT allo 0,3%. Sotto un microscopio stereoscopico, afferrare la cuticola o l'uncino boccale con una coppia di pinzette. Successivamente, utilizzare un ago da 27 gauge collegato a una siringa da un millilitro, come se fosse un coltello, per rimuovere il complesso disco cerebrale-glandola ad anello-disco oculare dalla cuticola del corpo, tagliando l'estremità anteriore dell'esofago e i dischi oculari.

Successivamente, utilizzando pinzette, separare con attenzione l'esofago e l'intestino dal complesso disco del cervello-glandola anulare-disco oculare. Estrarre l'intestino verso il lato posteriore, poiché l'esofago passa attraverso il cervello al di sopra del cordone nervoso ventrale. Infine, per isolare il complesso cervello-glandola anulare, tagliare con attenzione le connessioni tra il disco cerebrale, i dischi oculari e i dischi delle zampe, utilizzando un coltello a ago.

È molto importante utilizzare pinzette fini con bordi affilati durante la dissezione. Raccomando vivamente di affilare le pinzette con un pezzo di pietra abrasiva, in modo da far combaciare perfettamente i bordi senza alcuno spazio. Per trasferire i campioni, utilizzare una micropipetta con una punta a largo diametro.

Deporre i campioni al centro del vetrino. Successivamente, utilizzare pinzette per posizionare i campioni sul loro lato ventrale, in modo che la ghiandola anulare, situata sul lato dorsale del cervello, possa essere immaginata. Poi, inclinare il vetrino ed asciugare il più possibile l'eccesso di PBT.

Quindi, mettere una goccia di reagente di montaggio vicino ai campioni e utilizzare una pinzetta per abbassare lentamente un coprioggetto sul reagente, e poi sui campioni. Per dissezionare l'ovaio di femmine adulte, anestetizzare le mosche con gas anidride carbonica. Successivamente, rimuovere le loro teste e trasferire i corpi in una piastra da tre centimetri riempita con PBS.

Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, afferrare con una pinzetta il lato dorsale del torace e impugnare il segmento addominale A-5 o A-6 con una seconda pinzetta. Poi, staccare delicatamente la cuticola addominale verso il lato posteriore. Prima di proseguire, rimuovere la cuticola appiccicosa dalle pinzette.

Successivamente, afferrare un ovidotto e isolare l'ovaio. Quindi pettinare e distendere le estremità dell'ovaio utilizzando pinzette. Una volta disteso, immergere l'ovaio in soluzione fissativa per 30 minuti, al fine di prepararlo per la colorazione.

Per preparare un campione che mantenga l'innervazione dell'ovaio, trasferire le femmine anestetizzate in una piastra rivestita di silicone riempita con PBS. Sotto il microscopio di dissezione, afferrare il proboiscide ed eliminare il cuticolo della testa per esporre il cervello. Dal cervello, rimuovere la trachea adiacente, lasciando il cervello collegato al cordone nervoso ventrale.

Quindi, tenere il torace dal lato dorsale ed eliminare zampe e ali. Successivamente, rimuovere con cura la cuticola ventrale del torace, iniziando dalla base di ciascuna zampa. Una volta esposta la corda nervosa ventrale (VNC), rimuovere con estrema attenzione la cuticola dorsale residua e i muscoli ad essa attaccati, utilizzando pinzette.

Non danneggiare le connessioni tra il cervello e il cordone nervoso ventrale (VNC). Successivamente, utilizzando una pinzetta, rimuovi il cuticolo addominale per esporre le ovaie e i loro organi interagenti, che includono il prop, l'intestino, l'ovidotto, l'utero e la ghiandola accessoria. Infine, rimuovi tutti i tessuti residui, inclusa la trachea e il corpo adiposo.

Quindi, immergere i campioni in soluzione fissativa per 30 minuti, per prepararli per l'immunomarcatura. Dopo l'immunomarcatura, trasferire i campioni su un vetrino in microscopia utilizzando una micropipetta con PBT 0,1%. Successivamente, osservare il vetrino al microscopio e separare i cordoni degli ovarîoli l'uno dall'altro utilizzando pinzette.

Non danneggiare le punte degli ovarioli durante questo processo. Contengono i germari. Quando si prepara il complesso cervello-organi riproduttivi, rimuovere qualsiasi residuo di cuticola e disporre le strutture sul vetrino.

Successivamente, rimuovere la maggior parte dell'eccesso di PBT e applicare una goccia di reagente di montaggio sul campione. Poi, posizionare lentamente una lamella sul vetrino utilizzando pinzette e conservare il vetrino a quattro gradi Celsius al buio. In un secondo momento, osservare i campioni al microscopio e portare gli organi steroidogeni nel campo visivo.

Una volta fissata l'immagine, passare il sistema di acquisizione immagini alla modalità di acquisizione. Durante gli stadi larvali, la ghiandola protoracica è stata marcata con anticorpi diretti contro enzimi ecdisteroidogenici, inclusi gli anticorpi anti-shroud. Per visualizzare la connessione neuronale tra la ghiandola protoracica e il cervello, è stato dissezionato il complesso cervello-ghiandola ad anello.

Il metodo di dissezione del filet mostra il sistema nervoso stomatogastrico, nel quale un gruppo di neuroni serotoninergici proietta alla ghiandola protoracica, al proventricolo e ai muscoli faringei. Nelle femmine adulte, l'ecdisteroide ovarico influisce su molti aspetti dell'ovogenesi, come la proliferazione delle GSC. Le GSC si trovano nel germario all'estremità di ciascun ovario nello sviluppo ovarico.

All'interno del germarium, le GSC sono state specificamente marcate utilizzando due anticorpi, 1B1 e DE-caderina. Per visualizzare l'innervazione dell'ovaio, l'ovaio è stato dissezionato insieme al cervello, al VNC, all'intestino, al prop, all'utero e alla spermateca. I neuroni sono stati visualizzati mediante mCD8:GFP sotto il controllo del driver n-Synaptobrevin GAL4.

Inoltre, la struttura dei muscoli è stata colorata utilizzando la falloidina dicongiugata. Sebbene la dissezione degli organi steroidogeni possa inizialmente sembrare difficile, utilizzare questo filmato per imparare i punti di taglio dei tessuti al fine di isolare più facilmente l'organo senza danneggiarlo. Speriamo che il nostro protocollo sia informativo, non solo per i principianti, ma anche per i ricercatori esperti.

Una volta padroneggiata, è possibile applicare questa procedura alla propria ricerca e adattarla alle proprie esigenze. Speriamo che questo protocollo contribuisca a una comprensione completa della biosintesi degli ormoni steroidei. Protocolli passo dopo passo più dettagliati sono disponibili nel manoscritto.

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