Name: Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Impara a visualizzare gli organi steroidogenici e le loro interazioni in Drosophila melanogaster mediante dissezione, fissazione e immunocolorazione. Questo protocollo preserva l'innervazione per studiare la biosintesi degli ormoni steroidei.

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Ringraziamo Reiko Kise e Tomotsune Ameku per il loro supporto tecnico per questo lavoro. Siamo anche grati a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, il Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e il Developmental Studies Ibridoma Banca per le scorte e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a YSN da JSPS KAKENHI Concessione Numero 16K20945, la Fondazione Naito, e il Premio Ricerca Scienza Inoue; e da una sovvenzione alla RN da MEXT KAKENHI Concessione Numero 16H04792.

NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1. 1. La dissezione del larvale Anello Gland (RG) NOTA: In D. melanogaster, che appartiene alla Ditteri cyclorrhaphous, il PG è all&#39;interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola anello (RG, Figura 2D). Poiché è irrealizzabile che il PG è chirurgicamente separato da altri tipi di cellule (discussi in seguito), un obiettivo pratico è isolare intatto, RG indenne da dissezione. <ol><li> Preparazione di larve nelle fasi di sviluppo adeguati NOTA: Per sincronizzare le fasi di sviluppo di D. melanogaster larve, è necessario raccogliere le uova all&#39;interno di una finestra temporale ristretta e per raccogliere le larve al momento opportuno. <ol><li> Raccogliere le uova per 2 h su una piastra di agar succo d&#39;uva a 25 ° C. </li><li> Raccogliere recente-covato 1 <sup&gt; st instar larve sotto un microscopio da dissezione con una pinza e trasferirli in un piccolo flacone contenente cibo fly lievito / farina di mais standard di purè. NOTA: L&#39;età delle larve è rappresentato da &quot;ore dopo l&#39;uovo posa (Hael)&quot;, &quot;ore dopo botola (HAH)&quot;, oppure &quot;ore dopo L3 ecdysis (hAL3E)&quot;. </li><li> Al punto di tempo appropriato, raccogliere le larve di scena con un anello di plastica monouso per evitare lesioni indesiderabile. Per ridurre al minimo la differenza nella progressione evolutiva del 3 ° instar larve, raccogliere le larve instar 2 ° a 70 HAEL (48 HAH) e consentire loro di muta in intervalli di 2 h. Poi, raccogliere le larve instar 3 ° entro 2 ore dopo l&#39;ecdysis L3; questa procedura contiene 0-2 hAL3E larve. </li><li> Trasferire le larve graduale per un piatto riempito con tampone fosfato (PBS). </li><li> Risciacquare le larve con PBS per rimuovere i residui di cibo dal corpo. </li></ol></li><li> Dissezione grossolana di larve sotto undissezione microscopio <ol><li> Tenere il gancio bocca di una larva con una pinza. Recidere il corpo larvale al anterior un terzo della lunghezza del corpo con le forbici micro. </li><li> Tenere l&#39;estremità tagliata del corpo larvale anteriore con un paio di pinze. Utilizzando l&#39;altra coppia di pinze, spingere delicatamente la punta della testa verso l&#39;interno del corpo; questa procedura trasforma il corpo larvale esterno. NOTA: Questo passaggio può essere saltato per la dissezione del 1 ° instar larve. </li><li> Ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.2 con larve aggiuntivo per 5-10 minuti. NOTA: Il numero di larve deve essere uguale o inferiore a 20 per risparmiare tempo per la dissezione. </li></ol></li><li> Dissezione Filetto di larve NOTA: Questo metodo consente di mantenere la posizione dei tessuti di rimanere intatto. <ol><li> Lasciare le larve in acqua solo per 1 h. Le larve sono immobilizzati a causa di asfissia. </li><li> Mettere un lato larva dorsale in una goccia di PBS su un rivestito siliciopiatto, con il suo lato dorsale alto. NOTA: Il lato dorsale ha 2 tubi tracheali longitudinalmente. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, inserire un perno insetto nella punta anteriore della larva mediante pinza. Allungare il corpo larvale al lato posteriore e mettere un secondo perno nella punta posteriore della larva. NOTA: Oltre ai pin di insetti, un ago da un filo di tungsteno può essere utile 21. Un ago può essere incorporato in un puntale attraverso il riscaldamento per l&#39;uso come un ago da dissezione. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, fare una piccola incisione vicino alla coda con le forbici micro. Dall&#39;incisione, intercettato cuticola dorsale longitudinalmente lungo la linea mediana dorsale verso la testa. Fare attenzione a non danneggiare i tessuti sotto la cuticola. </li><li> Allungare la cuticola bodywall su ogni lato e posizionare 4 perni ad ogni angolo della bodywall sezionato. </li><li> Rimuovere una parte del grasso corporeo anteriore con una pinza, per esporre il cervello-RG complex essere esposto sulla superficie. Rimuovere una coppia di ghiandole salivari, se necessario. </li></ol></li><li> Fissazione e colorazione del tessuto con immunoistochimica <ol><li> Mettere anteriore un terzo dei corpi larvali (passo 1.2.2) in una provetta da 1,5 ml riempito con 500 microlitri della soluzione di correzione (4% paraformaldeide in PBS). Fissare meno di 20 campioni in una sola volta, tuttavia PBS acclusa ai campioni fissate possono causare una diluizione sfavorevole del fissativo. Per filetto di dissezione, rimuovere una goccia di PBS e quindi aggiungere una goccia di soluzione di correzione. NOTA: Per la soluzione correzione, possono essere utilizzati sia 3,7% formaldeide o paraformaldeide al 4%. </li><li> Incubare i tessuti sezionati nella soluzione correzione per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) o in alternativa per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Sostituire la soluzione correzione con 500 microlitri di PBS e risciacquare velocemente i campioni per 3 volte. Lavare i campioni con 500 microlitri 0,3% PBT (PBS + 0,3% ottilfenolo etossilato) per 15 minuti su un agitatore meccanico a RT. Per filetto dissezione, rimuovere i perni insetti e trasferire i campioni in un microtubo mL 1.5. NOTA: Per aumentare la permeabilità di anticorpi nei tessuti, i campioni vengono trattati con 500 microlitri 2,0% PBT per 1-2 h su un agitatore meccanico a RT. </li><li> Sostituire PBT con 500 microlitri soluzione bloccante (2% di siero albumina bovina in PBT). Incubare i campioni per 1,5 h su un agitatore meccanico a RT. </li><li> Sostituire la soluzione di saturazione con 50 microlitri della soluzione di anticorpo primario, cioè anticorpi diluiti nella soluzione di blocco. </li><li> Incubare i campioni durante la notte su una sedia a dondolo a 4 ° C. </li><li> Sostituire la soluzione di anticorpo primario con 500 microlitri 0,3% PBT e risciacquare velocemente i campioni di 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,3% PBT per 15 minuti ciascuno su un bilanciere a RT. </li><li> Sostituire 0,3% PBT con 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario (anticorpi colorante-coniugato diluito in soluzione di saturazione). Per la colorazione nucleare, 0,5 microlitri 4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,1 mg / mL di soluzione) viene aggiunto alla soluzione di 50 microlitri. Incubare i campioni su un bilanciere per 2 ore a RT oppure a 4 ° C durante la notte. NOTA: Conservare i campioni al buio. </li><li> Sostituire la soluzione di anticorpi con 500 microlitri 0,3% PBT e risciacquare 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,3% PBT per 15 minuti ciascuno a RT. </li></ol></li><li> Belle dissezione del complesso cervello RG contenente il PG e il montaggio <ol><li> Utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni immunostained ad un piatto riempito con 0,3% PBT. NOTA: per evitare bolle scomodi durante la dissezione e il montaggio, lo 0,3% PBT può essere sostituito con PBS. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, tenere premuto il gancio cuticola o bocca con una coppia di pinze. Utilizzando un ago 27 G attaccato ad una siringa da 1 ml a &quot;coltello&quot;, tagliare la punta anteriore dei dischi esofago e degli occhi per rimuovere il complesso disco-cervello RG-occhio dalla cuticola corpo. </li><li> Sepavalutare l&#39;esofago e intestino dal complesso disco di cervello-RG-eye con una pinza. Poiché l&#39;esofago passa attraverso il cervello di sopra del cordone nervoso ventrale (VNC), estrarre l&#39;intestino al lato posteriore. NOTA: Per rimuovere i dischi aggiuntivi immaginali dai campioni, tagliare le connessioni tra il cervello, i dischi degli occhi, e dischi gamba con un coltello ago. </li><li> Ripetere la procedura 1.5.1-1.5.4 per altri campioni. NOTA: per evitare residui di tessuto aderisca ai campioni, trasferire ciascun campione completato un piatto diverso pulita riempita con 0,3% PBT o PBS. </li><li> Trasferire i campioni al centro di un vetrino pulito di vetro con una micropipetta. NOTA: Per 2 ° o 3 ° larve instar, la fine di una punta micropipetta deve essere troncato con una lama di rasoio. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, allineare campioni individuali con il loro lato dorsale fino utilizzando pinze. NOTA: Il RG è situato sul lato dorsale del cervello (Figura 2A). Questo allineamento facilita la specifica dei singoli campioni durante l&#39;imaging. </li><li> Inclinare un vetrino e pulire il più in eccesso PBT possibile. Mettere una goccia di reagente montaggio su un lato della diapositiva. Posizionare il bordo di un vetrino dall&#39;altro lato della goccia e mettere il vetrino sui campioni lentamente con una pinza. NOTA: Questa procedura impedisce i campioni di muoversi fuori vetrino. </li><li> Conservare i campioni a 4 ° C. Conservare i campioni al buio. </li></ol></li></ol> 2. La dissezione delle ovaie in Le femmine adulte <ol><li> Preparazione di femmine adulte <ol><li> Alimentazione femminile vola con il cibo fly standard di lievito / farina di mais per 3-4 giorni per ingrassare l&#39;ovaio. Mantenere a 25 ° C. </li></ol></li><li> Dissezione dell&#39;ovaio femmina adulta <ol><li> Anestetizzare femminile vola con gas CO 2 e tagliare le loro teste. </li><li> Trasferire i corpi volare ad un piatto di 3 centimetririempito con PBS. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, tenere il torace sul lato dorsale con pinze. Afferrare la A5 segmento addominale o A6 con gli altri pinza e staccarsi la cuticola addominale verso il lato posteriore. Pulire la cuticola appiccicosa dalla punta della pinza. </li><li> Pizzicare un ovidotto ed estrarre l&#39;ovaio dal corpo. </li><li> Pettine e diffondere le punte delle ovaie con una pinza. NOTA: Questa operazione migliora l&#39;efficienza di immunocolorazione. </li></ol></li><li> La dissezione del cervello femminile adulta, VNC e gli organi riproduttivi. NOTA: Questo metodo permette l&#39;innervazione delle ovaie da conservare intatto. <ol><li> Anestetizzare femmina vola con gas CO 2 e trasferirli ad un piatto siliconato riempito con PBS. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, tenere la proboscide e staccarsi la cuticola testa per esporre il cervello con una pinza. Rimuovere la trachea attaccato al cervello. NOTA: Il Brain è una struttura bianca e arrotondata. Il cervello si collega al VNC nel torace. </li><li> Tenere il torace sul lato dorsale e tagliare le gambe e le ali con un paio di pinze. Utilizzando l&#39;altra coppia di pinze, staccarsi la cuticola dalle basi delle gambe toracica ventrale. Una volta che il VNC è esposto, rimuovere la cuticola dorsali residuo e muscoli attaccati alle VNC con pinze. Fare attenzione a non danneggiare la connessione tra il cervello e il VNC. </li><li> Utilizzare pinze a staccarsi la cuticola addominale ed esporre l&#39;ovaio ed i loro organi interattive tra cui neuroni, il raccolto, l&#39;intestino, l&#39;ovidotto, utero, e la ghiandola accessary. </li><li> Rimuovere i tessuti residui compresi la trachea e il grasso corporeo con pinze. </li></ol></li><li> Fissazione e colorazione del tessuto con immunoistochimica <ol><li> Trasferire circa 8-10 coppie di ovaie di una microprovetta 1,5 ml riempito con 250 microlitri della soluzione di fissaggio (4% paraformaldehyde in PBS) e incubare i campioni per 30 minuti a RT. </li><li> Sostituire la soluzione correzione con 500 microlitri di PBS e risciacquare velocemente i campioni per 3 volte. </li><li> Lavare i campioni 2 volte con 500 microlitri 0,1% PBT per 5 minuti ciascuno a RT. </li><li> Sostituire PBT con 50 microlitri soluzione bloccante. Incubare i campioni per 1 h su un agitatore meccanico a RT. </li><li> Sostituire la soluzione di saturazione con 50 microlitri soluzione di anticorpo primario. </li><li> Incubare i campioni durante la notte su una sedia a dondolo a 4 ° C. </li><li> Sostituire la soluzione di anticorpo primario con 500 microlitri 0,1% PBT. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,1% PBT per 15 minuti ciascuno su un bilanciere a RT. </li><li> Sostituire 0,1% PBT con 50 microlitri soluzione di anticorpo secondario. Per colorazione nucleare, aggiungere 0,5 microlitri DAPI a 50 microlitri della soluzione. Incubare i campioni per 2 ore su un agitatore meccanico a RT. </li><li> Sostituire la soluzione di anticorpo secondario con 500 microlitri 0,1% PBT. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,1% PBT<html> per 15 min ciascuno su un bilanciere a RT. NOTA: La procedura di lavaggio può essere effettuato a 4 ° C durante la notte. Conservare i campioni al buio. </li></ol></li><li> Montaggio dei campioni su vetrini <ol><li> Trasferire i campioni ad un vetrino con 0,1% PBT con una micropipetta. NOTA: per evitare bolle scomodi durante la dissezione e di montaggio, 0,1% PBT può essere sostituito con PBS. </li><li> Per dell&#39;ovaio, separare le stringhe dei ovarioli uno dall&#39;altro con una pinza sotto un microscopio da dissezione. Non danneggiare le punte dei ovarioli contenenti le germaria. Per il complesso organo cervello-VNC-riproduttivo, rimuovere la cuticola residuo e sistemare la posizione su un vetrino. </li><li> Rimuovere tanto eccesso PBT possibile e mettere una goccia di reagente di montaggio al centro dei campioni. Posizionare un vetrino lentamente con pinze. </li><li> Conservare i campioni a 4 ° C. Conservare i campioni al buio. </li></ol></li></ol>&quot;&gt; 3. Imaging con un microscopio a scansione laser confocale <ol><li> Osservare i campioni al microscopio e portare gli organi steroidogenici nel campo di vista. Una volta che la visualizzazione è fissa, commutare il sistema di imaging per la modalità di acquisizione dell&#39;immagine. NOTA: Le 10-20x lenti dell&#39;obiettivo sono utilizzati per ottenere le immagini del complesso cervello RG o l&#39;intero ovaio. In alternativa, i 40-63X lenti dell&#39;obiettivo (acqua o immersione) vengono utilizzati per visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine ​​GSCs oi innervazione neuronali del PG e dell&#39;ovaio. </li><li> Impostare i parametri di acquisizione delle immagini sul software allegato. Selezionare la combinazione di fluorescenza (ad esempio GFP e RFP). Con procedura scansione veloce, regolare la potenza del laser, la sensibilità di rivelatori (guadagno / offset), e la dimensione del foro. NOTA: Per acquisire immagini ad alta qualità, la potenza del laser di scansione e la sensibilità del rivelatore (guadagno) devono essere ottimizzati per ogni campione. Per delineare la formadei tessuti, a-luce trasmessa immagine può essere preso in aggiunta a un&#39;immagine fluorescente. </li><li> Prendere pile Z delle immagini. Durante una scansione veloce continuo, spostare il piano focale con l&#39;unità di messa a fuoco del microscopio e impostare la posizione iniziale e la posizione finale. Il numero di fette e la distanza tra le sezioni intervallo vengono regolati di conseguenza. </li><li> Selezionare la velocità di scansione, il metodo di scansione, e la modalità di scansione bidirezionale. </li><li> &quot;Avviare i veri scansioni&quot; per l&#39;acquisizione di immagini. </li><li> Salvare l&#39;immagine con il formato del software allegato. NOTA: I file di immagine originali contengono le informazioni dei parametri di acquisizione dell&#39;immagine e bilancia. Immagini esportate possono essere elaborati utilizzando un software di elaborazione delle immagini sul computer 22. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo studiato biosintesi ecdysteroid e il suo meccanismo di regolazione in D. melanogaster, ed ideato un protocollo per la dissezione e immunocolorazione. I tempi di biosintesi ecdysteroid è influenzato da stimoli ambientali attraverso ingressi neuronali 33, quindi è essenziale per mantenere l&#39;innervazione degli organi ecdysteroidogenic insieme al cervello, VNC, e altri tessuti durante la dissezione. Come descritto sopra, il D. melanogaster PG...

Negli organismi multicellulari, un gruppo di celle è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica che è essenziale per tutto il corpo. Assolvere i loro compiti, ogni tessuto o organo esprime una serie di geni correlati alle loro funzioni e comunica con altri tessuti orchestrare loro attività nel contesto dello sviluppo. Caratterizzare tali funzioni cellulari specializzate e interazioni tra organi, è necessario specificare un gruppo di celle insieme ad altri tipi di celle essendo mantenuta intatta nell&#39;architettura multicellulare. Un esempio di tali organi specializzati è un organo steroidea, dove molti enzimi biosintetici mediare le fasi di conversione di colesterolo ad ormoni steroidei attivi 1. La maggior parte di questi geni enzimatici sono specificamente espressi in organi steroidogenici, e via di biosintesi è strettamente regolata da numerosi stimoli esterni tramite ingressi umorali e ingressi neuronali. Una voltasintetizzati, ormoni steroidei sono secreti nel emolinfa e sono mirati a molti tessuti e organi per regolare l&#39;espressione di una varietà di geni 2. Pertanto, l&#39;azione di un ormone steroideo induce una risposta sistemica per mantenere l&#39;omeostasi, la crescita e la riproduzione. Per studiare le funzioni di steroidi biosintesi dell&#39;ormone e le azioni pleiotropici degli ormoni steroidei, Drosophila melanogaster può essere utilizzato come sistema modello adatto. Durante gli stadi larvali, l&#39;ormone steroide insetto, ecdysteroid, è biosynthesized in un organo endocrino specializzato chiamato ghiandola prothoracic (PG) 3. Nel PG, diversi enzimi catalizzano ecdysteroidogenic specificamente le molteplici fasi di conversione da colesterolo ecdysone, che controlla la muta e metamorfosi in opportuni stadi di sviluppo 4. Pertanto, un cambiamento dinamico nel titolo ecdysteroid è regolatada molte vie di segnalazione in risposta a stimoli ambientali. D&#39;altra parte, nella fase adulta, ecdysteroid svolge ruoli essenziali nella fisiologia, compresa la riproduzione, il sonno, la memoria, e durata della vita 5, 6, 7, 8. E &#39;noto che ecdysteroid attivamente biosynthesized nell&#39;ovaio, regolando la progressione dell&#39;oogenesi 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recentemente abbiamo riportato che il numero di cellule staminali germinali (GSC) è interessato da ecdysteroid e sesso segnalazione peptide in risposta a stimoli di accoppiamento 12. Potenti strumenti di D. melanogaster genetica e della biologia delle cellule, comprese le informazioni del genoma ben annotato-, gene binariosistemi di espressione, e tecniche transgeniche RNAi, hanno permesso di identificare geni essenziali per ecdysteroid biosintesi del PG e dell&#39;ovaio 13, 14, 15. Una volta che i geni ecdysteroidogenic sono identificati, la regolazione trascrizionale di questi geni e le localizzazioni dinamiche dei prodotti genici può essere esaminata in via di biosintesi 16. A tale scopo, quantitativa-trascrizione inversa-PCR, RNA ibridizzazione in situ, e l&#39;analisi immunoistochimica sono condotte. L&#39;applicazione di queste tecniche comprende un compito impegnativo; l&#39;elaborato dissezione del PG o l&#39;ovaio. In particolare, il PG della mosca della frutta è relativamente inferiore a quella di altri insetti (ad esempio, il baco da seta e la mosca colpo), quindi si ha la necessità di praticare la competenza fondamentale di frutta dissezione mosca per il campionamento. Inoltre, entrambi gli organi ecdysteroidogenic ricevono innervaziones dal sistema nervoso centrale (CNS) 17, 18, 19, 20. Così, per analisi anatomiche accurate, gli organi ecdysteroidogenic dovrebbero restare inalterate con lo SNC e altri organi, non rovinare le loro connessioni neuronali. Qui forniamo protocolli per la dissezione e la visualizzazione degli organi steroidogeniche in D. melanogaster. Imparare la tecnica di dissezione è il punto di partenza fondamentale per questi esperimenti. Inoltre, si possono etichettare correttamente gli organi steroidogenici così come i loro organi interattivi con numerosi anticorpi e linee conducente GAL4. Approfittando di queste tecniche, materiali e genetica, si possono studiare i meccanismi completi di steroidi biosintesi dell&#39;ormone.

<table><tbody><tr><td><forte>piatto per coltura di ovociti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> (<tr><td>55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&nbsp; per succo d'uva, piastre di agar,</td></tr><tr><td>tazza di raccolta</td>, pasta di lievito <td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>, lievito secco orientale, Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% succo d'uva</td>, <td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>larve <forti>allevamento</forti></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piccole fiale (12ml, 40&volte; 23,5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>anello monouso</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>cibo</td><td></td><td></td> per mosche standard<td>&nbsp; il recepi noi sul sito web del centro azionario di Blooington.</td></tr><tr><td>Microscopio dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissecting</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>piatto per coltura tissutale (35 x 10 mm, non trattato)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td> silicone <td>per coarting all'interno di piastre</td></tr><tr><td>Ago Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)&nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>Un "coltello" per tagliare la pinza per tessuti</td></tr><tr><td>, Inox, #5</td><td>Dumont, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perno per insetti (0,18 mm di diametro)</td><td>Marchio</td><td></td> Shiga per micro forbici per <td>dissezione del filetto</td></tr><tr><td></td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td><forte>fissazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acqua ultrapura</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato tamponato soluzione salina (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Nacalai tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Nacalai tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microprovette (1,5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>Incubation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one swist mixer TM-300 (rocker)</td><td>As one</td><td>TM-300</td><td></td></tr><tr><td>rocker Siero bovino Albumina</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Sro (cavia), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (coniglio), 1:1000</td><td>Molecular Probes</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa ans Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anti-GFP (mAb di topo, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anti-5HT (coniglio), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1 (topo)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anti-DE-caderina (ratto), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 (topo), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82<</td><td></td></tr><tr><td>strong>secondary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) IgG (H+L), Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo di capra, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-ratto di capra, Alexa Fluor 546 coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-porcellino d'India di capra, Alexa Fluor 555 coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 falloidina coniugata con colorante</td><td>Life Tecnologie</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti di montaggio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetro per vetrini Micro Matsunami</td><td>Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura per microscopio quadrato</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>C218181</tr><tr><td>Reagente FluorSave (Reagente di montaggio)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento 1 ml (Contagocce monouso)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Sistema di microscopio a scansione laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Axio Observer invertito. Z1 SP left</td></tr><tr><td>image processing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>Si tratta di una speciale interfaccia utente basata sul sistema operativo Microsoft Windows7 a 64 bit</td>ImageJFly stocksw;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&ndash; GFP; UAS&ndash; mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>doni da K. Ito, Università di Tokyo.</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>vedi in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)</td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&nbsp; dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)</td></tr></tbody></table>

protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; drosophila melanogaster</em

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Negli organismi multicellulari, un piccolo gruppo di cellule è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica, inducendo una risposta sistemica crescita e la riproduzione. Negli insetti, ghiandola larvale prothoracic (PG) e le femmine adulte azione ovaio ruoli essenziali biosynthesizing principali ormoni steroidei chiamati ecdysteroids. Questi organi ecdysteroidogenic sono innervati dal sistema nervoso, attraverso cui la temporizzazione della biosintesi è influenzato da stimoli ambientali. Qui si descrive un protocollo per la visualizzazione degli organi e dei loro organi ecdysteroidogenic interattivi in larve e adulti della mosca della frutta Drosophila melanogaster, che fornisce un sistema modello adatto per lo studio ormone steroide biosintesi e il suo meccanismo di regolazione. dissezione abile permette di mantenere le posizioni degli organi ecdysteroidogenic e dei loro organi interattivi compreso il cervello, il cordone nervoso ventrale, e altri tessuti. Immunocolorazione con unntibodies contro enzimi ecdysteroidogenic, insieme a proteine ​​transgeniche fluorescenza guidati dai promotori tessuto-specifici, sono disponibili per marcare le cellule ecdysteroidogenic. Inoltre, i innervazione degli organi ecdysteroidogenic possono anche essere etichettati da anticorpi specifici o una serie di driver GAL4 in vari tipi di neuroni. Pertanto, gli organi ecdysteroidogenic e le loro connessioni neuronali possono essere visualizzati simultaneamente mediante immunocolorazione e tecniche transgeniche. Infine, si descrive come visualizzare le cellule staminali germinali, la cui proliferazione e manutenzione sono controllate da ecdysteroids. Questo metodo contribuisce alla comprensione globale di steroide biosintesi dell&#39;ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.

Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per visualizzare gli organi steroidogenici e dei loro organi interattivi in D. melanogaster larve e adulti di sesso femminile. Lo schema generale di protocolli è mostrato in Figura 1. RG, compreso il PG (Figura 2D), è più piccolo e più trasparente del cervello e si trova sul lato antero-dorsale del cervello (Figura 2A-C e 3A-E). Per marcare le cellule PG, molti gruppi hanno generato vari tipi di anticorpi contro enzim...

Descriviamo un protocollo per la dissezione, la fissazione, e immunocolorazione di organi steroidogeniche in Drosophila larve e adulti femmine per studiare steroidi biosintesi dell&#39;ormone e del suo meccanismo di regolazione. Oltre agli organi steroidogenici, visualizziamo l&#39;innervazione degli organi steroidogeniche così come cellule bersaglio steroidogeniche come le cellule staminali germinali.

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare gli organi steroidogeni e i loro organi interagenti nelle larve o nelle femmine adulte del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster. Questo metodo può contribuire a comprendere la biosintesi degli ormoni steroidei negli insetti e il meccanismo regolatorio neuronale alla base dell'accoppiamento e della metamorfosi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'innervazione degli organi steroidogeni e la posizione relativa dei loro organi interagenti rimangono intatte.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché gli organi steroidogeni nei larve di mosca sono molto piccoli e trasparenti. Il mio laboratorio e io siamo lieti di condividere i nostri protocolli di dissezione. Cominciamo dunque.Dopo aver preparato le larve, iniziare la dissezione in una piastra di tre centimetri riempita con PBS, sotto un microscopio stereoscopico. In primo luogo, afferrare l'uncino boccale con una pinzetta. Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche, recidere il corpo a circa un terzo della lunghezza rispetto all'estremit&agrave; anteriore.Successivamente, tenere la lunghezza anteriore con

protocols-for-visualizing-steroidogenic-organs-their-interactive

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Biologia dello sviluppo

Come nicchie e le cellule staminali si formano durante lo sviluppo è una questione importante con implicazioni pratiche.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Un metodo per immunostain e visualizzare organi cordotonali in larve e delle...

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Questo video descrive la ghiandola ad anello di Drosophila, una complessa struttura endocrina importante per la biosintesi e la secrezione di ecdisteroidi e altri ormoni. Il protocollo presentato ne dimostra la dissezione, la fissazione e l'immunocolorazione.

Dissezione della ghiandola dell'anello larvale: isolamento degli organi endocrini in via di sviluppo da Drosophila

Questo video dimostra un protocollo dettagliato di immunocolorazione per visualizzare i difetti fenotipici nei corpi dei funghi dei cervelli mutanti di Drosophila. Il protocollo prevede l'utilizzo di anticorpi contro Fas2, una proteina coinvolta nella guida assonale che facilita il corretto sviluppo morfologico e funzionale del corpo del fungo.

Visualizzazione dei neuroni del corpo a fungo nel cervello di Drosophila tramite immunocolorazione

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Nel primo embrione di Drosophila , molti organelli sono mobili. In linea di principio, possono essere ripresi dal vivo tramite specifiche sonde fluorescenti, ma il guscio d'uovo impedisce l'applicazione diretta all'embrione. Questo protocollo descrive come introdurre tali sonde tramite microiniezione e quindi analizzare il movimento degli organelli di massa tramite velocimetria dell'immagine delle particelle .

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Impara a visualizzare gli organi steroidogenici e le loro interazioni in Drosophila melanogaster mediante dissezione, fissazione e immunocolorazione. Questo protocollo preserva l'innervazione per studiare la biosintesi degli ormoni steroidei.

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta

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