LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la proteomica shotgun per caratterizzare e quantificare i prodotti di deamidazione endogena della glutammina e dell'asparagina in proteomi complessi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biochimica, come l'influenza di un processore spontaneo e antimatico sul prodotto isometrico gluteo della glutammina e della deaminazione dell'asparagima. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli isomeri di deaminazione della glutammina sono separati su una colonna capillare a cambiamento ionico di lunga lunghezza, massimizzando la capacità di separare i peptidi dai punti isomatici.

Per iniziare la costruzione della colonna, sospendere 50 milligrammi di materiale di impaccamento a scambio anionico debole in 3,5 millilitri di isopropanolo al 90%, in acqua. Fissare il raccordo femmina a femmina, un microferal e un dado femmina a un'estremità di un tubo di picco lungo 50 centimetri con un diametro interno di 200 micrometri. Montare uno schermo da 1/16 di pollice con pori di un micrometro all'estremità del tubo all'interno del microferal.

Utilizzando la pompa a pressione impostata su 4, 500 psi, impacchettare lo scambio anionico nel capillare fino a quando il materiale è visibile nella parte superiore. Fissare un altro raccordo femmina-femmina, un dado microferino e femmina alla parte superiore del capillare impaccato all'estremità opposta per completare l'assemblaggio della colonna. Lavare da 50 a 100 milligrammi di tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato per cinque minuti.

Ripetere questo lavaggio due volte, quindi posizionare il fazzoletto lavato in tubi con tappi di sicurezza. Aggiungere a ciascun tubo un equivalente in peso di perle di acciaio inossidabile e 2,5 equivalenti in volume di una soluzione acquosa da 100 millimolari di acetato di ammonio con l'1% di desossicolato di sodio. Omogeneizzare il tessuto alla massima intensità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, centrifugare l'omogeneizzato per dieci minuti a 10.000 x g e quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 millilitri. Continuare a omogeneizzare e centrifugare il pellet di tessuto, combinando ogni volta i surnatanti fino a quando non si osserva alcun pellet.

Quantificare la concentrazione proteica nei surnatanti combinati con un saggio dell'acido bicinconinnico. Successivamente, aggiungere all'omogenato una soluzione monomolare di ditiotreitolo in acetato di ammonio 100 millimolare per ottenere una concentrazione di dieci millimolari di ditiotreitolo nel campione. Incubare l'omogeneizzato a bagnomaria a 60 gradi Celsius per trenta minuti.

Aggiungere all'omogeneizzato una soluzione monomolare di iodoacetamide in acetato di ammonio 100 millimolare per ottenere una concentrazione di iodoacetamide di 20 millimolari nel campione. Incubare l'omogeneizzato a temperatura ambiente in assenza di luce per 45 minuti. Quindi diluire l'omogenato con due equivalenti in volume di una soluzione da dieci millimolari di ditiotreitolo in acetato di ammonio da 100 millimolari.

Incubare l'omogeneizzato a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere all'omogeneizzato un volume sufficiente di tripsina modificata di grado sequenziale in acetato di ammonio da 100 millimolari per ottenere un rapporto enzimatico proteico da 1 a 50 in peso nel campione. Incubare il campione a 30 gradi Celsius durante la notte per digerire l'omogeneizzato.

Estinguere la digestione con lo 0,5% del peso del campione di acido formico, facendo precipitare i sali di sodio desossicolato. Agitare delicatamente i campioni contenenti sali SDC e quindi centrifugare i campioni per dieci minuti a 12.000 x g e quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante in un nuovo tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet di sali SDC.

Risciogliere i sali in una soluzione acquosa allo 0,5% in volume di idrossido di ammonio, agitando energicamente. Condizionare una cartuccia assorbente C-18 da un grammo con 5 millilitri di acetonitrile, seguita da cinque millilitri di acido trifluoroacetico allo 0,1% in acqua. Quindi, caricare il campione digerito sulla cartuccia.

Lavare i campioni da tre a cinque volte con porzioni da cinque millilitri di TFA allo 0,1%. Quindi diluire i peptidi con cinque millilitri di una soluzione acquosa di acetonitrile al 75% e acido formico allo 0,1%. Asciugare il fluido in un concentratore sottovuoto.

Aggiungere al residuo 200 microlitri di acetonitrile al 75%, con acido formico allo 0,1%. Agitare la miscela per almeno dieci minuti, quindi sonicare la miscela per almeno 30 minuti per ricostituire i peptidi secchi. Diluire il campione secondo necessità, in modo che il campione iniettato contenga da uno a tre microgrammi di proteine.

Collegare la colonna capillare LAX a uno strumento per cromatografia liquida ad altissima pressione. Preparare soluzioni di acido formico allo 0,1% in acqua e acetonitrile. Impostare la portata su 0,4 microlitri al minuto e impostare una corsa in pendenza di 1.200 minuti.

Configura gli eventi di scansione dello spettrometro di massa per alternare l'acquisizione dei dati, tra la spettrometria di massa a trasformata di Fourier completa e la spettrometria di massa tandem a trasformata di Fourier. Eseguire LERLIC MS/MS per separare e caratterizzare i peptidi. Utilizzare i dati risultanti e il software proteomico per eseguire una ricerca nel database delle proteine.

Esporta i risultati della ricerca nel database in un software per fogli di calcolo. Identificare ed estrarre l'elenco dei peptidi deamidati e dei corrispondenti peptidi non deamidati. Estrarre i cromatogrammi ionici di ciascuno di questi peptidi con cinque parti per milione di tolleranza di massa.

Ispezionare i cromatogrammi ionici estratti per verificare la presenza di illusioni separate a doppio picco dei prodotti isomeri. Utilizzando LERLIC MS/MS, le isoforme deamidate di glutammina e asparagina sono state separate e identificate da un campione proteico in due diversi tempi di ritenzione. Sono stati identificati residui intermedi di glutammina enzimaticamente modificati della transammidazione che mostrano un rapporto gamma alfa glutamil invertito.

Con questo metodo è stato identificato anche l'intermedio succinimide nei residui di asparagina. Poiché le condizioni di lavorazione del campione leggermente acide stabilizzano l'intermedio succinimide. Ciò suggerisce che la tecnica LERLIC MS/MS può essere applicata allo studio del proteoma su larga scala degli intermedi succinimide.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in biochimica per caratterizzare la deamidazione delle proteine in contesti che vanno dall'archeologia alla ricerca biomedica.