LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare la proteomica shotgun per caratterizzare e quantificare i prodotti di deamidazione endogeni della glutammina e dell'asparagina in proteomi complessi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biochimica, come l'influenza di processi spontanei e non enzimatici sui prodotti isomerici della deamidazione di glutammina e asparagina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli isomeri di deamidazione della glutammina vengono separati su una colonna capillare a scambio ionico di lunga lunghezza, massimizzando la capacità di separare i peptidi in base ai loro punti isoelettrici.

Per iniziare la costruzione della colonna, sospendere 50 milligrammi di materiale di riempimento a scambio anionico debole in 3,5 millilitri di isopropanolo al 90% in acqua. Fissare un raccordo femmina-femmina, un microferal e un dado femmina a un'estremità di un tratto di tubo peak lungo 50 centimetri con un diametro interno di 200 micrometri. Inserire un setaccio da 1/16 di pollice con pori di un micrometro all'estremità del tubo all'interno del microferal.

Utilizzando una pompa a pressione impostata a 4 500 psi, inserire lo scambiatore anionico nel capillare fino a quando il materiale non diventa visibile nella parte superiore. Collegare un altro raccordo femmina-femmina, microferale e dado femmina alla sommità del capillare riempito, all'estremità opposta, per completare l'assemblaggio della colonna. Lavare da 50 a 100 milligrammi di tessuto con soluzione salina tamponata al fosfato per cinque minuti.

Ripetere questo lavaggio due volte, quindi posizionare il tessuto lavato in provette con tappi di sicurezza. Aggiungere a ciascuna provetta un equivalente in peso di sfere di acciaio inossidabile e 2,5 equivalenti in volume di una soluzione acquosa di acetato di ammonio 100 millimolari con il 1% di deossicolato di sodio. Omogeneizzare il tessuto alla massima intensità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, centrifugare l'omogenato per dieci minuti a 10.000 x g e a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in una provetta da 1,5 millilitri. Continuare a omogeneizzare e centrifugare il pellet tissutale, combinando i soprannatanti ogni volta fino a quando non si osserva alcun pellet.

Quantificare la concentrazione proteica nei supernatanti combinati mediante un saggio con acido bicinconico. Successivamente, aggiungere all'omogenato una soluzione monomolare di ditiotreitolo in acetato di ammonio 100 millimolare per raggiungere una concentrazione di ditiotreitolo di 10 millimolare nel campione. Incubare l'omogenato in un bagno termico a 60 gradi Celsius per trenta minuti.

Aggiungere all'omogenato una soluzione monomolare di iodacetamide in acetato di ammonio 100 millimolari per ottenere una concentrazione di iodacetamide pari a 20 millimolari nel campione. Incubare l'omogenato a temperatura ambiente in assenza di luce per 45 minuti. Successivamente, diluire l'omogenato con due volumi equivalenti di una soluzione di ditiotreitolo 10 millimolari in acetato di ammonio 100 millimolari.

Incubare l'omogenato a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere all'omogenato un volume sufficiente di tripsina modificata di grado sequenza in acetato di ammonio 100 millimolari per ottenere un rapporto proteina enzima di 1 a 50 in peso nel campione. Incubare il campione a 30 gradi Celsius per tutta la notte per digerire l'omogenato.

Interrompere la digestione aggiungendo lo 0,5% del peso del campione di acido formico, precipitando così i sali di sodio deossicolato. Vortexare delicatamente i campioni contenenti sali di SDC, quindi centrifugare i campioni per dieci minuti a 12.000 x g e a quattro gradi Celsius. Decantare il soprannatante in un nuovo tubo, avendo cura di non disturbare il pellet di sali di SDC.

Risciogliere i sali in una soluzione acquosa all'0,5% in volume di idrossido di ammonio, agitando vigorosamente mediante vortex. Condizionare una cartuccia con 1 g di fase C-18 con 5 millilitri di acetonitrile, seguiti da 5 millilitri di acido trifluoroacetico 0,1% in acqua. Successivamente, caricare il campione digerito sulla cartuccia.

Lavare i campioni da tre a cinque volte con porzioni di cinque millilitri di TFA 0,1%. Successivamente, diluire i peptidi con cinque millilitri di una soluzione acquosa contenente acetonitrile al 75% e acido formico 0,1%. Essiccare il liquido in un concentratore sotto vuoto.

Aggiungere 200 microlitri di acetonitrile al 75%, con 0,1% di acido formico, al residuo. Vortexare la miscela per almeno dieci minuti, quindi sottoporre a sonicazione la miscela per almeno 30 minuti per ricostituire i peptidi secchi. Diluire il campione secondo necessità, in modo che il campione iniettato contenga da uno a tre microgrammi di proteina.

Collegare la colonna capillare LAX a uno strumento di cromatografia liquida ad alta pressione. Preparare soluzioni di acido formico 0,1% in acqua e acetonitrile. Impostare la portata a 0,4 microlitri al minuto e configurare una corsa in gradiente di 1.200 minuti.

Configurare gli eventi di scansione dello spettrometro di massa in modo da alternare l'acquisizione dei dati tra spettrometria di massa a trasformata di Fourier completa e spettrometria di massa in tandem a trasformata di Fourier. Eseguire la LERLIC MS/MS per separare e caratterizzare i peptidi. Utilizzare i dati ottenuti e un software proteomico per effettuare una ricerca in un database di proteine.

Esportare i risultati della ricerca nel database in un software per fogli di calcolo. Identificare ed estrarre l'elenco dei peptidi deamidati e dei corrispondenti peptidi non deamidati. Estrarre i cromatogrammi ionici di ciascuno di questi peptidi con una tolleranza di massa di cinque parti per milione.

Esaminare i cromatogrammi degli ioni estratti per verificare l'illusione di un doppio picco separato dovuta a prodotti isomerici. Utilizzando la spettrometria di massa LERLIC in modalità MS/MS, gli isoformi deamidati di glutammina e asparagina sono stati separati e identificati da un campione proteico a due differenti tempi di ritenzione. Sono stati identificati residui intermedi di glutammina modificati enzimaticamente nel processo di transamidazione, che mostrano un rapporto gamma-alfa glutamilico invertito.

Il composto intermedio succinimmide nei residui di asparagina è stato identificato anche mediante questo metodo. Poiché le condizioni leggermente acide di lavorazione del campione stabilizzano l'intermedio succinimmide, ciò suggerisce che la tecnica LERLIC MS/MS può essere applicata allo studio su scala proteomica degli intermedi succinimmide.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in campo biochimico per caratterizzare la deamidazione delle proteine in contesti che vanno dall'archeologia alla ricerca biomedica.