Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l'attività di rete su array Micro-elettrodo
8 gennaio 2017
Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.
L'obiettivo generale di questo protocollo di differenziamento neuronale è quello di generare reti neuronali dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo che crescono su array di microelettrodi in modo rapido e controllato. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare domande chiave nei campi delle neuroscienze. Può essere utilizzato per studiare i meccanismi biologici alla base dei disturbi neurologici, ma può anche essere utilizzato per affrontare questioni neurobiologiche più fondamentali.
Il vantaggio principale di questa tecnica è la rapida differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni in modo controllato. Il primo giorno, scaldare DMEM/F12, CDS ed E8 con l'1% di penicillina streptomicina a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere la doxiciclina al terreno E8 per ottenere una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro e quindi aggiungere l'inibitore della roccia alla miscela.
Aspirare il terreno di coltura delle RTTANGN2 hiPSC positive e aggiungere un millilitro di CDS alle cellule. Successivamente, incubare le cellule per tre-cinque minuti in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius. Al microscopio, controlla se le cellule si stanno staccando l'una dall'altra.
Quindi, aggiungere due millilitri di DMEM/F12 nel pozzetto. Sospendere delicatamente le cellule con una pipetta da 1.000 microlitri e trasferirle in una provetta da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere sette millilitri di DMEM/F12 alla sospensione cellulare e far girare le cellule a 200 x g per cinque minuti.
Dopo cinque minuti, aspirare il surnatante e aggiungere due millilitri del terreno E8 preparato. Dissociare le hiPSC mettendo la punta di una pipetta da 1.000 microlitri contro il lato della provetta da 15 millilitri e risospendendo delicatamente le cellule. Al microscopio, controlla se le cellule sono dissociate.
Quindi, determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro. Per i sei MEA a pozzetti, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di 7,5 volte 10 per la quinta cellula per millilitro. Per i vetrini, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di quattro volte 10 per la quarta cella per millilitro.
Aspirare la laminina diluita dai vetrini coprioggetti e dai sei pozzetti MEA. Per i sei pozzetti MEA, piastrate le celle aggiungendo 100 microlitri di sospensione cellulare all'area dell'elettrodo attivo in ciascun pozzetto. Quindi piastrate le cellule aggiungendo 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.
Quindi, posizionare i sei pozzetti MEA o la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius. Dopo due ore, aggiungere con cautela 500 microlitri del terreno E8 preparato a ciascun pozzetto dei sei MEA pozzetti. Successivamente, posizionare i sei MEA per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.
Il terzo giorno, scaldare lo 0,05% di tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Caldo DPBS e DMEM/F12 con 1% di penicillina streptomicina a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare il mezzo esaurito della coltura di astrociti di ratto.
Lavare la coltura aggiungendo cinque millilitri di DPBS e agitarla delicatamente. Successivamente, aspirare DPBS e aggiungere cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05%. Agitare delicatamente la tripsina-EDTA.
Quindi incubare le cellule in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Successivamente, controllare al microscopio per verificare se le cellule sono staccate. Stacca le ultime celle colpendo il pallone alcune volte.
Quindi, aggiungere cinque millilitri di DMEM/F12 al pallone. Provare a valutare delicatamente le cellule all'interno del pallone con una pipetta da 10 millilitri. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.
Centrifugare il tubo a 200 x g per otto minuti. Successivamente, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un millilitro di DMEM/F12. Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro.
Quindi, aggiungi 7,5 volte 10 ai quarti astrociti a ciascun pozzetto dei sei MEA del pozzetto. E aggiungi due volte 10 al quarto astrocito a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.
Acquisisci i dati a 1.200 volte l'amplificazione e campiona il segnale a 10 kilohertz utilizzando la scheda di acquisizione dati MCS. Registrare 20 minuti di attività elettrofisiologica di neuroni derivati da hiPSC coltivati su MEA. Durante la registrazione, mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius e prevenire l'evaporazione del fluido e le variazioni di pH erogando un flusso lento e costante di gas umidificato sui MEA.
Successivamente, analizza i dati utilizzando un pacchetto software personalizzato. Questa figura mostra i cambiamenti di espressione dei marcatori neuronali MAP2 nella sinapsina durante il processo di differenziazione, che indica la maturazione neuronale. Questo grafico mostra che l'espressione della sinapsina viene misurata per le singole cellule aumentate durante il processo di differenziazione.
La sinapsina che viene espressa nelle cellule dopo tre settimane di differenziazione è co-localizzata con PSD-95, indicando la presenza di sinapsi funzionali. Qui, il patch clamp dell'intera cellula è stato eseguito in diversi punti temporali durante il processo di differenziazione per misurare l'attività elettrofisiologica delle cellule. Le cellule sono state in grado di generare potenziali d'azione nei diversi punti temporali.
E la percentuale di cellule spiking aumentata nel tempo mostra che la maggior parte delle cellule è in grado di generare potenziali d'azione, anche nella fase iniziale della differenziazione. Il patch clamp è stato utilizzato anche per misurare le correnti postsinaptiche eccitatorie ricevute dalle cellule. Il numero di input che le cellule ricevono aumenta durante il processo di differenziazione.
Sia la frequenza che l'ampiezza delle correnti eccitatorie postsinaptiche sono aumentate durante il processo di differenziazione. L'attività elettrofisiologica delle cellule differenziate su array di microelettrodi è stata misurata durante il processo di differenziazione. Qui, l'attività della rete neuronale è aumentata durante il processo di differenziazione e ha mostrato eventi sincroni dopo 23 giorni.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte in reti neuronali funzionali entro tre o quattro settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in modo sterile e trattare le cellule con delicatezza. Seguendo questa procedura, altri metodi come i test farmacologici possono essere utilizzati per salvare il fenotipo, osservato nelle linee cellulari dei pazienti.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per studiare ufficialmente i difetti dell'attività di rete nei disturbi neurologici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare, indurre cellule staminali pluripotenti in neuroni in modo rapido e controllato.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo modificato per la rapida differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) in neuroni corticali eccitatori. Il metodo consente un controllo della densità cellulare neuronale ed è compatibile con array di microelettrodi per la misurazione delle proprietà elettrofisiologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia delle cellule staminali
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) possono differenziarsi in vari tipi neuronali.
- Comprendere le reti neuronali è fondamentale per lo studio dei disturbi neurologici.
- Gli array microelettrodici (MEAs) facilitano la misurazione dell'attività neuronale.
- I protocolli di differenziamento rapido migliorano l'efficienza della ricerca.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per generare reti neuronali da iPSC umane.
- Permettere lo studio dei meccanismi neurobiologici e dei disturbi neurologici.
- Fornire un protocollo che mantenga il controllo sulla densità cellulare.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di mezzi di coltura e tecniche di dissociazione cellulare.
- Piastreggiamento di hiPSC su array microelettrodi.
- Monitoraggio di marcatori di differenziamento e maturazione neuronale.
- Registrazioni elettrofisiologiche per valutare l'attività neuronale.
Risultati principali
- Differenziazione riuscita di iPSC umane in neuroni funzionali.
- Aumento dell'espressione dei marcatori neuronali durante la differenziazione.
- Dimostrazione di potenziali d'azione e attività sinaptica nei neuroni differenziati.
- L'attività della rete neuronale è aumentata nel tempo, indicando una maturazione.
Conclusioni
- Il protocollo modificato consente una generazione efficiente di reti neuronali.
- Questa tecnica può essere applicata per studiare diverse domande neurobiologiche.
- È fondamentale mantenere condizioni sterili e un trattamento delicato per il successo dell'esperimento.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una differenziazione rapida e controllata delle hiPSC in reti neuronali funzionali risolve un collo di bottiglia critico nella scoperta di farmaci focalizzata sulla neurobiologia. Questo protocollo consente la generazione riproducibile di neuroni umani maturi ed eccitatori, adatti a saggi elettrofisiologici ad alto contenuto informativo, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella ricerca precoce sui disturbi neurologici. L'approccio migliora le decisioni di portafoglio fornendo modelli umani scalabili e pertinenti alla malattia, utili per analisi meccanicistiche e farmacologiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi di meccanismi neuronali rilevanti per le malattie utilizzando neuroni eccitatori derivati da cellule umane.
- Consente la validazione funzionale delle target misurando risposte elettrofisiologiche a livello di rete.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico grazie a popolazioni neuronali omogenee e controllate.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella selezione e nel triage di target neurologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce colture neuronali standardizzate e riproducibili per lo screening di composti successivi.
- Fornisce letture elettrofisiologiche quantitative mediante matrici di microelettrodi.
- Permette la scalabilità del saggio e la confrontabilità tra studi grazie al controllo esplicito della densità cellulare.
- Consente una valutazione affidabile di interventi farmacologici in reti neuronali umane.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea l'attività delle reti neuronali in vitro a parametri funzionali rilevanti per la malattia.
- Colma il divario tra scoperta e validazione preclinica consentendo studi meccanicistici su linee cellulari derivate da pazienti.
- Riduce il rischio di traduzione clinica modellando disfunzioni delle reti neuronali umane osservate nei disturbi neurologici.
- Favorisce la scoperta di biomarcatori attraverso misurazioni elettrofisiologiche longitudinali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la rapida generazione di reti neuronali umane funzionali per la validazione di bersagli, lo screening e studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi in sistemi neuronali umani.
- Screening: Fornisce colture neuronali pronte per i saggi, riproducibili, con output quantitativi dell'attività della rete.
- Analisi: Fornisce misurazioni elettrofisiologiche e analisi statistiche per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro ai meccanismi delle malattie e ai potenziali biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile e riutilizzabile per diversi programmi di ricerca neurologica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli neurologici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi neuronali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza del capitale consentendo la generazione di dati solidi in fase precoce.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di programmi per disturbi neurologici con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ambito della coltura di cellule staminali, della differenziazione neuronale e dell'analisi elettrofisiologica.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per microarray a elettrodi e a software personalizzati per l'analisi dei dati.
- Richiede una rigorosa standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la densità cellulare e i protocolli di differenziazione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse linee di hiPSC o modelli di malattia.
- I limiti includono la necessità di tecniche sterili e di un manipolazione delicata delle cellule per garantire la riproducibilità.
