Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l'attività di rete su array Micro-elettrodo

L'obiettivo generale di questo protocollo di differenziamento neuronale è quello di generare reti neuronali dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo che crescono su array di microelettrodi in modo rapido e controllato. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare domande chiave nei campi delle neuroscienze. Può essere utilizzato per studiare i meccanismi biologici alla base dei disturbi neurologici, ma può anche essere utilizzato per affrontare questioni neurobiologiche più fondamentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è la rapida differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni in modo controllato. Il primo giorno, scaldare DMEM/F12, CDS ed E8 con l'1% di penicillina streptomicina a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere la doxiciclina al terreno E8 per ottenere una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro e quindi aggiungere l'inibitore della roccia alla miscela.

Aspirare il terreno di coltura delle RTTANGN2 hiPSC positive e aggiungere un millilitro di CDS alle cellule. Successivamente, incubare le cellule per tre-cinque minuti in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius. Al microscopio, controlla se le cellule si stanno staccando l'una dall'altra.

Quindi, aggiungere due millilitri di DMEM/F12 nel pozzetto. Sospendere delicatamente le cellule con una pipetta da 1.000 microlitri e trasferirle in una provetta da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere sette millilitri di DMEM/F12 alla sospensione cellulare e far girare le cellule a 200 x g per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, aspirare il surnatante e aggiungere due millilitri del terreno E8 preparato. Dissociare le hiPSC mettendo la punta di una pipetta da 1.000 microlitri contro il lato della provetta da 15 millilitri e risospendendo delicatamente le cellule. Al microscopio, controlla se le cellule sono dissociate.

Quindi, determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro. Per i sei MEA a pozzetti, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di 7,5 volte 10 per la quinta cellula per millilitro. Per i vetrini, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di quattro volte 10 per la quarta cella per millilitro.

Aspirare la laminina diluita dai vetrini coprioggetti e dai sei pozzetti MEA. Per i sei pozzetti MEA, piastrate le celle aggiungendo 100 microlitri di sospensione cellulare all'area dell'elettrodo attivo in ciascun pozzetto. Quindi piastrate le cellule aggiungendo 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.

Quindi, posizionare i sei pozzetti MEA o la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius. Dopo due ore, aggiungere con cautela 500 microlitri del terreno E8 preparato a ciascun pozzetto dei sei MEA pozzetti. Successivamente, posizionare i sei MEA per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.

Il terzo giorno, scaldare lo 0,05% di tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Caldo DPBS e DMEM/F12 con 1% di penicillina streptomicina a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare il mezzo esaurito della coltura di astrociti di ratto.

Lavare la coltura aggiungendo cinque millilitri di DPBS e agitarla delicatamente. Successivamente, aspirare DPBS e aggiungere cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05%. Agitare delicatamente la tripsina-EDTA.

Quindi incubare le cellule in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Successivamente, controllare al microscopio per verificare se le cellule sono staccate. Stacca le ultime celle colpendo il pallone alcune volte.

Quindi, aggiungere cinque millilitri di DMEM/F12 al pallone. Provare a valutare delicatamente le cellule all'interno del pallone con una pipetta da 10 millilitri. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Centrifugare il tubo a 200 x g per otto minuti. Successivamente, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un millilitro di DMEM/F12. Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro.

Quindi, aggiungi 7,5 volte 10 ai quarti astrociti a ciascun pozzetto dei sei MEA del pozzetto. E aggiungi due volte 10 al quarto astrocito a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.

Acquisisci i dati a 1.200 volte l'amplificazione e campiona il segnale a 10 kilohertz utilizzando la scheda di acquisizione dati MCS. Registrare 20 minuti di attività elettrofisiologica di neuroni derivati da hiPSC coltivati su MEA. Durante la registrazione, mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius e prevenire l'evaporazione del fluido e le variazioni di pH erogando un flusso lento e costante di gas umidificato sui MEA.

Successivamente, analizza i dati utilizzando un pacchetto software personalizzato. Questa figura mostra i cambiamenti di espressione dei marcatori neuronali MAP2 nella sinapsina durante il processo di differenziazione, che indica la maturazione neuronale. Questo grafico mostra che l'espressione della sinapsina viene misurata per le singole cellule aumentate durante il processo di differenziazione.

La sinapsina che viene espressa nelle cellule dopo tre settimane di differenziazione è co-localizzata con PSD-95, indicando la presenza di sinapsi funzionali. Qui, il patch clamp dell'intera cellula è stato eseguito in diversi punti temporali durante il processo di differenziazione per misurare l'attività elettrofisiologica delle cellule. Le cellule sono state in grado di generare potenziali d'azione nei diversi punti temporali.

E la percentuale di cellule spiking aumentata nel tempo mostra che la maggior parte delle cellule è in grado di generare potenziali d'azione, anche nella fase iniziale della differenziazione. Il patch clamp è stato utilizzato anche per misurare le correnti postsinaptiche eccitatorie ricevute dalle cellule. Il numero di input che le cellule ricevono aumenta durante il processo di differenziazione.

Sia la frequenza che l'ampiezza delle correnti eccitatorie postsinaptiche sono aumentate durante il processo di differenziazione. L'attività elettrofisiologica delle cellule differenziate su array di microelettrodi è stata misurata durante il processo di differenziazione. Qui, l'attività della rete neuronale è aumentata durante il processo di differenziazione e ha mostrato eventi sincroni dopo 23 giorni.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte in reti neuronali funzionali entro tre o quattro settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in modo sterile e trattare le cellule con delicatezza. Seguendo questa procedura, altri metodi come i test farmacologici possono essere utilizzati per salvare il fenotipo, osservato nelle linee cellulari dei pazienti.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per studiare ufficialmente i difetti dell'attività di rete nei disturbi neurologici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare, indurre cellule staminali pluripotenti in neuroni in modo rapido e controllato.