Name: Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare lattività di rete su array Micro-elettrodo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri la differenziazione rapida di cellule staminali pluripotenti indotte umane in neuroni corticali eccitatori. Questo metodo controllato utilizza array micro-elettrodo per misurare l'attività elettrofisiologica e lo sviluppo delle reti neuronali.

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Gli autori ringraziano Jessica Classen per aver eseguito gli esperimenti di patch-clamp su cellule intere. Le hiPSC utilizzate nei nostri esperimenti sono state gentilmente fornite da Huiqing Zhou e Willem van den Akker dell'Università Radboud di Nijmegen. I vettori di trasferimento utilizzati in questo protocollo sono stati gentilmente forniti da Oliver Brüstle, Philipp Koch e Julia Ladewig del Centro Medico dell'Università di Bonn.

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<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo implementato un efficiente protocollo hiPSC-differenziazione pubblicato da Zhang et al. (2013) 12 per la misurazione della attività di rete delle reti neuronali hiPSC-derivati su MEA. Abbiamo adattato il protocollo originale con la creazione di una linea hiPSC -positivo rtTA / Ngn2 prima di indurre la differenziazione neuronale. Questo ulteriore passo ci permette di controllare la densità delle cellule neuronali sul MEA. Il controllo della densità neuronale è stato un importante pre-requisito per adattare il protocollo di MEA e per garantire la coerenza. Per misurare l&#39;attività delle reti neuronali con MEA, i neuroni devono formare reti dense direttamente sulla parte superiore degli elettrodi MEA 17,18. Ciò richiede necessariamente uno stretto controllo sulla densità di placcatura dei neuroni. La linea hiPSC -positivo rtTA / Ngn2 consente il controllo della densità neuronale perché questa tattica non si basa su trasduzione lentivirali acuti di hiPSCs prima di differenziazione;la linea -positive hiPSC rtTA / Ngn2 quindi elimina quasi qualsiasi variazione della resa finale a causa, per esempio, la tossicità lentivirale ed efficienza dell&#39;infezione variabile. Un altro punto critico della procedura sperimentale è il numero degli astrociti di ratto che sono co-coltivate con le hiPSCs differenziazione. Gli astrociti contribuiscano attivamente al perfezionamento di sviluppare circuiti neurali controllando la formazione delle sinapsi, la manutenzione, e l&#39;eliminazione, che sono tutti processi importanti per il funzionamento neuronale. Il protocollo presentato in questo documento è fortemente astrociti-dipendente: a piena maturità e formano sinapsi funzionali, i neuroni richiedono il supporto dagli astrociti. Abbiamo sperimentato che il numero di astrociti dovrebbe essere all&#39;incirca uguale al numero di neuroni hiPSC derivati ​​per sostenere la maturazione dei neuroni e la formazione di reti neuronali che presentano attività spontanea. Dal momento che il nostro protocollo astrociti rendimenti cul cellula primariature con una durata di vita limitata, l&#39;isolamento degli astrociti di ratto deve essere eseguita regolarmente. Il nostro adattamento del protocollo pubblicato da Zhang et al. (2013) 12 per l&#39;utilizzo con la tecnologia MEA sarà probabilmente migliorare significativamente la nostra capacità di studiare l&#39;attività di rete delle reti hiPSC-derivati. In precedenza, i protocolli utilizzati per lo studio di reti neuronali hiPSC-derivati con MEA affidamento sulle procedure di differenziazione in termini di tempo 13-16. Il protocollo da Zhang et al. (2013) fornisce una rapida alternativa, e la nostra modifica rimuove una fonte di variabilità, che rende ora più possibile l&#39;uso neuroni hiPSC-derivati ​​in combinazione con la tecnologia MEA, soprattutto in alta produttività o studi farmacologici. Inoltre, poiché il metodo pubblicato da Zhang et al. (2013) 12 produce una popolazione omogenea di livello superiore neuroni corticali, il nostro protocollo adattato rende possibili studi mirati in rete unctivity di questo particolare sottoinsieme neuronale. Tuttavia, questo approccio ha anche diversi limiti. In primo luogo, l&#39;omogeneità delle culture può anche essere considerato uno svantaggio, perché le culture sono meno probabilità di assomigliare in reti vivo, dove diverse classi di neuroni (cioè neuroni inibitori ed eccitatori) costituiscono una rete eterogenea. Per migliorare ulteriormente l&#39;uso dei neuroni hiPSC-derivati ​​con tecnologia MEA, sarà importante sviluppare protocolli di differenziazione (transgene) basato rapidi per altre popolazioni di cellule neuronali. Se i protocolli saranno disponibili, le reti in vitro sarebbero imitare più da vicino le reti in vivo. In secondo luogo, attualmente astrociti di ratto devono essere aggiunti ai neuroni hiPSC-derivati per sostenere la crescita, e quindi la rete neuronale risultante non è un neuronale stricto sensu rete umana. protocolli affidabili per differenziare hiPSCs in astrociti potrebbero in futuro solve questo problema 26. Terzo, le reti neuronali bidimensionali, come descritto qui, sono un modello limitato per lo studio in vivo complesse reti neuronali tridimensionali. Fortunatamente, protocolli descrivono culture tridimensionali di neuroni primari di ratto in combinazione con la tecnologia MEA sono già disponibili 27,28. In prospettiva, la combinazione di protocolli di differenziazione rapidi per l&#39;ottenimento di neuroni e astrociti hiPSC-derivati ​​con tecniche di coltura tridimensionale e la tecnologia MEA dovrebbe fornire una visione nuova dei meccanismi biologici sottostanti disturbi neurologici.

Lo sviluppo di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) protocolli di differenziazione per generare neuroni umani in vitro ha fornito un nuovo e potente strumento per lo studio delle malattie neurologiche. Fino a poco tempo, lo studio di questi disturbi è stato gravemente ostacolato dalla mancanza di sistemi modello utilizzando neuroni umani. Sebbene roditori possono essere utilizzati per studiare i disturbi neurologici, i risultati di tali studi non possono essere tradotti facilmente agli esseri umani 1. Date queste limitazioni, neuroni hiPSC derivati sono un modello alternativo promettente che può essere utilizzato per chiarire i meccanismi molecolari disturbi neurologici sottostanti e in vitro screening di farmaci. Negli ultimi dieci anni, diversi protocolli per convertire hiPSCs in neuroni sono stati sviluppati 2-8. Tuttavia, questi protocolli sono ancora limitate in molti modi. In primo luogo, i protocolli sono spesso in termini di tempo: la generazione di neuroni con un&#39;adeguata maturazione (es synapformazione SE) e l&#39;attività funzionale richiede mesi di procedure di coltura, che rende gli studi su larga scala difficili 9. Inoltre, hiPSC-to-neurone efficienza di conversione è bassa. Protocolli spesso producono una popolazione eterogenea di neuroni, e quindi non consentono di studi specifici sottoinsiemi di cellule neuronali. Inoltre, i protocolli non sono riproducibili, ottenendo risultati diversi per le diverse linee IPSC 10,11. Infine, la fase di maturazione e proprietà funzionali dei neuroni risultanti sono variabili 10. Per affrontare questi problemi, Zhang et al. (2013) 12 ha sviluppato un protocollo che rapidamente e riproducibile genera neuroni umani da hiPSCs dalla iperespressione del fattore di trascrizione neurogenina-2. Come riportato dagli autori, la differenziazione si verifica in tempi relativamente brevi (solo 2 - 3 settimane dopo l&#39;induzione dell&#39;espressione di neurogenina-2), il protocollo è riproducibile (le proprietà neuronali sono indipendenti dalle starting linea hiPSC), e la conversione hiPSC-to-neurone è molto efficace (quasi il 100%). La popolazione di neuroni generati con il loro protocollo è omogeneo (simile livello superiore neuroni corticali), che consente l&#39;indagine di cellule di tipo contributi specifici per i disturbi neuronali. Inoltre, i loro neuroni hiPSC-derivati hanno mostrato proprietà maturi (ad esempio, la capacità di formare sinapsi e robusta attività funzionale) dopo solo 20 d. Che caratterizzano le proprietà elettrofisiologiche di neuroni hiPSC derivati ​​a livello di rete è un requisito importante prima tecnologia hiPSC può essere sfruttata per lo studio di malattie umane. Per questo motivo, molti gruppi di ricerca hanno recentemente iniziato a studiare i neuroni cellule staminali derivate a livello di rete che utilizza la matrice di micro-elettrodi (MEA) dispositivi (multicanale Systems, Reutlingen, Germania) 13-16. Gli elettrodi di un MEA sono incorporati in un substrato su cui le cellule neuronali possono essere coltivate.MEA possono essere usati per esplorare le proprietà elettrofisiologiche delle reti neuronali e lo sviluppo in vitro della loro attività. Attualmente, MEA vengono utilizzati solo in combinazione con i protocolli di differenziazione che richiedono diversi mesi per produrre reti maturi. Quindi, combinando MEA con un protocollo di differenziazione rapida dovrebbe facilitare l&#39;uso di questa tecnologia in studi su larga scala di disturbi neurologici. Qui, presentiamo una modifica del Zhang et al. (2013) 12 del protocollo e adattarlo per l&#39;uso su MEA. In particolare, piuttosto che basarsi su una trasduzione lentivirale acuta, abbiamo invece creato linee hiPSC esprimono stabilmente rtTA / Ngn2 prima di indurre la differenziazione. Abbiamo fatto questo principalmente per avere il controllo riproducibile sulla densità cellulare neuronale, poiché la densità delle cellule neuronali è critica per la formazione della rete neuronale, e per un buon contatto tra i neuroni e gli elettrodi del MEA 17,18. although Zhang et al. protocollo è molto efficiente rispetto alla conversione del hiPSCs trasdotte, è intrinsecamente variabile rispetto alla resa finale dei neuroni dal numero di hiPSCs placcati inizialmente (vedere Figura 2E in Zhang et al.) 12. Con una linea stabile, si eliminano molti problemi che causano variabilità, quali la tossicità lentivirali e l&#39;efficienza di infezione. Abbiamo quindi ottimizzato i parametri che producono in modo affidabile le reti neuronali hiPSC-derivati su MEA, ottenendo la maturazione di rete (ad esempio, gli eventi sincroni che coinvolgono la maggioranza dei canali) per la terza settimana. Questo protocollo rapido ed affidabile dovrebbe consentire un confronto diretto tra i neuroni derivati da diverse linee hiPSC (cioè paziente-specifici), nonché garantire la coerenza robusto per studi farmacologici.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz's L-15 medio</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplemento</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (siero fetale bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &; filtro per cellule</td><td>m BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 vettore di imballaggio lentivirale</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vettore di packaging lentivirale</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di membrana basale</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per il distacco cellulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 medio</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>inibitore ROCK</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>In alternativa, possono essere utilizzati inibitori ROCK come la tiazovicina.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6-well MEAs</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 integratore</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, ricombinante</td> <td>umanoPromochina</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, ricombinante umano</td><td>Promochina</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-arabinofuranoside&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinza dritta a punta fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla a punta fine&nbsp;</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array micro-elettrodo

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

I neuroni derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) forniscono un nuovo strumento promettente per lo studio disturbi neurologici. Negli ultimi dieci anni, sono stati sviluppati molti protocolli per differenziare hiPSCs in neuroni. Tuttavia, questi protocolli sono spesso lenti con elevata variabilità, bassa riproducibilità, e bassa efficienza. Inoltre, i neuroni ottenuti con questi protocolli sono spesso immature e mancano di adeguata attività funzionale a livello sia unicellulari e di rete a meno che i neuroni sono coltivati ​​per parecchi mesi. In parte a causa di queste limitazioni, le proprietà funzionali delle reti neuronali hiPSC-derivati ​​non sono ancora ben caratterizzati. Qui, adattiamo un protocollo recentemente pubblicato che descrive la produzione di neuroni umani da hiPSCs dall&#39;espressione forzata del fattore di trascrizione neurogenina-2 12. Questo protocollo è rapido (dando neuroni maturi entro 3 settimane) e efficiente, con efficienza di conversione quasi il 100% di transduccellule ED (&gt; 95% delle cellule DAPI-positive sono MAP2 positivo). Inoltre, il protocollo produce una popolazione omogenea di neuroni eccitatori che permetterebbero l&#39;indagine di cellule di tipo contributi specifici disturbi neurologici. Abbiamo modificato il protocollo originale generando cellule hiPSC stabilmente trasdotte, dandoci il controllo esplicito rispetto al numero totale di neuroni. Queste cellule vengono poi utilizzati per generare reti neuronali hiPSC-derivati ​​su array di micro-elettrodi. In questo modo, l&#39;attività elettrofisiologica spontanea delle reti neuronali hiPSC-derivati ​​può essere misurata e caratterizzata, pur mantenendo la coerenza interexperimental in termini di densità cellulare. Il protocollo presentato è ampiamente applicabile, in particolare per gli studi meccanicistici e farmacologici sulle reti neuronali umane.

Qui abbiamo modificato con successo un protocollo in cui hiPSCs si differenziano direttamente in neuroni corticali esprimendo over-the fattore di trascrizione neurogenina-2 12 e abbiamo adattato per l'uso di MEA. Questo approccio è veloce ed efficiente che permette di ottenere neuroni funzionali e attività di rete già durante la terza settimana dopo l'induzione della differenziazione. Nel corso del protocollo differenziazione, le cellule morfologicamente cominciato ad assomigliare neuroni: sono formate piccoli processi e neuroni cominciato collegando tra loro (Figura 1A). Abbiamo stabilito un profilo neurofisiologico dei neuroni derivati ​​da una linea hiPSC sano di controllo, misurando la loro morfologia dei neuroni e delle proprietà sinaptiche durante lo sviluppo. neuroni hiPSC-derivati ​​sono state colorate per MAP2 e synapsin-1/2 a diversi giorni dopo l'iniziodi differenziazione (Figura 2A). I neuroni derivati ​​mostrano matura morfologia neuronale già 3 settimane dopo l'induzione della differenziazione. Il numero di synapsin-1/2 puncta (una misura del numero di sinapsi) è stato quantificato sulla base synapsin-1/2 colorazioni immunocitochimica. Il numero di synapsin-1/2 puncta aumentata nel tempo, suggerendo che il livello di connettività neuronale è in aumento (Figura 2B). Il numero di synapsin-1/2 puncta 23 giorni dopo l'induzione della differenziazione era simile in due linee IPS indipendenti (Figura 2C). Al 23 DIV più synapsin1 / 2 puncta sono stati giustapposti a PSD-95 puncta, che è indicativo di sinapsi funzionali (Figura 2D). In linea con i risultati descritti da Zhang et al., Abbiamo generato una popolazione di eccitatori di livello superiore neuroni corticali, confermata da pan-neuronale e sottotipo specifico m corticale arkers come BRN2 e SATB2 (strato II / III). Non abbiamo osservato che i neuroni positivi per i neuroni strato profondo CTIP2 (livello V) o Foxp2 (strato VI) (Figura 2E e F) A caratterizzare l'attività elettrofisiologica dei neuroni hiPSC-derivati, abbiamo usato corrente a cellula intera e le registrazioni morsetto di tensione, vale a dire le proprietà intrinseche e l'input eccitatori su questi neuroni sono stati misurati durante lo sviluppo. I neuroni sono stati in grado di generare potenziali d'azione già una settimana dopo la differenziazione e la percentuale di spiking cellule aumentava nel tempo (figura 2G e H). Inoltre, i neuroni ricevuti eccitatorio ingresso sinaptica già una settimana dopo l'induzione della differenziazione: sia frequenza e ampiezza dell'ingresso sinaptica eccitatoria aumentate durante lo sviluppo (Figura 2I - K). nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; Per capire meglio come l'attività monocellulari combina per formare le funzioni a livello di rete, è essenziale per studiare come i neuroni funzionano in concerto a vitro reti neuronali coltivate su MEA. costituiscono un modello sperimentale utile per lo studio della dinamica neuronale. Abbiamo registrato 20 minuti di attività di rete elettrofisiologica dei neuroni derivati da una linea hiPSC sano controllo coltivati su 6 pozzetti MEA (Figura 2M). Poche settimane dopo l'induzione della differenziazione, i neuroni derivato da hiPSCs sani di controllo formata reti neuronali funzionalmente attivi, mostrando eventi spontanei (0.62 ± 0.05 picco / s; Figura 2N). in questa fase di sviluppo (cioè 16 d dopo l'inizio della differenziazione) eventi sincroni coinvolgono tutti i canali . dei MEA vengono rilevati (Figura 2O) il livello di attività di rete è aumentata durante lo sviluppo: durante la quarta settimana dopo il t che l'induzione della differenziazione, le reti neuronali mostrato alto livello di attività spontanea (2,5 ± 0,1 picco / s; Figura 2N) in tutti i pozzetti del dispositivo. Le reti anche esposte scoppia sincroni di rete (4.1 ± 0.1 scoppio / min, Figura 2O) con lunga durata (2.100 ± 500 ms). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> Figura 1: hiPSC differenziazione in neuroni. A. Tre punti di tempo di differenziazione in neuroni hiPSCs su vetrini. B. placcatura di hiPSCs su MEA. C. Gli astrociti al 100% di confluenza nel pallone T75 (notare che le cellule formano un monostrato mosaico). Barre di scala: 150 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> Figura 2. hiPSC-derivato neuroni Caratterizzazione. Neuroni A. hiPSC-derivati sono state colorate per MAP2 (verde) e synapsin-1/2 (rosso) a diversi giorni dopo l'inizio della differenziazione. barra della scala: 10 micron. B. La quantificazione di sinapsina puncta in due esperimenti indipendenti. In ogni esperimenti sono stati analizzati almeno 10 cellule. C. La quantificazione del puncta synapsin a DIV23 nei neuroni derivati da due linee IPS indipendenti. Neuroni D. hiPSC-derivati sono state colorate per PSD-95 (verde) e synapsin-1/2 (rosso) 23 giorni dopo l'inizio della differenziazione. puncta sinapsina sono giustapposti a PSD-95 puncta. Neuroni E. hiPSC-derivati sono state colorate per MAP2 (verde) e BRN2 (rosso) o SATB2 (rosso) 23 d dopo l'inizio della differenziazione. F. percentuale di cellule positive MAP2 chesono risultati positivi per i marcatori indicati. G. Rappresentante registrazioni clamp corrente mostrano che i potenziali d'azione possono essere generati come già 7 d dopo l'inizio della differenziazione. H. Percentuale di cellule a diversi giorni dopo l'induzione della differenziazione che mostrano uno o più potenziali d'azione. I. tracce rappresentativi delle correnti post-sinaptici eccitatori (EPSCs) ricevuti dai neuroni hiPSC derivati a diversi giorni dopo la differenziazione. J. frequenza delle correnti post-sinaptici eccitatori durante lo sviluppo. K. ampiezza delle correnti post-sinaptici eccitatori durante lo sviluppo. L. Rappresentante tracce delle registrazioni EPSC senza (controllo) e con CNQX (CNQX). M. neuroni derivata da una linea hiPSC sono state coltivate su un 6-ben MEA e attività di rete è indicata per le reti neuronali hiPSC-derivati 16 e 23 d dopo l'induzione della differenziazione. L'attività registrata dalciascuno (frequenza di campionamento di 10 kHz) e viene indicata con un colore diverso (5 min del 20 min di registrazione sono presenti). N. gittata 16 e 23 d dopo l'induzione della differenziazione. O. tasso di scoppio 16 e 23 d dopo l'induzione della differenziazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Visti i risultati, la qualità dei neuroni hiPSC derivato risultante può essere valutata facendo un profilo neurofisiologico delle cellule. Cioè, tre o quattro settimane dopo l'inizio della differenziazione, la morfologia, synapsin-1/2 espressione e elettrofisiologia dei neuroni possono essere valutate. A quel punto il tempo, i neuroni hiPSC-derivati ​​sono tenuti a dimostrare una morfologia neuronale simile, per essere MAP2, synapsin / PSD-95 positivo immunocitochimica durante l'esecuzione, e di mostret spontanea attività elettrofisiologica (sia a singola cellula e livello di rete).

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di differenziamento neuronale è quello di generare reti neuronali dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo che crescono su array di microelettrodi in modo rapido e controllato. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare domande chiave nei campi delle neuroscienze. Può essere utilizzato per studiare i meccanismi biologici alla base dei disturbi neurologici, ma può anche essere utilizzato per affrontare questioni neurobiologiche più fondamentali.Il vantaggio principale di questa tecnica è la rapida differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni in modo controllato. Il primo giorno, scaldare DMEM/F12, CDS ed E8 con l'1% di penicillina streptomicina a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere la doxiciclina al terreno E8 per ottenere una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro e quindi aggiungere l'inibitore della roccia alla miscela.Aspirare il terreno di coltura delle RTTANGN2 hiPSC positive e aggiungere un millilitro di CDS alle cellule. Successivamente, incubare le cellule per tre-cinque minuti in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius. Al microscopio, controlla se le cellule si stanno staccando l'una dall'altra.Quindi, aggiungere due millilitri di DMEM/F12 nel pozzetto. Sospendere delicatamente le cellule con una pipetta da 1.000 microlitri e trasferirle in una provetta da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere sette millilitri di DMEM/F12 alla sospensione cellulare e far girare le cellule a 200 x g per cinque minuti.Dopo cinque minuti, aspirare il surnatante e aggiungere due millilitri del terreno E8 preparato. Dissociare le hiPSC mettendo la punta di una pipetta da 1.000 microlitri contro il lato della provetta da 15 millilitri e risospendendo delicatamente le cellule. Al microscopio, controlla se le cellule sono dissociate.Quindi, determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro. Per i sei MEA a pozzetti, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di 7,5 volte 10 per la quinta cellula per millilitro. Per i vetrini, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di quattro volte 10 per la quarta cella per millilitro.Aspirare la laminina diluita dai vetrini coprioggetti e dai sei pozzetti MEA. Per i sei pozzetti MEA, piastrate le celle aggiungendo 100 microlitri di sospensione cellulare all'area dell'elettrodo attivo in ciascun pozzetto. Quindi piastrate le cellule aggiungendo 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.Quindi, posizionare i sei pozzetti MEA o la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius. Dopo due ore, aggiungere con cautela 500 microlitri del terreno E8 preparato a ciascun pozzetto dei sei MEA pozzetti. Successivamente, posizionare i sei MEA per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.Il terzo giorno, scaldare lo 0,05% di tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Caldo DPBS e DMEM/F12 con 1% di penicillina streptomicina a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare il mezzo esaurito della coltura di astrociti di ratto.Lavare la coltura aggiungendo cinque millilitri di DPBS e agitarla delicatamente. Successivamente, aspirare DPBS e aggiungere cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05%. Agitare delicatamente la tripsina-EDTA.Quindi incubare le cellule in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Successivamente, controllare al microscopio per verificare se le cellule sono staccate. Stacca le ultime celle colpendo il pallone alcune volte.Quindi, aggiungere cinque millilitri di DMEM/F12 al pallone. Provare a valutare delicatamente le cellule all'interno del pallone con una pipetta da 10 millilitri. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.Centrifugare il tubo a 200 x g per otto minuti. Successivamente, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un millilitro di DMEM/F12. Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro.Quindi, aggiungi 7,5 volte 10 ai quarti astrociti a ciascun pozzetto dei sei MEA del pozzetto. E aggiungi due volte 10 al quarto astrocito a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.Acquisisci i dati a 1.200 volte l'amplificazione e campiona il segnale a 10 kilohertz utilizzando la scheda di acquisizione dati MCS. Registrare 20 minuti di attività elettrofisiologica di neuroni derivati da hiPSC coltivati su MEA. Durante la registrazione, mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius e prevenire l'evaporazione del fluido e le variazioni di pH erogando un flusso lento e costante di gas umidificato sui MEA.Successivamente, analizza i dati utilizzando un pacchetto software personalizzato. Questa figura mostra i cambiamenti di espressione dei marcatori neuronali MAP2 nella sinapsina durante il processo di differenziazione, che indica la maturazione neuronale. Questo grafico mostra che l'espressione della sinapsina viene misurata per le singole cellule aumentate durante il processo di differenziazione.La sinapsina che viene espressa nelle cellule dopo tre settimane di differenziazione è co-localizzata con PSD-95, indicando la presenza di sinapsi funzionali. Qui, il patch clamp dell'intera cellula è stato eseguito in diversi punti temporali durante il processo di differenziazione per misurare l'attività elettrofisiologica delle cellule. Le cellule sono state in grado di generare potenziali d'azione nei diversi punti temporali.E la percentuale di cellule spiking aumentata nel tempo mostra che la maggior parte delle cellule è in grado di generare potenziali d'azione, anche nella fase iniziale della differenziazione. Il patch clamp è stato utilizzato anche per misurare le correnti postsinaptiche eccitatorie ricevute dalle cellule. Il numero di input che le cellule ricevono aumenta durante il processo di differenziazione.Sia la frequenza che l'ampiezza delle correnti eccitatorie postsinaptiche sono aumentate durante il processo di differenziazione. L'attività elettrofisiologica delle cellule differenziate su array di microelettrodi è stata misurata durante il processo di differenziazione. Qui, l'attività della rete neuronale è aumentata durante il processo di differenziazione e ha mostrato eventi sincroni dopo 23 giorni.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte in reti neuronali funzionali entro tre o quattro settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in modo sterile e trattare le cellule con delicatezza. Seguendo questa procedura, altri metodi come i test farmacologici possono essere utilizzati per salvare il fenotipo, osservato nelle linee cellulari dei pazienti.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per studiare ufficialmente i difetti dell'attività di rete nei disturbi neurologici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare, indurre cellule staminali pluripotenti in neuroni in modo rapido e controllato.

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Biologia dello sviluppo

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Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare lattività di rete su array Micro-elettrodo (Video) | JoVE Journal

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l'attività di rete su array Micro-elettrodo

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