Integrazione di estrazione miniaturizzata di fase solida e rilevazione LC-MS / MS di 3-Nitrotirosina nell'urina umana per applicazioni cliniche

L'obiettivo generale di questa estrazione miniaturizzata in fase solida combinata con il test LC-MS/MS è quello di quantificare con precisione la 3-nitrotirosina libera nelle urine umane per applicazioni cliniche. La 3-nitrotirosina libera aiuta nelle rese e un biomarcatore per lo stress ossidativo. Tuttavia, rimarrà una sfida particolare quantificare con precisione la 3-nitrotirosina nelle emergenze biologiche per applicazioni cliniche a causa dell'insufficiente sensibilità, della selettività e delle ingombranti preparazioni dei campioni.

Questa tecnica che incorpora un'efficace estrazione in fase solida in un'interazione LC-MS/MS altamente sensibile consente una determinazione rapida, specifica e accurata di bassi livelli di 3-nitrotirosina endogena nelle urine umane senza la necessità di costituzione e LC bidimensionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'indagine sullo stress ossidativo, può essere applicato anche ad altre condizioni patologiche come disturbi infiammatori complessi e neurodegenerativi. Le implicazioni di questa tecnica potrebbero essere estese al monitoraggio dell'efficacia del trattamento antiossidante perché il livello di 3-nitrotirosina può essere ridotto dagli antiossidanti. Per iniziare questa procedura, vorticare precedentemente preparato e scongelato campioni di urina, standard e campioni di controllo qualità.

Dopo il vortex, aggiungere 250 microlitri di ciascun campione e lo standard a 32 pozzetti di una piastra di raccolta pulita da due millilitri a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di lavoro standard interna precedentemente preparata a ciascun pozzetto, ad eccezione del pozzetto del campione a doppio bianco. Quindi aggiungere 50 microlitri di acqua di grado LC-MS con lo 0,01% di acido formico al pozzetto del campione a doppio bianco.

Successivamente, aggiungere 250 microlitri di acqua di grado LC-MS con lo 0,1% di acido formico ai pozzi. Quindi miscelare le soluzioni tre volte con una pipetta a otto canali e coprire la piastra fino al caricamento della SPE. Quindi, posizionare una micropiastra di estrazione a 96 pozzetti a scambio cationico in modalità mista e un serbatoio di raccolta su un processore a pressione positiva.

L'estrazione in fase solida con una micropiastra a scambio cationico in modalità mista consente la pulizia e l'arricchimento simultanei del campione di 3-nitrotirosina in un'unica estrazione. Condizionare la piastra di estrazione facendo scorrere 200 microlitri di metanolo di grado LC-MS attraverso il sorbente. Ruotare la manopola di regolazione della pressione sul processore a pressione positiva per impostare una pressione positiva bassa in modo da consentire alla miscela di fluire lentamente attraverso il sorbente, regolando la pressione se necessario.

Equilibrare facendo scorrere 200 microlitri di acqua di grado LC-MS con il 2% di acido formico attraverso il sorbente. Utilizzando una pipetta a otto canali, caricare con cura l'intero volume di ciascuno dei campioni premiscelati sulla piastra di estrazione precondizionata. Impostare una pressione positiva bassa sul processore a pressione positiva per consentire alla miscela di fluire lentamente attraverso il sorbente, regolando la pressione secondo necessità.

Successivamente, lavare i pozzetti facendo scorrere 200 microlitri di acqua di grado LC-MS con acido formico al 2% attraverso il sorbente. Dopo il lavaggio con 200 microlitri di metanolo e acqua, impostare il processore a pressione positiva ad alta pressione per asciugare i pozzetti. Una volta che i pozzetti sono asciutti, sostituire il serbatoio con una piastra di raccolta pulita da due millilitri a 96 pozzetti.

Applicare ora 50 microlitri di una soluzione di acetato di ammonio da 25 millimolari per eluire lentamente l'analita trattenuto e lo standard interno dalla piastra di estrazione. Quindi aggiungere 50 microlitri di acqua di grado LC-MS con il 5% di acido formico per neutralizzare l'eluente. L'applicazione di una soluzione delicata di acetato di ammonio per l'eluizione della 3-nitrotirosina fornisce un notevole miglioramento della selettività e della sensibilità.

Miscelare i campioni con una pipetta a otto canali tre volte in preparazione per l'analisi con cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem. Dopo aver impostato lo strumento LC-MS/MS, equilibrare il metodo LC-MS/MS con 3-nitrotirosina per 10 minuti con l'eluizione a gradiente LC. Equilibrando il metodo, il gradiente LC sarà bilanciato all'eluizione iniziale del gradiente.

La temperatura del campionatore automatico sarà impostata su quattro gradi Celsius e la temperatura del forno sarà impostata su 30 gradi Celsius. Crea un elenco di lotti che includa i campioni di urina, gli standard e i campioni di controllo qualità. Quindi iniziare il lotto iniettando i campioni preparati.

Dopo aver completato tutte le iniezioni, stabilire una curva standard con un intervallo da 10 a 2, 500 picogrammi per millilitro per la quantificazione della 3-nitrotirosina mediante regressione lineare del rapporto dell'area di picco della 3-nitrotirosina e dello standard interno rispetto alla concentrazione nominale di 3-nitrotirosina. Infine, quantificare tutti gli altri campioni utilizzando la curva standard stabilita e determinare se i campioni QC rientrano nell'intervallo stabilito. I dati LC dei campioni di urina umana mostrano che la 3-nitrotirosina viene separata cromatograficamente da altri analoghi della tirosina strutturalmente simili in condizioni ottimizzate, il che elimina le interferenze di co-eluizione dovute a questi composti enormemente eccessivi e di conseguenza migliora il grado di selettività del saggio.

Nel cromatogramma di monitoraggio a reazione multipla del campione a doppio bianco non si osserva un segnale di 3-nitrotirosina, indicando che la 3-nitrotirosina non si forma durante l'intero processo. Qui sono mostrati i cromatogrammi rappresentativi di monitoraggio delle reazioni multiple della 3-nitrotirosina e lo standard interno per un individuo sano. Non sono stati osservati segnali interferenti ai tempi di ritenzione della 3-nitrotirosina e dello standard interno.

Qui viene mostrata una curva standard rappresentativa. Il limite di rilevamento, definito come la concentrazione più bassa con un rapporto segnale/rumore superiore a tre, è stato determinato in due picogrammi per millilitro. Il limite inferiore di quantificazione è stato determinato in 10 picogrammi per millilitro ed è definito come la concentrazione più bassa entro il 20% di imprecisione e accuratezza con un rapporto segnale/rumore superiore a 10.

Il test di integrazione ottimizzato offre un significativo miglioramento della specificità, della sensibilità e della produttività con una riduzione dell'effetto matrice, dell'uso di assorbente e dello smaltimento dei rifiuti. Con questo test semplice e rapido, il campione di urina può essere elaborato entro 24 ore. Prendi in considerazione il prelievo di urina non invasivo ed economico.

Questo metodo, notevolmente migliorato, è adatto per valutare il ruolo della 3-nitrotirosina come biomarcatore dello stress ossidativo in studi preclinici e clinici.