Integrazione di estrazione miniaturizzata di fase solida e rilevazione LC-MS / MS di 3-Nitrotirosina nell'urina umana per applicazioni cliniche

L'obiettivo generale di questo saggio di estrazione in fase solida miniaturizzata combinata con LC-MS/MS è quantificare con precisione la 3-nitrotirosina libera nell'urina umana per applicazioni cliniche. La 3-nitrotirosina libera fornisce indicazioni utili ed è un biomarcatore dello stress ossidativo. Tuttavia, rimane una sfida particolare quantificare con precisione la 3-nitrotirosina in campioni biologici in situazioni di emergenza per applicazioni cliniche, a causa di sensibilità insufficiente, selettività limitata e preparazioni del campione complesse.

Questa tecnica, che integra un'efficace estrazione in fase solida in un'interazione altamente sensibile con LC-MS/MS, consente una determinazione rapida, specifica e accurata di basse concentrazioni di 3-nitrotirosina endogena nell'urina umana, senza la necessità di costituzione né di cromatografia liquida bidimensionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per lo studio dello stress ossidativo, può essere applicato anche ad altre condizioni patologiche, come disturbi infiammatori complessi e malattie neurodegenerative. Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi al monitoraggio dell'efficacia di trattamenti a base di antiossidanti, poiché i livelli di 3-nitrotirosina possono essere ridotti dagli antiossidanti. Per iniziare questa procedura, vortexare i campioni di urina precedentemente preparati e scongelati, gli standard e i campioni di controllo qualità (QC).

Dopo aver agitato con il vortex, aggiungere 250 microlitri di ogni campione e standard a 32 pozzetti di una piastra di raccolta pulita da 96 pozzetti da due millilitri. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di lavoro dello standard interno precedentemente preparata in ogni pozzetto, tranne che nel pozzetto del doppio campione bianco. Quindi aggiungere 50 microlitri di acqua di grado LC-MS contenente lo 0,01% di acido formico nel pozzetto del doppio campione bianco.

In seguito, aggiungere 250 microlitri di acqua di grado LC-MS contenente lo 0,1% di acido formico nei pozzetti. Quindi, miscelare le soluzioni tre volte con una pipetta a otto canali e coprire la piastra fino al caricamento sulla SPE. Successivamente, posizionare una micropiastra di estrazione a 96 pozzetti con scambio cationico misto e un serbatoio di raccolta su un processore a pressione positiva.

L'estrazione in fase solida che utilizza una micropiastra a scambio cationico in modalità mista consente la pulizia simultanea del campione e l'arricchimento della 3-nitrotirosina in un'unica estrazione. Condizionare la piastra di estrazione facendo passare 200 microlitri di metanolo di grado LC-MS attraverso il sorbente. Ruotare la manopola di regolazione della pressione sul processore a pressione positiva per impostare una bassa pressione positiva, in modo da permettere alla miscela di fluire lentamente attraverso il sorbente, regolando la pressione se necessario.

Equilibrare facendo passare 200 microlitri di acqua di grado LC-MS contenente acido formico al 2% attraverso il sorbente. Utilizzando una pipetta a otto canali, caricare con attenzione l'intero volume di ciascun campione pre-miscelato sulla piastra di estrazione precondizionata. Impostare una pressione positiva bassa sul processore a pressione positiva in modo da permettere alla miscela di fluire lentamente attraverso il sorbente, regolando la pressione secondo necessità.

In seguito, lavare le pozzette facendo passare 200 microlitri di acqua di grado LC-MS contenente acido formico al 2% attraverso il materiale sorbente. Dopo il lavaggio con 200 microlitri di metanolo e acqua, impostare il processore a pressione positiva ad alta pressione per asciugare le pozzette. Una volta che le pozzette sono asciutte, sostituire il serbatoio con una nuova piastra di raccolta da 2 millilitri a 96 pozzette.

Ora, applicare 50 microlitri di una soluzione di acetato di ammonio 25 millimolare per eluire lentamente l'analita trattenuto e lo standard interno dalla piastra di estrazione. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di acqua di grado LC-MS contenente acido formico al 5% per neutralizzare l'eluente. L'uso di una soluzione moderata di acetato di ammonio per l'eluzione della 3-nitrotirosina garantisce un notevole aumento della selettività e della sensibilità.

Mescolare i campioni tre volte con una pipetta a otto canali in preparazione all'analisi mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa in tandem. Dopo aver configurato lo strumento LC-MS/MS, equilibrare il metodo LC-MS/MS per la 3-nitrotirosina per 10 minuti mediante eluizione con gradiente LC. Equilibrando il metodo, il gradiente LC verrà riportato alle condizioni iniziali di eluizione del gradiente.

La temperatura del campionatore automatico sarà impostata a quattro gradi Celsius e la temperatura del forno sarà impostata a 30 gradi Celsius. Creare un elenco di campioni che includa i campioni di urina, gli standard e i campioni di controllo qualità. Quindi avviare il batch iniettando i campioni preparati.

Dopo aver completato tutte le iniezioni, stabilire una curva standard con un intervallo compreso tra 10 e 2.500 picogrammi per millilitro per la quantificazione della 3-nitrotirosina, mediante regressione lineare del rapporto tra l'area del picco della 3-nitrotirosina e lo standard interno rispetto alla concentrazione nominale di 3-nitrotirosina. Infine, quantificare tutti gli altri campioni utilizzando la curva standard stabilita e verificare se i campioni di controllo di qualità rientrano nell'intervallo stabilito. I dati di cromatografia liquida (LC) di campioni di urina umana mostrano che la 3-nitrotirosina è separata cromatograficamente da altri analoghi della tirosina strutturalmente simili nelle condizioni ottimizzate, eliminando interferenze da co-eluzione dovute a questi composti largamente eccessivi e aumentando conseguentemente il grado di selettività del saggio.

Un segnale di 3-nitrotirosina non viene osservato nel cromatogramma di monitoraggio di reazione multipla del campione doppio bianco, indicando che la 3-nitrotirosina non si forma durante l'intero processo. Vengono mostrati qui i cromatogrammi rappresentativi di monitoraggio di reazione multipla per la 3-nitrotirosina e lo standard interno di un individuo sano. Non sono stati osservati segnali interferenti ai tempi di ritenzione della 3-nitrotirosina e dello standard interno.

Viene mostrata qui una curva standard rappresentativa. Il limite di rilevamento, definito come la concentrazione più bassa con un rapporto segnale-rumore superiore a tre, è stato determinato essere di due picogrammi per millilitro. Il limite inferiore di quantificazione è stato determinato essere di 10 picogrammi per millilitro ed è definito come la concentrazione più bassa entro il 20% di imprecisione e accuratezza con un rapporto segnale-rumore superiore a 10.

Il saggio di integrazione ottimizzato fornisce una specificità, sensibilità e produttività significativamente migliorate, con ridotto effetto di matrice, consumo di sorbente e smaltimento dei rifiuti. Grazie a questo saggio semplice e rapido, il campione di urina può essere processato entro 24 ore. Considerate il campionamento urinario non invasivo ed economico.

Questo metodo notevolmente migliorato è particolarmente adatto per valutare il ruolo della 3-nitrotirosina come biomarcatore dello stress ossidativo in studi preclinici e clinici.