Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell'anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un test immunologico di elettroforesi capillare utilizzando una piattaforma commerciale. Questa piattaforma distinguerà e quantificherà i bersagli proteici da un campione biologico che può essere prelevato da tessuti di coltura cellulare e biofluidi. Il processo esamina le proteine in base a dimensioni che vanno da due a 440 kilodalton.

Il vantaggio di questa procedura automatizzata rispetto alle procedure tradizionali, come il Western blot, è che i saggi immunoforetici elettroforetici capillari eliminano la necessità di gel, dispositivi di trasferimento e lavaggi manuali. Inoltre, la quantità assoluta di proteine richiesta è circa 10 volte inferiore, rendendo la procedura ideale per tipi di cellule rare o campioni limitati. Inoltre, i risultati si ottengono in appena tre ore utilizzando sistemi automatizzati e hanno dimostrato di essere più quantitativi e riproducibili rispetto alle procedure convenzionali di Western blot.

Preparare i campioni e i reagenti del kit, tra cui tampone per campioni, ditiotreitolo, master mix fluorescente e scala biotinilata secondo il foglietto illustrativo del produttore. Prepara i campioni di proteine usando il tuo metodo preferito. Qui abbiamo isolato l'estratto di cellule intere da colture cellulari BEAS-2B.

Diluire i campioni di proteine con il tampone. Miscelare una parte di master mix fluorescente cinque X con quattro parti di campione diluito per ottenere la concentrazione proteica finale desiderata. Viene mostrato un esempio di calcolo per ottenere 70 microlitri di 0,2 microgrammi per microlitro di concentrazione proteica finale a partire da una concentrazione di proteine stock di 1,2 microgrammi per microlitro.

La miscela master è 1/5 del volume totale, in questo caso 14 microlitri. Per calcolare il volume di stock proteico necessario, moltiplicare la concentrazione finale desiderata per il volume totale e dividere per la concentrazione dello stock proteico. Sottrarre la miscela master e i volumi di stock dal volume totale per calcolare il volume del tampone del campione.

Denaturare i campioni preparati e la scala riscaldando a 95 gradi centigradi per cinque minuti. Si noti che alcune proteine possono richiedere condizioni di denaturazione più delicate. Ad esempio, 70 gradi per 10 minuti per prevenire l'aggregazione proteica e migliorare la migrazione.

Considerare questa opzione se c'è una forte sbavatura ai pesi molecolari più elevati. Preparare le diluizioni di anticorpi desiderate nel diluente fornito. Si noti che gli anticorpi sono generalmente utilizzati a concentrazioni più elevate per il dosaggio immunologico basato sui capillari rispetto al Western blotting tradizionale.

Preparare una miscela uno a uno di luminol e perossido fresco ad ogni utilizzo. Pipettare i campioni e i reagenti nella piastra di analisi utilizzando i volumi indicati nel modello. La codifica a colori rappresenta il corretto caricamento dei reagenti e dei campioni sulla piastra di analisi.

Pipettare la scala biotinilata al pozzetto A1, i campioni preparati ai pozzetti da A2 a A25. Il diluente anticorpale fornito ai pozzetti da B1 a B25 e al pozzetto C1. Anticorpo primario contro i pozzetti da C2 a C25. Streptavidina HRP al pozzetto D1. Anticorpo secondario ai pozzetti da D2 a D25.

E il perossido di luminolo si mescola ai pozzetti da E1 a E25. Aggiungere il tampone di lavaggio alle prime tre file dei pozzetti centrali della piastra più grandi. Accendere lo strumento di immunodosaggio capillare e aprire il software in dotazione.

Caricare la cartuccia capillare e la piastra di analisi nella macchina secondo le istruzioni del produttore e iniziare la seduta. Al termine della corsa, verificare che gli standard fluorescenti siano identificati correttamente e, se necessario, corretti. Inoltre, verificare che la scala biotinilata riporti i picchi di dimensionamento corretti per il kit utilizzato.

Per ulteriori dettagli, consultare la guida di riferimento rapido del produttore o il manuale del prodotto. L'ottimizzazione delle condizioni di analisi, come il tempo di esposizione, la concentrazione proteica e la diluizione degli anticorpi, è importante per ottenere risultati accurati e riproducibili. Queste condizioni sono specifiche per ogni combinazione di anticorpi del sistema modello e, pertanto, devono essere determinate empiricamente per ogni nuovo test.

La capacità di generare risultati quantitativi dipende dall'analisi di un tempo di esposizione al quale il substrato di luminol non si esaurisce rapidamente, poiché l'esaurimento del substrato provoca la perdita di segnale o l'esaurimento del segnale. Questo può essere determinato esaminando i dati a diversi tempi di esposizione alla chemiluminescenza, come mostrato nella figura due. Le esposizioni con lo strumento utilizzato variavano da cinque a 480 secondi.

Le visualizzazioni di corsia hanno mostrato concentrazioni proteiche decrescenti per gli estratti di BEAS-2B sondati con l'anticorpo p53 DO-1 a una diluizione da uno a 500. I coefficienti del segnale di chemiluminescenza riportati come altezze di picco nel software dello strumento sono sovrapposti. Le intensità delle bande visive vengono regolate automaticamente dallo strumento e non sono confrontabili da un pannello all'altro.

Il coefficiente del segnale diminuisce con esposizioni sequenzialmente più lunghe se il luminol si esaurisce, come si vede qui. Il segnale inizia a scomparire e il picco si divide alle due esposizioni più lunghe. Per questo motivo, per l'analisi dei dati è stato scelto un breve tempo di esposizione di 15 secondi.

Anche l'input proteico totale deve essere ottimizzato per ogni particolare saggio e sistema modello. Per la valutazione quantitativa, le misurazioni devono essere effettuate all'interno dell'intervallo dinamico lineare di ciascun saggio. Dove le variazioni del segnale, misurate dall'area del picco, sono proporzionali alle variazioni della quantità di proteine nel campione.

La titolazione del lisato mostra le viste di corsia del lisato BEAS-2B quando sondato con un anticorpo da uno a 500 p53 DO-1 o da uno a 50 alfa-tubulina. L'analisi di regressione lineare conferma che i saggi sono lineari sull'intero intervallo testato. Le concentrazioni proteiche totali nel mezzo dell'intervallo lineare sono state scelte per adattarsi alla potenziale variazione della proteina bersaglio in entrambe le direzioni.

Come considerazione finale sull'ottimizzazione, deve essere valutata la corretta diluizione degli anticorpi primari. L'uso di anticorpi a concentrazioni di sutura aiuta a garantire che qualsiasi variazione del segnale misurata sia dovuta solo a variazioni della quantità di proteine. Due campioni di proteina BEAS-2B, rappresentati dai punti blu e arancione, sono stati sondati con anticorpo alfa-tubulina diluito in serie.

Il segnale di chemiluminescenza, misurato come area di picco, è stato tracciato rispetto alla diluizione degli anticorpi. La saturazione è stata osservata vicino alla diluizione da uno a 50, dove la curva inizia un notevole plateau. È stato quindi scelto uno a 50 come diluizione ottimale per questo anticorpo.

Dopo aver visto questo video, dovresti sentirti a tuo agio nella preparazione dei campioni, nel caricamento dei campioni e nell'esecuzione delle analisi sullo strumento di immunodosaggio basato su capillari ProteinSimple Wes. Una volta padroneggiata questa procedura, l'intera corsa può essere eseguita in tre ore con 25 campioni. Quando si analizza una corsa, è importante eseguire il controllo di qualità per ogni capillare e campione.

Ciò include la verifica degli standard fluorescenti in una scala biotinilata. Se i picchi vengono identificati in modo errato, il software di analisi deve essere utilizzato principalmente per identificare i picchi corretti ed eliminare i picchi identificati in modo errato. Come per tutte le tecniche di biologia molecolare in laboratorio, indossa dispositivi di protezione individuale adeguati per proteggere te stesso e i tuoi campioni.

Ciò include camice da laboratorio, guanti, occhiali di sicurezza e scarpe chiuse. È importante tenere presente che l'ottimizzazione deve essere eseguita per ogni nuovo target misurato o quando vengono utilizzate diverse fonti di campionamento. Le fasi di convalida e follow-up includono la valutazione della specificità e del segnale degli anticorpi utilizzando proteine o epitopi purificati.

Testare l'intervallo dinamico del test utilizzando una serie di diluizioni del campione e ottimizzare la diluizione degli anticorpi valutando la saturazione del segnale in un intervallo di concentrazione di anticorpi. Una volta ottimizzata, questa procedura immunologica capillare dovrebbe fornire un metodo più rapido e quantitativo per misurare la proteina bersaglio dei campioni biologici rispetto ai metodi tradizionali come il Western blot.