Name: Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Impara l'immunoassay capillare automatizzato per la quantificazione proteica con minori volumi campione. Questo metodo elettroforetico offre risultati rapidi e riproducibili in sole tre ore.

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Gli autori vorrei ringraziare Keith Tarpley di l'US EPA Office del team ricerca e sviluppo-Research Triangle Park (RTP-ORD) grafica e Media per lo sviluppo, taping e di editing del video didattico. Vorremmo anche ringraziare Deborah Pritchett da ProteinSimple per le conversazioni utili per quanto riguarda l'ottimizzazione dei nostri dati. JM Guynn è stata sostenuta dall'Istituto Oak Ridge per scienza e formazione ricerca/Participation Program presso la US Environmental Protection Agency.

Nota: accertarsi che tutti i reagenti ed i campioni sono preparati secondo il produttore &#39; protocollo s, descritta di seguito. Si prega di indossare dispositivi di protezione individuale adeguata durante questa procedura, che include guanti in nitrile, camice, scarpe a punta chiusa e occhiali di sicurezza. Una tabella di materiali specifici, reagenti e attrezzatura necessaria è fornita separatamente. Proteina totale concentrazione dei campioni deve essere determinata in anticipo utilizzando metodologie consolidate che sono compatibili con il lisato buffer utilizzato, come analisi di Bradford 11.
 1. preparazione dei campioni e reagenti del pacchetto standard come fornito dal produttore di <ol><li>per preparare la soluzione di lavoro di 400 mM di ditiotreitolo (DTT), aggiungere 40 µ l deionizzata acqua al tubo trasparente contenente il stock fornito dal produttore. È importante evitare di introdurre bolle alla soluzione mescolando la soluzione con lenta e delicata pipettaggio.</li>
	Tampone del campione <li>aggiungere 20 µ l 10 X e 20 µ l della soluzione preparata 400 mM DTT nella rosa provetta contenente 5 fluorescente X master mix (Vedi la Tabella materiali). 
	Nota: Il Master Mix (MM) è sigillato dal costruttore con una pellicola di copertura e deve essere trafitto da un puntale. Mix dolcemente pipettando lento per evitare spruzzi DTT in pipetta.</li>
	<li>Successivamente, aggiungere 16 µ l deionizzata acqua, 2 µ l di fornito 10X tampone del campione e 2 µ l della soluzione preparata 400 mM DTT al bianco biotinilati scaletta tubo fornito dal produttore. Mescolare delicatamente e trasferire in una provetta di 0,6 mL di denaturazione.</li>
	<li>Preparare 0,1 x tampone diluendo la dotazione 10 X soluzione 1: 100 con acqua. Preparare abbastanza 0,1 x tampone per diluire i campioni tutti.</li>
	<li>Calcolare la quantità di 0,1 x sample buffer che viene aggiunto a un campione, che dipenderà la concentrazione finale desiderata delle proteine totali. Mescolare 1 parte 5 x fluorescente MM con 4 parti campione per ottenere la concentrazione finale desiderata di proteine diluito.
	Volumi <ol><li>calcola come segue: (i) Volume 5 x fluorescente MM = (concentrazione nella proteina finale desiderata) / 5; (ii) volume di stock di proteine = (concentrazione di proteina finale desiderata x volume totale richiesto) / proteina stock concentrazione; (iii) volume di 0,1 x tampone del campione = volume totale - 5 x MM volume - proteina stock volume.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denaturazione di campioni e scaletta <ol><li>luogo preparato campioni e biotinilati scaletta in un blocco di calore di 95 ° C per 5 min. tubi di vortice immediatamente dopo l'incubazione, eseguire uno spin per ~ 5 s in una centrifuga da tavolo e posto su Ice. 
	Nota: Alcune proteine possono richiedere condizioni denaturanti più delicate (ad es., 70 o C per 10 min) per impedire l'aggregazione proteica e migliorare la migrazione nella matrice capillare. Considerate questa opzione se c'è pesante sbavature presso i più alti pesi molecolari (Vedi ad esempio video).</li>
</ol> 3. Preparazione di anticorpi <ol><li>come determinato da ottimizzazione (Vedi Rappresentante risultati e video), l'anticorpo fornito da soli il desiderato diluizioni di anticorpo primario (ad esempio, 01:50, 1: 100) Diluente 2. 
	Nota: Gli anticorpi sono generalmente utilizzati a concentrazioni più elevate per immunodosaggio basato su capillare rispetto per macchiarsi occidentale tradizionale. L'anticorpo secondario fornito è pronto all'uso senza diluizione.</li>
</ol> 4. Preparazione di perossido e Luminol-S <ol><li>preparare una miscela 1:1 di perossido e luminol-S.</li>
	<li>Vortex per mescolare e conservare il ghiaccio 
	Nota: È importante che questa miscela è preparata fresco per ogni dosaggio sperimentale. 250ul mix totale è necessario per eseguire un piatto completo.</li>
</ol> 5. Preparazione del piatto dosaggio <ol><li>come illustrato nella Figura 1, caricare i campioni e reagenti preparati sopra nella piastra del dosaggio. Consulta le istruzioni dettagliate qui di seguito per ogni riga. Per minimizzare evaporazione dai pozzi, assicurarsi che il coperchio della piastra viene sostituito tra aggiunte di reagente.</li>
	<li>Nella riga A, pipettare 5 µ l di Biotinylated Ladder in pozzetto A1. Per l'altra fila, dispensare preparati campioni (5 µ l) nei pozzetti A2-A25. 
	Nota: È fondamentale che la A1 contiene bene sempre scaletta, come il primo capillare nella cartuccia è ottimizzato per l'esecuzione di questo standard.</li>
	<li>In fila B, dispensare 10 µ l di diluente 2 anticorpo in ogni pozzetto (B1-B25).</li>
	<li>Nella riga C, dispensare 10 µ l di diluente 2 anticorpo in C1 bene. Nella riga resto pozzetti C, dispensare 10 µ l di anticorpo primario (pozzetti C2-C25).</li>
	<li>In fila D, dispensare 10 µ l di streptavidina-HRP in ben D1. Nella riga resto pozzetti D, dispensare 10 µ l di anticorpo secondario (pozzi D2-D25).</li>
	<li>In fila E, dispensare 10 µ l della miscela preparata luminol-perossido in ogni pozzetto (E1-E25).</li>
	<li>Infine, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per vano a ciascuno le prime 3 righe di pozzi buffer. 
	Nota: È importante ridurre al minimo la formazione di bolle di pipettaggio delicatamente e non espellere il volume finale dalla punta come bolle possono interferire con il capillare di carico ed eseguire.</li>
	<li>Una volta caricati tutti i pozzetti, centrifugare la piastra a ~ 1000 x g per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere le bolle e assicurarsi che il liquido sia il fondo dei pozzetti. Pop tutte le bolle visibili con un puntale piccolo o un ago pulito (ad es., calibro 25 sterile &#34; alto rappresentante &#34; needle).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Figura 1 . Modello di pipettaggio per piastra test. Codifica a colori rappresenta corretta reagenti e campioni (fino a 24 in totale) sulla piastra di dosaggio. Aggiungere biotinilati scaletta al pozzetto A1 (arancione), preparati campioni da pozzetti A2 fino A25 (blu chiaro), anticorpo 2 diluente nei pozzetti B1-B25 e C1 (verde chiaro), anticorpo primario per pozzetti C2 fino a C25 (blu), streptavidina-HRP ben D1 (rosa scuro), anticorpo secondario per pozzi D2 fino a D25 (verde scuro) e il mix di luminol-perossido nei pozzetti E1 fino a E25 (viola). Tampone di lavaggio viene aggiunto per le prime tre righe della piastra metà più grande pozzi (blu scuro). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 6. a partire lo strumento capillare immunoassay <ol><li>assicurarsi che lo strumento e il computer di accompagnamento siano accesi. Nessun tempo di preriscaldamento è necessario.</li>
	<li>Aprire il software di strumentazione sul computer. In primo luogo, selezionare il &#34; test &#34; scheda sulla destra della finestra e &#34; nuovo dosaggio &#34; sotto il &#34; Menu File &#34; sulla sinistra. Selezionare il formato, la gamma di dimensioni (ad es., 12-230 kDa) e la cartuccia tipo (ad esempio, 25 capillare) che è stato utilizzato per il dosaggio particolare. 
	Nota: Un maggio anche input analisi parametri, incluso la concentrazione nella proteina, tipo di anticorpo e diluizione, se lo si desidera, ma questi non sono necessari per avviare il test.</li>
	<li>Aprire la porta sullo strumento premendo il pulsante sulla parte superiore del pannello arancio.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la cartuccia capillare dalla confezione. Senza toccare i capillari di vetro se stessi, è necessario inserire la cartuccia nell'apposito supporto. Verificare i posti a sedere cartuccia osservando la luce interiore cambia da arancione a blu.</li>
	<li>Tenere saldamente la piastra sul banco e rimuovere con cautela il sigillo di evaporazione dalla parte inferiore della piastra. Pop tutte le bolle vista in questi pozzi di matrice di separazione con un smtutti puntale o aghi puliti (ad esempio, calibro 25 sterile &#34; alto rappresentante &#34; needle).</li>
	<li>Posizionare la piastra di saggio sul porta targa, assicurando che sia completamente inserita e chiudere la porta strumenti.</li>
	<li>Clic la &#34; Start &#34; pulsante nel software. 
	Nota: Se viene visualizzata la finestra di nessun pulsante di avvio, il collegamento con lo strumento è stato perso. Scegliere strumenti dal menu in alto a sinistro, quindi collegare. Un pop-up dovrebbe essere visualizzato con il numero di matricola; Selezionare questa opzione, quindi fare clic su Connetti. Pulsante Start dovrebbe ora apparire.</li>
	<li>Quando viene completata, l'esecuzione scartare la piastra. Rimuovere la cartuccia e posto in un apposito contenitore per lo smaltimento, insieme a qualsiasi aghi che potrebbe essere stato utilizzato per bolle scoppiano. Lasciare acceso per evitare problemi di connessione se lo strumento viene utilizzato regolarmente (ad es., almeno settimanalmente).</li>
</ol> 7. Esperimento di analisi <ol><li>prima dell'analisi, garantire vengono eseguiti i seguenti controlli di qualità.
	<ol><li>Verifica fluorescente standard selezionando la &#34; standard Visualizza &#34; icona. Verificare che gli standard sono identificati correttamente nella &#34; visualizzazione grafico &#34; scheda. Se non sono corretti, andare alla &#34; singola visualizzazione &#34; icona, fare clic con il pulsante destro sul picco di corretto e selezionare &#34; forza Standard &#34;, o fare clic con il pulsante destro sul picco errato e selezionare &#34; non Standard &#34;. Eseguire questo controllo per ogni nuovo capillare.</li>
		<li>Verifica biotinilati scaletta cliccando sul &#34; campioni &#34; e &#34; singola visualizzazione &#34; icone. Selezionare la scala nella scheda esperimento. Se un picco è identificato in modo non corretto, fare clic destro su di esso in &#34; visualizzazione grafico &#34; e selezionare &#34; Rimuovi Peak &#34;. 
		Nota: ad esempio, la scala di biotinylated utilizzata per il 12-230 kDa kit dovrebbe mostrare 12, 40, 66, 116, 180 e 230 kDa picchi di ridimensionamento. Se questo passaggio non viene eseguito, il dimensionamento dei picchi del campione sarà calcolato in modo errato, producendo risultati spuri.</li>
		<li>Vista e analizzare i picchi del campione. Derivano i dati dalla tabella di vette, tra cui peso molecolare, area di picco, picco alto e segnale-rumore (S/N), come necessario per calcoli sperimentali.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari. Questo manoscritto è stato recensito dal National Health and Environmental Effects Research Laboratory e approvato per la pubblicazione. Il contenuto non riflette necessariamente le opinioni di EPA né menzione di marchi o prodotti commerciali costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.

Per decenni, c'è stato interesse costante nello sviluppo di metodi di immunoassay basati su elettroforetico capillare a causa basso dispendio campioni e reagenti, è diminuito di elaborazione tempo rispetto ai metodi tradizionali e ad alta compatibilità per automatizzare la procedura4,15. Ci sono un certo numero di diversi protocolli per la separazione delle proteine che hanno utilizzato i capillari, tra cui polimero elettroforetico, elettrocinetico, setacciatura e metodi isoelettrici, che isolare proteine dalle proprietà differenti (rispettivamente, carica elettrostatica, equilibrio di partizione, setacciatura proprietà della matrice separazione e pH)16. Qui, descriviamo un anticorpo-basato (o immunologico) metodo di elettroforesi capillare, utilizzando un polimero vagliatura separazione, che è stato automatizzato e commercialmente adottati3. Vantaggi di questo sistema sono la facilità di utilizzo e funzionamento, standardizzati e commercialmente disponibili reagenti e misurazioni affidabili, sensibili che richiedono meno reagenti e campioni rispetto all'analisi tradizionale proteina come macchia occidentale, immunoassay enzima-collegato e altri formati3,4,5. È stato osservato nelle precedenti valutazioni di questa tecnologia che l'intervallo di grandezza di proteina che può essere valutata è stato limitato dalla separazione disponibili matrice4, tuttavia recenti offerte hanno ampliato la gamma misurabile da 2 a 440 kDa17 . Inoltre, alcuni buffer di lisato sono noti per essere incompatibile con il saggio18, quindi selezione dei reagenti sperimentali utilizzato deve essere considerata in anticipo.
Un vantaggio principale di una procedura automatizzata con componenti disponibili in commercio è la coerenza dei risultati attraverso metodi standardizzati e reagenti. Questo riduce al minimo le probabilità di errore di dosaggio automatizzando i passaggi critici all'interno della routine. Tuttavia, è importante notare che certe pratiche devono essere rispettati durante il protocollo per ridurre al minimo i problemi con l'immunodosaggio basato su elettroforetica capillare. In primo luogo, è fondamentale che la miscela di luminol-S/perossido è preparata fresco e immediatamente prima di carico su piastra. Temporizzazione coerente si tradurrà in luminescenza coerenza dopo aver aggiunto l'agente ossidante, che si tradurrà in misure coerenti per un dosaggio anticorpo particolare termine dosaggio. Inoltre, è importante che vengano utilizzati i reagenti non scaduto, che colpisce principalmente la potenza dell'agente ossidante. Inoltre, è importante che l'ordine di caricamento dei campioni, anticorpi e altri reagenti essere rigorosamente rispettata (Vedi Figura 1). Qualsiasi reagente pipettato fuori luogo si tradurrà in errore di dosaggio e una corsa sprecata.
Oltre a questi passaggi critici, principali problemi sperimentati con la tecnica generalmente possono essere superati attraverso l'ottimizzazione. Infatti, queste condizioni sono specifiche per ogni combinazione di sistema/anticorpo modello e pertanto dovrebbero essere determinate empiricamente per ogni nuovo dosaggio. In questo articolo, ci concentriamo su tre comuni procedure di ottimizzazione: tempo di esposizione, la titolazione lisato e la diluizione di anticorpo primario. La capacità di generare risultati misurabili dipende dalle analisi di un tempo di esposizione quando il substrato di luminol non è stanno rapidamente esaurendo, come risultati di svuotamento di substrato in perdita di segnale. Lisato titolazione determina l'intervallo dinamico lineare di ogni dosaggio, che può differire da con sistemi di modello diverso, così come gli anticorpi differenti, anche per lo stessa proteina bersaglio. Diluizioni di anticorpo scelti a o vicino a saturare le concentrazioni garantiscono cambiamenti nel segnale non ne risentiranno di una carenza di anticorpi liberi, ma solo da diverse quantità di proteina disponibile destinazione epitopo. Altre considerazioni durante il processo di ottimizzazione possono includere il tempo di incubazione dell'anticorpo e accatastamento/campione tempo di caricamento. Nella maggior parte dei casi le impostazioni predefinite per lo strumento offrono il miglior equilibrio tra risoluzione e sensibilità. Tuttavia, in alcuni casi, scarsa risoluzione o sensibilità può essere migliorata mediante la regolazione di questi parametri.
Metodi di immunoassay basati su elettroforetico capillare forniscono misurazioni proteina veloce, efficace e riproducibile. Mentre questi metodi sono stati utilizzati principalmente nelle impostazioni di ricerca e sviluppo, la coerenza di queste tecnologie ha potenziale utilità nelle applicazioni cliniche e regolamentazione. Ad esempio, l'identificazione di sottopopolazioni suscettibili di tossici ambientali o pazienti con progressione della malattia può essere basato su proteine biomarcatori misurati in matrici accessibile come sangue, urine e saliva. Come reagente e goccia di costi di operazione e il numero di campioni e gli obiettivi che possono essere valutati contemporaneamente aumenta, probabilmente vedremo metodi di immunoassay di basati su elettroforetico capillare utilizzati per questi tipi di applicazioni.

Test immunologici mediante elettroforesi capillari misurano l'espressione della proteina in lisati cellulari utilizzando sistemi di separazione di dimensione o carica e offrono numerosi vantaggi rispetto i tradizionali test immunologici. Ad esempio, rispetto alla macchia occidentale, la procedura automatizzata basata su capillare elimina la necessità di gel, dispositivi di trasferimento, e manuale di lava. Inoltre, la quantità assoluta di proteine necessaria è circa 10 volte meno, rendendo i sistemi basati su capillare ideale per l'utilizzo con i tipi di cellule rare o campione limitato1,2. Risultati sono ottenuti in meno di 3 h utilizzando sistemi automatizzati e precedentemente sono stati dimostrati più quantitativa e riproducibile di convenzionale western blot procedure3,4,5. Il processo per saggi basati su dimensioni consiste di caricamento campioni contenenti sodio dodecil solfato (SDS), ditiotreitolo (DTT) e fluorescente etichettati marcatori di peso molecolare in colonne capillari contenenti matrici di accatastamento e separazione. Tensione applicata ai capillari separa le proteine in campioni in base alla dimensione, e luce UV immobilizza le proteine separate per la parete capillare. Il capillare è quindi immuno-sondato con specifica della destinazione primario dell'anticorpo e rafano perossidasi (HRP)-anticorpo secondario coniugato. Luminol e perossido di catalizzare chemiluminescente generazione di luce che è misurata da una telecamera di charge coupled device (CCD) ed analizzati per quantificare le proteine.
Nonostante la relativa facilità e la velocità di una piattaforma di dosagggio immunologico automatizzato basato su capillare elettroforetica, ottimizzazione di metodiche quali concentrazione proteica, diluizione dell'anticorpo e tempo di esposizione è importante per ottenere accurate, riproducibili risultati. In generale, è necessario eseguire le procedure seguenti per ottimizzare un dosaggio per questi sistemi:
1) uno schermo deve essere eseguito per valutare e scegliere gli anticorpi per segnale e specificità per il proteina bersaglio. Se disponibile, la proteina purificata o epitopo target può essere utilizzato per valutare la specificità; Tuttavia, è ancora importante valutare potenziali segnale aspecifico in proteine totali proveniente dal sistema di modello.
2) successivamente, la gamma dinamica del dosaggio deve essere determinato. In una situazione ideale, segnale raddoppio (misurato utilizzando area di picco) è osservato come la concentrazione del campione è raddoppiata; Tuttavia, in pratica, un cambiamento proporzionale a segnale di input in modo prevedibile (ad es., lineare adatta) è sufficiente per la quantificazione della proteina. Inoltre, questa ottimizzazione definirà la concentrazione di proteine con segnale alto ma ancora all'interno della gamma lineare per il modello sperimentale.
3) determinare la concentrazione di anticorpi ottimale utilizzando la concentrazione nella proteina fisso selezionata in fase di ottimizzazione 2. Come la concentrazione di anticorpi, il segnale aumenta fino a quando esso altipiani a saturazione. Una concentrazione di anticorpi vicino a questo livello di saturazione è necessaria per la misura accurata di concentrazione nella proteina.
Il processo utilizzato per ottimizzare le concentrazioni della proteina, diluizioni di anticorpo e tempi di esposizione per un di dosaggio automatizzato basato su capillare dimensione6 è dimostrato usando gli estratti di cellule intere isolati da BEAS-2B, un essere umano SV-40 trasformato bronchiale linea cellulare epiteliale. Isolamento della proteina dagli estratti delle cellule o del tessuto può essere eseguita utilizzando un numero di protocolli pubblicati7,8,9 e non sarà coperti qui. Risultati di un esperimento di prova utilizzando le condizioni ottimizzate sono inoltre segnalati per totale e fosforilate (serina 15, Serina 20) p53 nelle culture esposte a doxorubicina (un agente chemioterapeutico comune che induce l'apoptosi di cellule10) a 1.2, 1.8, e 2,4 media µ g/mL per 4 h prima del raccolto. Le aree di picco di p53 sono normalizzate a ɑ-tubulina, che è usato come un controllo di carico.

<table><tbody><tr><td>Wes instrument</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td>004-600</td><td></td></tr><tr><td>P53 DO-1 anticorpo primario</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-126</td><td></td></tr><tr><td>p53 fosforilato (ser 15) anticorpo primario</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9286</td><td></td></tr><tr><td>p53 fosforilato (ser 20) anticorpo primario</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9287</td><td></td></tr><tr><td>alfa-tubulina anticorpo primario</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3873</td><td>utilizzata come controllo del carico</td></tr><tr><td>Compass Software</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td></td><td>fornito con il</td></tr><tr><td>kit Wes 12-230 kDa Master</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&nbsp;</td><td>PS MK02 (da allora sostituito da un nuovo kit #)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td><td>INCLUDE CODICE: Tampone di lavaggio (60 mL) 042-202 10X Tampone per campioni (440 &mu; L) 042-195 Micropiastre preriempite (8) PS-PP01 Cartucce capillari (8) PS-CC01 Diluente anticorpale II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1,5 mL) 042-233 Perossido (1,5 mL) 042-234 Streptavidina-HRP (132 &mu; L) 042-414 Confezione standard (8): scala biotinilata, master mix fluorescente 5X, DTT e provetta vuota da 0,6 mL PS-ST01 Anticorpo secondario anti-coniglio 042-206 o Anticorpo secondario anti-topo 042-205<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Nome&nbsp; </td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Coltura cellulare, trattamento e raccolta (utilizzando i protocolli consigliati dal fornitore; protocolli non inclusi nel manoscritto)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule BEAS-2B</td><td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>terreno di coltura per cheratinociti, KGM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basilea, Svizzera)</td><td>192152</td><td>per coltura cellulare</td></tr> terreno <tr><td>basale per cheratinociti, KBM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basilea, Svizzera)</td><td>192151</td><td>terreno privo di siero per il dosaggio chimico di</td></tr><tr><td>doxorubicina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Bradford Assays</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>23200</td><td>per la quantificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Kit per estratti nucleari</td><td>Motivo attivo (Carlsbad, CA)</td><td>D1515</td><td>utilizzato per preparare lisati</td></tr><tr><td></td><td></td> di cellule intere <td>INCLUDE:</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Tampone di lisi AM1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1M ditiotreitolo (DTT)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Cocktail</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> di inibitori della proteasi <td>10X PBS& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Inibitori della</td><td></td> fosfatasi</tr></tbody></table>

procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato immunoassay basati su elettroforetica capillare

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Nuove tecnologie che utilizzano test immunologici basati su capillare promettono valutazione più veloce e più quantitativa della proteina rispetto ai tradizionali test immunologici. Tuttavia, simile ad altri dosaggi di proteina anticorpo-basato, ottimizzazione dei parametri di base capillare immunoassay, quali concentrazione proteica, diluizione dell'anticorpo e tempo di esposizione è un presupposto importante per la generazione di significativo e affidabile dati. Misure devono rientrare all'interno della gamma lineare del dosaggio dove sono direttamente proporzionali ai cambiamenti nella concentrazione di lisato cambiamenti nel segnale. Il processo di scelta di concentrazioni adeguate di lisato, diluizioni di anticorpo e tempi di esposizione in linea di cellule epiteliali bronchiali umane, BEAS-2B, è dimostrato qui. Linearità di dosaggio è indicato sopra una gamma di concentrazioni di proteina intera cellula Estratto con gli anticorpi p53 e α-tubulina. Un esempio del burnout segnale è visibile alle più alte concentrazioni con tempi di esposizione lunghi, e una curva di diluizione dell'anticorpo di α-tubulina è mostrata dimostrando la saturazione. Inoltre, risultati sperimentali di esempio sono riportati per cellule trattate con doxorubicina utilizzando parametri ottimizzati.

Tempo di esposizione - Burnout di segnale di determinazione
Burnout di segnale può verificarsi quando il substrato di luminol e perossido si esaurisce troppo rapidamente. Questo può essere determinato esaminando i dati in tempi di esposizione differenti chemiluminescenza. Nel software di analisi, vai a "Modifica – &#62; analisi – &#62; immagini". Le esposizioni vanno da 5 a 480 s. L'asse y in un elettroferogramma rapporti segnale/tempo, quindi i dati da ogni esposizione dovrebbero avere un simile coefficiente di segnale/tempo. Questo coefficiente diminuisce con esposizioni in sequenza più lunghe se luminol si esaurisce, come si è visto con l'anticorpo di DO-1 di p53 (Figura 2). A causa di svuotamento del substrato, questo test può essere considerato misurabile fino alla concentrazione di 0,2 µ g / µ l solo presso le esposizioni di s di 5-30. Pertanto, in questo esempio, 15 s è stato determinato per essere il tempo di esposizione ottimale dei dati analisi per p53.
Titolazione lysate - Determinazione del range dinamico lineare
È importante che misure all'interno della gamma dinamica lineare di ogni dosaggio, dove cambiamenti nel segnale come misurato dall'area del picco sono proporzionali ai cambiamenti nella quantità di proteine nel campione. Utilizzando il tempo di esposizione ottimale di 15 scelti di s nella sezione precedente, dosaggio linearità è dimostrata per p53 sia ɑ-tubulina sopra maggiore di un intervallo di 15 volte della concentrazione (Figura 3). Nella nostra esperienza, un valore di2 R di &#62; 0,9 di una regressione lineare adatta è considerato accettabile per un intervallo di diluizione della proteina purificata di quantità nota (se il test è una misura quantitativa assoluta) o campione lisato di proteina bersaglio sconosciuto (se dosaggio è una misura quantitativa relativa).
Ottimizzazione della diluizione di anticorpo
Usando gli anticorpi a saturare le concentrazioni aiuta a garantire che eventuali cambiamenti del segnale misurati sono dovuti solo a cambiamenti nella quantità di proteine. Come dimostrazione, due varietà di cellula BEAS-2B intera cellula estrae (0,2 µ g / µ l proteine totali caricati nel dosaggio) erano sondato con concentrazioni di anticorpo diluito serialmente ɑ-tubulina che vanno da 01:25 - 1: 800 (Figura 4). Segnale a chemiluminescenza (qui, misurata come area di picco) è stata tracciata contro la diluizione dell'anticorpo. Saturazione è stata osservata vicino il 01:50 diluizione dove la curva inizia un altopiano evidente.
Prova sperimentale - trattamento di doxorubicina in cellule BEAS-2B
Utilizzando condizioni di dosaggio ottimizzato, coltura cellulare BEAS-2B è stato trattato con tre differenti concentrazioni di doxorubicina (1.2, 1,8 e 2,4 µ g/mL) per 4 h (Figura 5, tabella 1). Attivazione di p53 attraverso modifiche post-traduzionali media diverse risposte cellulari, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, senescenza e apoptosi12. In particolare, la fosforilazione della serina 15 è stata attribuita all'attivazione trascrizionale di p53, con conseguente apoptosi dopo doxorubicina trattamento13. In questa dimostrazione, ɑ-tubulina normalizzati picco aree vengono presentati come piega del controllo. È interessante notare che, 3.5 a 4 falde aumenti in p53 fosforilazione in serina sono stati osservati aumenti 15 e 2 volte nel livello di p53 fosforilata in serina 20 dopo l'esposizione di 4 h a doxorubicina. Questi risultati indicano l'attivazione di p53; Tuttavia, nessuna dose-risposta è visto per le concentrazioni scelte (al contrario, la dose più bassa testata ha suscitato la risposta più alta). Totale p53 non hanno dimostrato una risposta al trattamento chiaro in questo modello. In precedenza abbiamo osservato l'attivazione di p53 fosforilazione in assenza di aumento dei livelli di p53 totale in condizioni simili in zinco-trattati BEAS-2B cellule14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figura 2 . Confronto di immagini di esposizione per rilevare segnale burnout. Lane viste Visualizza diminuire le concentrazioni di proteina per BEAS-2B lisati sondato con p53 DO-1 anticorpo ad una diluizione di 1: 500. Coefficienti di segnale di chemiluminescenza, segnalati come altezze dei picchi nel software dello strumento, si sovrappongono. A differenza delle altezze dei picchi, le intensità di visual band sono generate automaticamente e regolate dallo strumento per facilitare la visualizzazione delle bande e sono quindi non confrontabili da un pannello a altro. Nota: la diminuzione del segnale di chemiluminescenza come aumento del tempo di esposizione, con il segnale di inizio a scomparire (picco di Spalato) presso le due esposizioni più lunghe, che indica lo svuotamento del substrato. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figura 3 . Titolazione lysate Mostra le visualizzazioni di corsia. Lisato titolazione mostrando la corsia viste (A) di BEAS-2B lisato quando sondato con 1: 500 p53 DO-1 o 01:50 ɑ-tubulina. A differenza di valori di zona di picco, le intensità di visual band sono generate automaticamente e regolate dallo strumento per facilitare la visualizzazione delle bande e sono quindi non confrontabili da un pannello a altro. Analisi di regressione lineare (B) conferma che i dosaggi sono lineari su tutta la gamma testata, da 0,01 a 0,20 µ g / µ l e 0.025 a 0,40 µ g / µ l, con valori di R2 di 0,999 e 0.985, rispettivamente. Le concentrazioni di proteine totali nel mezzo della gamma lineare sono stati scelti per ospitare la potenziale variazione di proteina bersaglio in entrambe le direzioni (per esempio, 0,2 µ g / µ l per α-tubulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figura 4 . Diluizione di anticorpo α-tubulina curve per due lysates di proteina BEAS-2B separato con e senza normalizzazione della linea di base. Una partenza definitivature da linearità è visto presso il 01:50 (0,02) diluizione, che indica la saturazione. 01:50 quindi è stato scelto come la diluizione ottima per questo anticorpo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Nella figura 5. Effetto del trattamento di doxorubicina (DXN) 4 h su totale e serina fosforilata espressione della proteina p53 delle cellule BEAS-2B. Le aree dei picchi sono normalizzate a α-tubulina e tracciate come piega del controllo (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabella 1. Effetto del trattamento di doxorubicina (DXN) 4 h su totale e serina fosforilata espressione della proteina p53 delle cellule BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.</a>

È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell'anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un'analisi immunologica mediante elettroforesi capillare utilizzando una piattaforma commerciale. Questa piattaforma distinguerà e quantificherà bersagli proteici provenienti da un campione biologico ottenibile da tessuti di colture cellulari e fluidi biologici. Il processo analizza le proteine in base alla dimensione, che varia da due a 440 chilodalton.Il vantaggio di questa procedura automatizzata rispetto alle procedure tradizionali, come il Western blot, è che i saggi immunoanalitici elettroforetici capillari eliminano la necessità di gel, dispositivi di trasferimento e lavaggi manuali. Inoltre, la quantità assoluta di proteina richiesta è circa 10 volte inferiore, rendendo la procedura ideale per tipi cellulari rari o campioni limitati. In aggiunta, i risultati si ottengono in appena tre ore utilizzando sistemi automatizzati e si è dimostrato che siano più quantitativi e riproducibili rispetto alle procedure convenzionali di Western blot.Preparare i campioni e i reagenti del kit, inclusi il buffer per campioni, il ditiotreitolo, la miscela maestra fluorescente e la scala biotinilata, seguendo le istruzioni del produttore. Preparare i campioni proteici utilizzando il metodo preferito. In questo caso, abbiamo isolato l'estratto totale da colture cellulari BEAS-2B.Diluire i campioni proteici con il buffer campione. Mescolare una parte di master mix fluorescente 5X con quattro parti di campione diluito per ottenere la concentrazione proteica finale desiderata. Di seguito è riportato un esempio di calcolo per preparare 70 microlitri di soluzione con concentrazione proteica finale di 0,2 microgrammi per microlitro, partendo da una soluzione madre di proteina con concentrazione di 1,2 microgrammi per microlitro.Il master mix corrisponde a 1/5 del volume totale, in questo caso 14 microlitri. Per calcolare il volume di stock proteico necessario, moltiplicare la concentrazione finale desiderata per il volume totale e dividere per la concentrazione dello stock proteico. Sottrarre i volumi del master mix e dello stock dal volume totale per calcolare il volume del buffer campione.Denaturare i campioni preparati e la scala molecolare riscaldando a 95 gradi centigradi per cinque minuti. Nota: alcune proteine potrebbero richiedere condizioni di denaturazione più delicate. Ad esempio, 70 gradi per 10 minuti per prevenire l'aggregazione proteica e migliorare la migrazione.Valutare questa opzione se è presente una marcata diffusione alle alte masse molecolari. Preparare le diluizioni desiderate degli anticorpi nel diluente fornito. Si noti che gli anticorpi vengono generalmente utilizzati a concentrazioni più elevate per il saggio immunoanalitico capillare rispetto alla blotting tradizionale di tipo Western.Preparare una miscela uno a uno di luminolo e perossido, fresca ad ogni utilizzo. Pipettare i campioni e i reagenti nella piastra del saggio utilizzando i volumi indicati nel modello. La codifica a colori rappresenta il corretto caricamento di reagenti e campioni nella piastra del saggio.Aggiungere con pipetta la scala biotinilata nel pozzetto A1, i campioni preparati nei pozzetti da A2 ad A25. Aggiungere il diluente per anticorpi fornito nei pozzetti da B1 a B25 e nel pozzetto C1. Aggiungere l'anticorpo primario nei pozzetti da C2 a C25. Aggiungere la streptavidina HRP nel pozzetto D1. Aggiungere l'anticorpo secondario nei pozzetti da D2 a D25.Aggiungere la miscela di luminolo e perossido alle pozzette E1-E25. Aggiungere il tampone di lavaggio alle prime tre file delle pozzette centrali più grandi. Accendere lo strumento per saggio immunoanalitico capillare e aprire il software associato.Caricare il cartuccia capillare e la piastra del saggio nella macchina seguendo le istruzioni del produttore ed avviare la corsa. Al termine della corsa, verificare che gli standard fluorescenti siano stati correttamente identificati e correggere se necessario. Inoltre, accertarsi che la scala biotinilata mostri i picchi di dimensionamento corretti per il kit utilizzato.Per ulteriori dettagli, consultare la guida rapida del produttore o il manuale del prodotto. L'ottimizzazione delle condizioni del saggio, come il tempo di esposizione, la concentrazione delle proteine e la diluizione degli anticorpi, è fondamentale per ottenere risultati accurati e riproducibili. Queste condizioni sono specifiche per ogni combinazione di sistema modello e anticorpo e, pertanto, devono essere determinate empiricamente per ogni nuovo saggio.La capacità di generare risultati quantitativi dipende dall'analisi di un tempo di esposizione in cui il substrato luminolo non viene rapidamente esaurito, poiché l'esaurimento del substrato provoca una perdita del segnale o un'esaurimento del segnale stesso. Questo può essere determinato esaminando i dati a diversi tempi di esposizione chemiluminescente, come mostrato nella figura due. I tempi di esposizione con lo strumento utilizzato variavano da cinque a 480 secondi.Le immagini dei gel hanno mostrato una concentrazione proteica decrescente per gli estratti di BEAS-2B sottoposti a sonda con l'anticorpo p53 DO-1 a un diluizione di uno a 500. I coefficienti del segnale chemiluminescente, riportati come altezza dei picchi nel software dello strumento, sono sovrapposti. Le intensità delle bande visive vengono regolate automaticamente dallo strumento e non sono confrontabili da un pannello all'altro.Il coefficiente del segnale diminuisce con esposizioni progressivamente più lunghe se il luminolo si esaurisce, come osservato in questo caso. Il segnale inizia a scomparire e il picco si divide alle due esposizioni più lunghe. Per questo motivo, per l'analisi dei dati è stato scelto un tempo di esposizione breve di 15 secondi.L'input totale di proteine deve essere ottimizzato anche per ogni saggio e sistema modello specifico. Per una valutazione quantitativa, le misurazioni devono essere effettuate entro il range dinamico lineare di ciascun saggio. In tali condizioni, le variazioni del segnale, misurate in base all'area del picco, sono proporzionali alle variazioni nella quantità di proteina nel campione.La titolazione del lisato mostra le immagini delle corsie di lisato BEAS-2B quando sottoposto a sonda con anticorpo p53 DO-1 da uno a 500 o con anticorpo alpha-Tubulina da uno a 50. L'analisi di regressione lineare conferma che i saggi sono lineari sull'intero intervallo testato. Le concentrazioni totali di proteine al centro dell'intervallo lineare sono state scelte per accomodare eventuali variazioni della proteina bersaglio in entrambe le direzioni.Come considerazione finale di ottimizzazione, va valutata la corretta diluizione dell'anticorpo primario. L'uso di anticorpi a concentrazioni sature aiuta a garantire che eventuali variazioni del segnale misurate siano dovute esclusivamente a cambiamenti nella quantità di proteina. Due campioni proteici di BEAS-2B, rappresentati dai punti blu e arancioni, sono stati sottoposti a saggio con anticorpo anti-alpha-Tubulin diluito in serie.Il segnale di chemiluminescenza, misurato come area del picco, è stato riportato in funzione della diluizione dell'anticorpo. È stata osservata saturazione intorno alla diluizione da uno a 50, dove la curva inizia un plateau evidente. Pertanto, la diluizione da uno a 50 è stata scelta come diluizione ottimale per questo anticorpo.Dopo aver guardato questo video, dovresti sentirti a tuo agio nel preparare i campioni, caricarli ed eseguire l'analisi sull'apparecchio immunoanalitico basato su capillari ProteinSimple Wes. Una volta padroneggiata questa procedura, l'intera corsa può essere eseguita in tre ore con 25 campioni. Quando si analizza una corsa, è importante eseguire un controllo di qualità per ogni capillare e campione.Questo include la verifica degli standard fluorescenti in una scala biotinilata. Se i picchi sono identificati in modo errato, il software di analisi deve essere utilizzato principalmente per identificare correttamente i picchi ed eliminare quelli identificati in modo errato. Come per tutte le tecniche di biologia molecolare in laboratorio, indossare dispositivi di protezione individuale adeguati per proteggere sia se stessi che i campioni.Questo include camice da laboratorio, guanti, occhiali di sicurezza e scarpe chiuse. È importante tenere presente che l'ottimizzazione deve essere eseguita per ogni nuovo bersaglio misurato o quando si utilizzano diverse fonti di campione. I passaggi di validazione e di verifica includono la valutazione della specificità dell'anticorpo e del segnale mediante proteina purificata o epitopo.Verifica dell'intervallo dinamico del saggio mediante una serie di diluizioni del campione e ottimizzazione della diluizione dell'anticorpo valutando la saturazione del segnale in un intervallo di concentrazioni di anticorpo. Una volta ottimizzato, questo metodo immuno capillare dovrebbe fornire un approccio più rapido e quantitativo per la misurazione della proteina bersaglio in campioni biologici rispetto ai metodi tradizionali come il Western blot.

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