Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la posizione cromosomica ottimale di un dato elemento di DNA utilizzando l'inserimento casuale mediato da trasposoni, esperimenti di competizione e sequenziamento dell'intero genoma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della replicazione del DNA, come l'importanza della posizione cromosomica di un elemento genetico. Il vantaggio di questa tecnica è che accoppia l'inserzione casuale basata su trasposoni con la selezione del clone più adatto in base al vantaggio di crescita.

Qui, è semplificato dalla regione DARS2 di E.coli. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione cromosomica di Escherichia coli, può essere applicato anche ad altri batteri. Dopo aver preparato celle elettrocompetitive come MG1655 delta DARS2 secondo il protocollo di testo, aggiungere un microgrammo di pNKBOR DARS2 a 40 microlitri di cellule e trasferire la miscela in una cuvetta sterile pre-raffreddata con distanza di 0,2 centimetri.

Inserire la cuvetta nella camera di elettroporazione. Quindi, elettroporare le celle a 18 kilovolt, 500 ohm e 25 microfarad. La costante di tempo dovrebbe essere di circa cinque millisecondi e non dovrebbero verificarsi archi elettrici.

Recuperare rapidamente la sospensione batterica rimettendola in un millilitro di brodo LB preriscaldato e trasferirla in una provetta da 15 millilitri. Incubare le cellule in condizioni di crescita aerata a 37 gradi Celsius per 30 minuti senza selezione di antibiotici. Quindi, impiattare i batteri sulle piastre di agar LB integrate con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina e incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, contare le colonie dall'elettroporazione. Una colonia è considerata uguale a un'inserzione cromosomica del trasposone. Aggiungere un millilitro di brodo LB a ogni piatto e lavare via tutte le colonie.

Riutilizzare lo stesso millilitro di brodo LB per aumentare la concentrazione batterica. Quindi, raccogli tutte le colonie nello stesso tubo da 50 millilitri. Agitare il tubo per congelare il materiale di partenza e mescolare un millilitro di sospensione cellulare con un millilitro di glicerolo al 50% su ghiaccio.

Trasferire i tubi nel ghiaccio secco per 10 minuti. Una volta che le colture sono congelate, trasferiscile in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi. Scongelare la libreria dei trasposoni da negativi 80 gradi Celsius sul ghiaccio.

Miscelare mediante pipettaggio, quindi trasferire 100 microlitri della libreria dei trasposoni in 10 millilitri di LB in una provetta da 15 millilitri. Far crescere le cellule aerate con agitazione continua a 37 gradi Celsius per otto ore fino alla fase stazionaria. Regolare i parametri in base alle diverse condizioni di crescita in base alle esigenze.

Per propagare la popolazione batterica circa ogni 10 generazioni, trasferire 10 microlitri della fase precedentemente stazionaria in 10 millilitri di terreno fresco preriscaldato e far crescere la coltura per altre otto ore fino alla fase stazionaria. Dopo ogni 100 generazioni di competizione, salva cinque campioni da un millilitro e conservali a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Preparare la sonda per il Southern blot contro una sezione di un kilobyte dell'NKBOR mediante amplificazione PCR utilizzando primer specifici come elencato qui.

Eseguire gli esempi utilizzando il programma seguente. Etichettare il frammento di PCR risultante con dATP marcato con P32 utilizzando il sistema di primer casuale secondo Smith e preparare il DNA cellulare totale secondo il protocollo di testo. Digerire il DNA cellulare totale con Pvul che taglia NKBOR contenente la regione di interesse al di fuori di una regione coperta dalla sonda.

Eseguire un Southern blot utilizzando gel di agarosio allo 0,7% secondo Loebner-Olsen e von Freiesleben. Per identificare i siti di inserzione di DARS2 da singoli cloni, dopo 700 generazioni stimate di competizione, isolare il DNA genomico per il modello PCR diffondendo prima i batteri su una piastra di agar LB e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Inoculare il brodo LB con singole colonie e coltivarle durante la notte a 37 gradi Celsius.

Quindi, trasferire 20 microlitri in 200 microlitri di acqua distillata autoclavata. Agitare le colonie in soluzione, quindi riscaldare la miscela a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare i campioni alla massima velocità per cinque minuti, quindi conservare il lisato cellulare a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per un uso futuro.

Quindi, progetta tre primer nidificati per ricuocere all'interno del trasposone di scelta come mostrato qui. Utilizzare 200 nanogrammi di DNA genomico, un primer nidificato e un primer casuale per preparare una reazione PCR da 20 microlitri. Quindi, eseguire gli esempi utilizzando il programma seguente.

Per la seconda amplificazione, utilizzare un microlitro della prima reazione come modello e utilizzare il primer nidificato due e lo stesso primer casuale. Eseguire una terza reazione in modo simile utilizzando il primer annidato tre, lo stesso primer casuale e un microlitro dalla seconda reazione del modello. Eseguire i prodotti della reazione finale di PCR su un gel di agarosio all'1,5% e statina con bromuro di etidio.

Ritaglia una fascia nell'intervallo da 100 a 800 paia di basi e isola il DNA utilizzando qualsiasi kit di estrazione del gel di DNA commerciale secondo le indicazioni del produttore. Per effettuare la citometria a flusso, bilanciare ogni coltura batterica mantenendola nella fase di crescita esponenziale per almeno 10 generazioni. Misurare l'OD600 e assicurarsi che non superi mai 0,3.

Per eseguire l'esaurimento della rifampicina secondo il protocollo di testo, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da 15 millilitri contenente 30 microlitri di RIF-CEF. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius agitando per un minimo di quattro ore. Per il campione EXP, trasferire un millilitro di coltura a crescita esponenziale in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio.

Quindi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 15.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Risospendere il pellet in 100 microlitri di tris 10 millimolari ghiacciati pH 7,5 e aggiungere un millilitro di etanolo ghiacciato al 77%. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Colorare le cellule raccogliendo da 100 a 300 microlitri di cellule fissate mediante centrifugazione a 15.000 volte G per 15 minuti. Rimuovere il surnatante e utilizzare 130 microlitri di soluzione colorante del DNA per risospendere il pellet. Quindi, incubare i campioni su ghiaccio e al buio per 10 minuti.

Infine, utilizzare la citometria a flusso per determinare l'origine per cellula, la massa cellulare relativa e il contenuto di DNA relativo. Dopo l'estrazione del DNA dal pool iniziale di trasposoni e ogni circa 100 generazioni su 700 di competizione, il DNA è stato tagliato con Pvul, che è noto per tagliare il trasposone NKBOR DARS2 una volta in una regione non coperta dalla sonda ed è stato eseguito un Southern blot. Come mostrato qui, il pool iniziale di DARS2 mancava di bande distinte, il che dimostra che DARS2 è stato inserito in modo casuale in tutto il cromosoma.

Nel corso del tempo, è emerso un modello in cui il grande pool iniziale di cloni DARS2 si è sviluppato in uno o pochi cloni DARS2 persistenti. Il sequenziamento dell'intero genoma è stato utilizzato per identificare i siti di inserzione di DARS2 dal pool iniziale. E dopo 400, 500 e 700 generazioni di competizione in un sottogruppo rappresentativo di inserzioni sequenziate, il 98% di tutte le inserzioni di DARS2 è stato trovato vicino alla posizione cromosomica di DARS2 wild type.

E il 2% è stato trovato altrove sul cromosoma. In precedenza era stato dimostrato che le cellule carenti di DARS2 avviavano la replicazione in sincronia e avevano una diminuzione della concentrazione di origine rispetto alle cellule wild-type. Qui, la presenza di un elemento DARS2 nel terminale non ripristina la sincronia o il contenuto di origine cellulare a livelli wild-type, mentre i cloni DARS2 selezionati IR e RPPH avviano la replicazione in sincronia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la posizione cromosomica ottimale di un determinato elemento del DNA. Questo viene fatto mediante inserzioni casuali basate su trasposoni, seguite da esperimenti di competizione e infine dal sequenziamento dell'intero genoma.