Name: Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Scopri come determinare la posizione cromosomica ottimale di elementi DNA in Escherichia coli usando inserzione casuale mediata da trasposone, esperimenti di competizione e sequenziamento del genoma.

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Gli autori sono stati finanziati mediante sovvenzioni della Fondazione di Novo Nordisk, la Fondazione di Lundbeck e il Danish National Research Foundation (DNRF120) attraverso il centro per batterica risposta allo Stress e persistenza (BASP).

1. collezione della biblioteca Transposon Nota: il locus DARS2 cromosomico è stato clonato nel mini Tn 10-base di trasposoni, NKBOR (il pNKBOR) 21, conseguente NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR può essere ottenuta online 22. pNKBOR è un vettore basato su R6K suicidio che richiede l'iniziatore della proteina π per replica 23. Plasmide pJFM1 è quindi in grado di replicare in un ceppo di e. coli (ad es., Dh5α λ pir) contenente una copia cromosomica del gene di pir. Tuttavia, quando pJFM1 si trasforma nel Pir-carenti wildtype MG1655, pJFM1 non può replicare, che portano alla selezione di cloni resistenti alla kanamicina generati da operazioni di inserimento casuale di NKBOR:: DARS2 nel cromosoma batterico. Per semplicità, questi sono denominati DARS2 inserimenti. Vedere la Figura 1 per una presentazione schematica della metodologia.
<ol><li>Δ electrocompetent MG1655 preparare DARS2 da attivamente sviluppando celle in brodo Lisogenesi (LB), cresciuta a 37 ° C 24.</li>
	<li>Electroporate pJFM1 in Δ di electrocompetent MG1655 DARS2, secondo Gonzales et al. 24 <ol><li>aggiungere 1 µ g di pJFM1 (a 1 µ l di acqua) a 40 µ l di electrocompetent Escherichia coli MG1655 Δ DARS2 e trasferire questo composto in una cuvetta pre-refrigerati, sterile divario di 0,2 cm. Inserire la provetta nella camera di elettroporazione. Electroporate alle 18 kV, Ω 500 e 25 µF; la costante di tempo deve essere ~5.0 ms e nessun arco deve verificarsi.</li>
		<li>Recuperare rapidamente la sospensione batterica da esso risospendere in 1 mL di brodo LB pre-riscaldato e trasferimento in una provetta da 15 mL.</li>
		<li>Lasciare che le celle recuperare incubando in condizioni di crescita aerato a 37 ° C per 30 minuti, senza selezione antibiotica. I batteri su piastre di agar LB completati con kanamicina 50 µ g/mL di piastra e incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	</ol></li> <li>Contare le colonie dall'elettroporazione: una colonia è considerata uguale a un'inserzione cromosomica trasposone. 
	Nota: Le colonie possono essere contati dall'occhio o con un contatore di Colonia. Il numero di colonie è inversamente proporzionale alla distanza media che separa i trasposoni situati nel cromosoma di ogni clone.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di brodo LB a ciascuna piastra e lavare via tutte le colonie; 1 mL di brodo LB dovrebbe essere sufficiente per lavare via ~ 100.000 colonie. Riutilizzare la stessa 1 mL di brodo LB per aumentare la concentrazione batterica. Piscina tutte le colonie nello stesso tubo 50 mL.</li>
	<li>Vortex il tubo e congelare il materiale di partenza (t = 0). Per congelarlo, mescolare 1 mL di sospensione cellulare con 1 mL di glicerolo al 50% su ghiaccio. Trasferire le provette per asciugare il ghiaccio per 10 min. Una volta che le culture sono congelate, trasferirli in un congelatore a-80 ° C. 
	Nota: Una concentrazione di cellule di un minimo di 50.000 UFC/mL è previsto in questa fase.</li>
</ol> 2. Esperimento di concorrenza in LB <ol><li>disgelo la libreria trasposone da-80 ° C il ghiaccio. Mix di pipettaggio.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l della biblioteca trasposone a 10 mL di LB in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Crescere le cellule, aerate agitando continua (250 giri/min), per 8 h a 37 ° C per fase stazionaria (cioè, OD 600 = ~ 4.0). Regolare questi parametri alle diverse condizioni di crescita, come desiderato.</li>
	<li>Propagare la popolazione batterica da continui trasferimenti in mezzo preriscaldato fresco ogni ~ 10 generazioni. A tale scopo trasferire 10 µ l della coltura precedente fase stazionaria a 10 mL di LB fresco e crescente per un altro 8 h per la fase stazionaria (cioè, OD 600 = ~ 4.0). 
	Nota: Come la densità ottica di inizio e di fine sono gli stessi, una diluizione 1000 volte corrisponde a ~ 10 generazioni di crescita (2 10 = 1.024). La popolazione batterica può essere propagata direttamente in mezzo fresco preriscaldata o salvata a 0-4 ° C (su ghiaccio) e propagato il giorno seguente. LB è stata usata qui per garantire accoppiamenti cellulare come molti nel più breve tempo possibile (un tempo di raddoppiamento vicino 22min).</li>
	<li>Dopo ogni 100 generazioni della concorrenza, salvare cinque campioni di 1 mL a-80 ° C (come descritto al punto 3.3).</li>
	<li>Se le differenze di fitness tra celle contenenti gli inserimenti trasposone individuali dovrebbero essere piccoli, mantenere la durata del concorso lungo; qui, 700 generazioni (t = 700) sono stati usati.</li>
</ol> 3. L'analisi del sud della macchia per monitorare la concorrenza esperimento nel tempo <ol><li>preparare la sonda per il Southern blot (sezione 1 kb della NKBOR) eseguendo utilizzando primers specifici per l'amplificazione della polimerasi reazione a catena (PCR): NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat e NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
	<ol><li>Incubare a 98 ° C per 30 s per denaturazione iniziale. Quindi, eseguire 35 cicli a 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 45 s. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min. 
		Nota: Il modello per la reazione di PCR è stato un di plasmide purificato pNKBOR 21.</li>
		<li>Etichetta il risultante frammento PCR con [α - 32P] dATP utilizzando il sistema casuale dell'iniettore, secondo Smith 25.</li>
	</ol></li> <li>Preparare il DNA cellulare totale secondo Løbner-Olesen e von Freiesleben 26 per t = 0 e selezionato tempo punti fino a t = 700 stimato generazioni della concorrenza.</li>
	<li>Digerire il DNA cellulare totale con Pvu I, che taglia il NKBOR contenente la regione di interesse una volta solo in un'area non coperta dalla sonda; 1 unità di Pvu posso essere utilizzato completamente digest 1 µ g di DNA substrato. 
	Nota: La sonda riconoscerà frammenti contenenti parte del trasposone, insieme a DNA cromosomico di varie lunghezze, a seconda del sito di inserimento.</li>
	<li>Eseguire una macchia del sud usando un gel di agarosio 0,7% secondo Løbner-Olesen e von Freiesleben 26.</li>
</ol> 4. Identificazione dei cloni più adatto <ol><li>gene facile di uso a piedi, come descritto da Harrison et al. 27, per identificare i siti di inserimento di DARS2 da singoli cloni (isolati su piastre LB) dopo 700 generazioni stimate della concorrenza; le bande più la macchia del sud, i più isolati sono necessarie per coprire tutti gli inserimenti di trasposoni.
	<ol><li>Isolato del DNA genomico per modello di PCR. Diffondere i batteri su una piastra di agar LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL e incubare a 37 ° C durante la notte. Crescere colonie singoli pernottamento in libbra di brodo a 37 ° C e successivamente trasferire 20 µ l in 200 µ l di acqua distillata in autoclave (o utilizzare la purificazione del DNA, come descritto al punto 3.2).
		<ol><li>Vortex per mescolare. Riscaldare la miscela a 100 ° C per 10 min e centrifugare a massima velocità per 5 min, salvare la cella lysata a-20 ° C per un uso futuro.</li>
		</ol></li> <li>Disegnare tre primers nidificati tempri entro il trasposone di scelta (vedere la Figura 2 per una rappresentazione grafica della strategia PCR). 
		Nota: Progettazione degli iniettori annidati dovrebbe garantire che nidificato Primer 3 giace più vicino al noto 5 &#39; fine del trasposone DNA, seguita da Nested Primers 2 e 1. La spaziatura tra nidificati Primer 3 e il 5 &#39; fine del noto transposon DNA dovrebbe essere sufficiente per un read-through sequenza dal DNA noto al DNA sconosciuto (per trovare il sito di inserzione del trasposone cromosomiche specifiche). Per NKBOR sono stati utilizzati i seguenti primer nidificati: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg e pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Primer casuale contenente i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione noti sono utilizzati anche. Per garantire un risultato, si dovrebbe usare almeno due diversi primer casuale. I siti di restrizione per gli enzimi di restrizione (e.g.,Sau 3AI e Hin dIII) devono essere posizionati ai 3 &#39; fine e preceduta da dieci basi casuale così che 5 &#39; - NNNNNNNNNNGATC - 3 &#39; e 5 &#39; - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 &#39; sono i primer contenente un sito di 3AI Sau (GATC) e un sito di dIII Hin (AAGCTT), rispettivamente, dove N = A, T, G o C.</li>
		Reazione di PCR di <li>uso 200 ng di DNA genomico in un 20 µ l. Incubare a 98 ° C per 30 s per la denaturazione iniziale. Eseguire 25 cicli a 98 ° C per 30 s, 50 ° C per 15 s e 72 ° C per 4 min. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min. coppie di primer uso composto da uno degli iniettori casuali e nidificati Primer 1.</li>
		<li>Utilizzare coppie di primer composto nidificato 2 Primer e la stessa casuale dell'iniettore dalla seconda amplificazione, usando 1 µ l della sua reazione precedente come modello.</li>
		<li>Ripetere il punto 4.1.4 con coppie di primer composto nidificati Primer 3 e la stessa casuale dell'iniettore.</li>
		<li>Eseguire i prodotti dalla reazione finale di PCR su un gel di agarosio 1.5% e macchia con bromuro di etidio. Tagliare una banda nella gamma 100-800 bp e isolare il DNA utilizzando qualsiasi commerciale gel del DNA estrazione kit secondo il produttore &#39; direzione s. Risospendere il DNA in 15 µ l di acqua. 
		Nota: attenzione. Il bromuro di etidio è tossico e deve essere maneggiato con cura.</li>
		<li>La band isolata nel passaggio precedente (passaggio 4.1.6), con 3 di Primer nidificato come il primer di sequenziamento, utilizzando Sanger di sequenza sequenziamento presso un fornitore commerciale.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire WGS.
	<ol><li>Eseguire WGS sul totale il DNA Estratto da selezionati campioni raccolti durante l'esperimento di concorrenza, come descritto da Frimodt-Møller et al. 4.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire analisi di sequenziamento.
	<ol><li>Align accoppiato-fine legge a 150 Ns contiguo al NKBOR, AF310136.1 1.904 &#8230; 2.204 utilizzando Bowtie2 28 con un intervallo tra le sottostringhe seme (S, 1, 1.15) e un numero massimo di caratteri ambigui (L, 0, 0,9).</li>
		<li>Selezionare le letture allineate e poi ri-allineare entrambi Ref MG1655 | NC_000913.3 e NKBOR gb | AF310136 utilizzando blastN 29</li> <li>assegnare recepimento posizioni di inserimento alle giunzioni MG1655-NKBOR.</li>
	</ol></li></ol> 5. Citometria a flusso <ol><li>raccogliere campioni per citometria a flusso.
	<ol><li>Equilibrio ogni cultura di mantenerlo nella fase di crescita esponenziale per almeno 10 generazioni. Controllare il OD 600 e assicurarsi che non supera 0,3.</li>
		<li>Raccogliere due tipi di campioni di flusso.
		<ol><li>Per RIF-runout, trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 15 mL contenente 30 µ l di RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cephalexin 36 µ g/mL disciolto in 12,5 mM NaOH). Lasciarlo a 37 ° C per un minimo di 4 ore di agitazione. 
			Nota: Rifampicina indirettamente blocca l'avvio della replica di cromosoma consentendo per giri in corso della replica di continuare a terminazione. Cephalexin previene la divisione cellulare, che si traduce in errore di rotazione replica (RIF-eccentricità) e l'accumulo di cellule con cromosomi replicati completamente. Il numero di cromosomi replicati completamente è uguale al numero delle origini al momento del trattamento con rifampicina e cephalexin 20.</li>
			<li>Per l'esempio di EXP, trasferimento 1ml di esponenzialmente crescente cultura in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Fissare le cellule come segue. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 100 µ l di Tris ghiacciata 10 mM pH 7.5 e aggiungere 1 mL di etanolo al 77% ghiacciata. Conservare i campioni a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Macchia le celle come segue. Raccogliere 100-300 µ l di cellule fissate mediante centrifugazione a 15.000 x g per 15 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 130 µ l di &#34; soluzione di macchiatura del DNA &#34; (90 µ g/mL mithramycin, 20 µ g/mL di bromuro di etidio, 10mm MgCl 2 e Tris 10 mM pH 7.5). Mettere i campioni sul ghiaccio e al buio; i campioni sono pronti per l'analisi di citometria a flusso dopo 10 min. 
	Nota: Altri DNA macchie di bromuro di etidio e mithramycin può anche essere usato 30 , 31.</li>
	<li>Determinare l'origine al cellulare, la massa di cella relativi e il relativo contenuto di DNA dall'analisi di citometria a flusso.
	<ol><li>Esegui flusso cytometry, come descritto in precedenza 32. Eseguire RIF-eccentricità ed EXP-campioni usando il produttore cytometer di flusso &#39; s istruzioni . Per mithramycin - etidio bromuro-macchiato le cellule e, uso eccitazione lunghezze d'onda 395 e 440 nm e raccogliere la fluorescenza sopra 565 nm.
		<ol><li>Per determinare il contenuto di DNA massa e relativo di cella relativo, eseguire gli esempi di EXP per ottenere singolo parametro forward-luce dispersione contro gli istogrammi di numero di cellulare e l'intensità di fluorescenza contro gli istogrammi di numero di cellulare per un minimo di 30.000 eventi corrispondente al segnale cellulare.</li>
			<li>Distribuzione luce diffusa diretta uso del singolo parametro per misurare la relativa media cell mass. 
			Nota: Luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare medio 20.</li>
			<li>Distribuzioni di uso fluorescenza intensità singolo parametro per misurare il DNA medio contenuto 20.</li>
			<li>Ottenere la concentrazione di DNA come il rapporto di medio contenuto di DNA per la massa media delle celle 20.</li>
		</ol></li> <li>Determinare il numero di origini per cella.
		<ol><li>Campioni di run RIF-eccentricità per ottenere l'intensità di fluorescenza di singolo-parametro contro cell numeri istogrammi per un minimo di 30.000 eventi corrispondenti al segnale cellulare.</li>
			<li>Distribuzioni di uso fluorescenza intensità singolo parametro per determinare il numero di cromosomi in ciascuna cellula 20.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Calcolare l'indice di asincronia (Ai).
	<ol><li>Calcola l'IA, come descritto da Løbner-Olesen et al. 32, usando le distribuzioni di singolo parametro intensità di fluorescenza dei campioni RIF-eccentricità e l'IA formula = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), dove fx è le cellule di frazione con x numero di cromosomi replicati completamente. Considera iniziazioni asincrona quando A &#62; 0.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Gli autori non hanno alcun interesse finanziario concorrenti.

La metodologia utilizzata qui si avvale di tecniche di state-of-the-art di rispondere a una domanda difficile per quanto riguarda la posizione ottimale di genomica di un elemento genetico. L'inserimento casuale dell'elemento genetico (mediata dal trasposone) consente la facile e veloce raccolta di migliaia di cloni, che poi possono essere fatto per competere contro l'altro per selezionare per la posizione ottima dell'elemento genetico studiato (cioè il clone più allenato).
Qui, DA...

La funzione di qualsiasi elemento genetico può essere influenzata dalla sua posizione nel genoma. Nei batteri, questo dipende principalmente da interferenze dalla trascrizione di geni vicini, topologia del DNA locale e/o dosaggio genico replica-collegata. In particolare, i processi di replicazione del DNA e di segregazione sono controllati, almeno in parte, di regioni cromosomiche non codificanti1e la funzione di queste regioni dipende dalla posizione/contesto genomico. In e. coli, gli esempi sono il sito di dif , necessario per la sorella del cromosoma risoluzione2; Sequenze KOPS, richiesti per di segregazione del cromosoma3; dati, DARS1e regioni DARS2 , necessarie per il controllo della corretta replica cromosomica (sotto; 4). vi presentiamo un metodo che consente il trasferimento casuale, selezione e determinazione del contesto genetico ottimo di ogni singolo elemento genetico, esemplificato qui dallo studio della regione non codificante DARS2 .
In e. coli, DnaA è la proteina di iniziatore responsabile filo del DNA di apertura presso la replica singola origineoriCe per l'assunzione di elicasi DnaB5,6,7. DnaA appartiene alla AAA+ (cioè, ATPasi associata con attività diverse) proteine e può legare ATP e ADP con simile ad alta affinità5. Il livello di DnaAATP picchi a iniziazione8, dove DnaAATP forma un multimer su oriC che innesca il DNA duplex apertura9. Dopo l'inizio, oriC fatta temporaneamente non disponibile per riattivazione a causa del sequestro di un meccanismo che coinvolge l'associazione della proteina SeqA per hemimethylated oriC10,11. Durante il sequestro, il livello di DnaAATP è ridotto di almeno due meccanismi: l'inattivazione normativo di DnaA (RIDA)12,13 e dati-dipendente DnaAATP idrolisi (DDAH)14 ,15. RIDA sia DDAH promuovere la conversione di DnaAATP a DnaAADP. Prima di un nuovo ciclo di iniziazione, DnaAADP è riattivato per DnaAATP alle sequenze specifiche di riattivazione di DnaA (DARS): DARS1 e DARS216,17. Cromosomiche dati, DARS1, regionie DARS2 sono non-codificazione e agire in un modo tipo di chaperon per modulare DnaAATPl'interconversione diADP di /DnaA. Queste regioni, che si trova di fuori l'origine di replicazione, consentono il montaggio di un complesso di DnaA per entrambi l'inattivazione (dati; 14) o l'attivazione (DARS1 e DARS2; 17) di DnaA. L'eliminazione di DARS2 in una cella non altera massa raddoppio tempo ma risultati in replica asincrona iniziazione15,16,18. Tuttavia, DARS2-cellule carenti hanno una palestra costo rispetto ad un altrimenti isogeniche wildtype durante sia concorso di continua crescita in mezzo ricco o durante l'istituzione della colonizzazione dell'intestino del mouse18. Ciò indica che anche i più piccoli cambiamenti nella concentrazione di asincronia/origine hanno un effetto negativo sul fitness batterica. In e. coli, c'è una pressione selettiva per mantenere di simmetria (cioè, due braccia di lunghezza quasi uguale replica) del cromosoma19. I dati, DARS1e DARS2 regioni hanno la stessa distanza relativa di oriC in tutti gli e. coli ceppi sequenziati18, malgrado le grandi variazioni nella dimensione del cromosoma.
Qui, usiamo la regione DARS2 di e. coli come esempio per identificare le posizioni cromosomiche ottimale per la sua funzione. DARS2 è stato inserito il trasposone NKBOR e il risultante NKBOR::DARS2 trasposone successivamente inserito in modo casuale nel genoma di MG1655 ΔDARS2. Abbiamo così generato un insieme di celle, ogni possesso DARS2 collocato in una posizione diversa sul cromosoma. In vitro concorrenza esperimento, dove tutte le celle nell'insieme sono state riunite ed ha Gareggiate contro l'altro durante la crescita continua in LB per un stimato 700 generazioni, è stato effettuato. Il risultato dell'esperimento concorrenza è stato monitorato/determinato tramite Southern blot, gene facile camminare e sequenziamento intero genoma (WGS; Figura 1). Cloni di end-point risolti da gene facile a piedi sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso per valutare i parametri del ciclo cellulare. In un'analisi cytometric di flusso, dimensioni della cella, il contenuto di DNA e sincronia di iniziazione può essere misurati per un gran numero di cellule. Durante il flusso cytometry, un flusso di singole cellule passa un fascio di luce della lunghezza d'onda appropriata per eccitare il DNA macchiato, che quindi è contemporaneamente registrato dai fotomoltiplicatori che raccolgono la fluorescenza emessa, una misura del contenuto di DNA, purché il le cellule sono macchiate per il DNA. La luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare20.
L'esperimento in vitro concorrenza che vi presentiamo qui è utilizzato per affrontare questioni relative all'importanza della posizione cromosomica e contesto genomico dell'elemento genetico. Il metodo è imparziale e facile da usare.

<table><tbody><tr>Acqua <td></td><td>Mili-Q autoclavata</td><td>Nessuno Cuvette</td><td></td></tr><tr><td>per elettroporazione, 0,1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser Sistema di elettroporazione</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, polvere (Lennox L agar)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Piastre di Petri in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Provette coniche per centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Provette coniche per centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td> CryoTubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà (2 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &micro; Kit di etichettatura del DNA Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>DECAprime II</td><td>Spettrofotometro Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge&nbsp; &nbsp; &nbsp; SF/MBV/03.46</td><td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich Centrifuga&nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo </td> Cloroformio <td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td>ultra puro</tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi A tipo II A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodiododecilsolfato (SDS)</td> <td>Merck</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0,5M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Thermo Fisher Scientific 16500500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borato-EDTA tampone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>cloridricoSigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Carte 3MM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20&times; Concentrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina - Frazione V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico dell'acido desossiribonucleico dai testicoli di salmone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp; BioMax &nbsp; pellicola luminosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Kit di estrazione gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Kit di pulizia PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp; Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spettrofotometro</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Serva</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>Cefalexina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Mitramicina</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Strumento Apogee A10</td><td>Apogee</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di dna in escherichia coli usando un approccio novello transposon-mediata

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Le posizioni cromosomiche ottimale di un dato elemento di DNA è stato/sono state determinate mediante inserimento casuale transposon-mediata seguita dalla selezione di fitness. Nei batteri, l'impatto del contesto genetico sulla funzione di un elemento genetico può essere difficile da valutare. Parecchi meccanismi, compreso gli effetti topologici, interferenza trascrizionale da geni vicini, e/o dosaggio genico replica-collegato, possono influenzare la funzione di un dato elemento genetico. Qui, descriviamo un metodo che consente l'integrazione casuale di un elemento di DNA nel cromosoma di Escherichia coli e selezionare le posizioni più favorevoli utilizzando una concorrenza crescita semplice esperimento. Il metodo si avvale di un sistema basato su trasposone ben descritto di inserimento casuale, accompagnato da una selezione del clone(s) più adatto nel vantaggio di crescita, una procedura che è facilmente regolabile per esigenze sperimentali. La natura del clone(s) più adatto può essere determinata mediante sequenziamento intero genoma su una popolazione multi-clonale complesso o dal gene facile a piedi per la rapida identificazione di cloni selezionati. Qui, la regione di DNA non codificante DARS2, che controlla l'avvio della replica del cromosoma in e. coli, è stata usata come esempio. La funzione di DARS2 è noti per essere interessati da dosaggio genico replica-collegato; il più vicino DARS2 Ottiene l'origine di replicazione del DNA, diventa più attivo. DARS2 casualmente è stato inserito nel cromosoma di un DARS2-eliminato il ceppo. I cloni risultanti contenente singoli inserimenti sono stati riuniti ed ha gareggiati uno contro l'altro per centinaia di generazioni. Infine, i cloni più adatti sono stati caratterizzati e trovati per contenere DARS2 inserita nella prossimità vicina alla posizione originale di DARS2 .

Una macchia del sud è stato fatto per verificare che DARS2 era distribuito in modo casuale in tutto il cromosoma nella libreria trasposone (t = 0) e che i cloni più adatti sarebbero permangono nel tempo. Il Southern blot è stato effettuato su DNA estratto dal pool del trasposone iniziale (t = 0) e ogni 100 stimato fuori 700 generazioni della concorrenza (Figura 3). Qui, il DNA cellulare totale da ogni punto di tempo è stato digerito con Pvuh...

Qui, il potere di un'inserzione casuale transposon-mediata di un elemento di DNA non codificante è stato usato per risolvere la sua ottimale posizione cromosomica.

Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la posizione cromosomica ottimale di un qualsiasi elemento di DNA specifico, utilizzando l'inserimento casuale mediato da trasposone, esperimenti di competizione e il sequenziamento dell'intero genoma. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della replicazione del DNA, come l'importanza della localizzazione cromosomica di un elemento genetico. Il vantaggio di questa tecnica consiste nell'accoppiare l'inserimento casuale basato sui trasposoni alla selezione del clone più adatto, grazie al vantaggio di crescita.Qui, viene semplificato dalla regione DARS2 di E.coli. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione cromosomica di Escherichia coli, può essere applicato anche ad altri batteri. Dopo aver preparato cellule elettrocompetenti come MG1655 delta DARS2 secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere un microgrammo di pNKBOR DARS2 a 40 microlitri di cellule e trasferire la miscela in una cuvetta sterile pre-raffreddata con interstizio di 0,2 centimetri.Inserire la cuvetta nella camera di elettroporazione. Quindi, sottoporre le cellule a elettroporazione a 18 kilovolts, 500 ohm e 25 microfarad. La costante di tempo dovrebbe essere di circa cinque millisecondi e non dovrebbe verificarsi alcun arco elettrico.Riprendere rapidamente la sospensione batterica risospendendola in un millilitro di brodo LB preriscaldato e trasferirla in un tubo da prova da 15 millilitri. Incubare le cellule in condizioni di crescita aerobiche a 37 gradi Celsius per 30 minuti senza selezione antibiotica. Successivamente, piastrare i batteri su piastre di agar LB addizionate con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Il giorno seguente, conta le colonie provenienti dall'elettroporazione. Una colonia è considerata equivalente a un'inserzione cromosomica del trasposone. Aggiungi un millilitro di brodo LB a ogni piastra e risciacqua tutte le colonie.Riutilizzare lo stesso millilitro di brodo LB per aumentare la concentrazione batterica. Successivamente, raccogliere tutte le colonie nello stesso tubo da 50 millilitri. Vortexare il tubo per congelare il materiale iniziale e mescolare un millilitro di sospensione cellulare con un millilitro di glicerolo al 50% su ghiaccio.Trasferire le provette sul ghiaccio secco per 10 minuti. Una volta congelate le colture, trasferirle in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Scongelare la libreria di trasposoni da meno 80 gradi Celsius su ghiaccio.Mescolare mediante pipettaggio, quindi trasferire 100 microlitri della libreria di transposoni in 10 millilitri di LB in un tubo da prova da 15 millilitri. Far crescere le cellule in aerazione con agitazione continua a 37 gradi Celsius per otto ore fino alla fase stazionaria. Regolare i parametri secondo diverse condizioni di crescita, se desiderato.Per propagare la popolazione batterica ogni circa 10 generazioni, trasferire 10 microlitri della coltura in fase stazionaria precedente in 10 millilitri di mezzo fresco preriscaldato e coltivare per altre otto ore fino alla fase stazionaria. Dopo ogni 100 generazioni di competizione, conservare cinque campioni da un millilitro e mantenerli a meno 80 gradi Celsius. Preparare la sonda per il Southern blot contro una sezione di un chilobase del NKBOR mediante amplificazione PCR utilizzando primers specifici elencati qui.Eseguire i campioni utilizzando il seguente programma. Etichettare il frammento PCR risultante con dATP marcato con P32 mediante il sistema di primer casuale secondo Smith e preparare il DNA cellulare totale seguendo il protocollo descritto nel testo. Digere il DNA cellulare totale con Pvul, che taglia NKBOR contenente la regione di interesse al di fuori di una regione coperta dalla sonda.Eseguire un Southern blot utilizzando un gel di agarosio allo 0,7% secondo Loebner-Olsen e von Freiesleben. Per utilizzare l'easy gene walking al fine di identificare i siti di inserzione di DARS2 da singoli cloni, dopo circa 700 generazioni di competizione, isolare il DNA genomico come stampo per la PCR seminando inizialmente i batteri su una piastra di agar LB e incubando a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Inoculare il brodo LB con singole colonie e farle crescere per tutta la notte a 37 gradi Celsius.Quindi, trasferire 20 microlitri in 200 microlitri di acqua distillata autoclavata. Vortexare le colonie in soluzione, quindi riscaldare la miscela a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare i campioni alla velocità massima per cinque minuti, quindi conservare il lisato cellulare a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro.Successivamente, progettare tre primer nested che si ibridino all'interno del trasposone di scelta come mostrato qui. Utilizzare 200 nanogrammi di DNA genomico, il primer nested uno e un primer casuale per preparare una reazione PCR da 20 microlitri. Quindi, eseguire i campioni utilizzando il seguente programma.Per la seconda amplificazione, utilizzare un microlitro della prima reazione come stampo e impiegare il primer annidato due e lo stesso primer casuale. Eseguire una terza reazione in modo analogo utilizzando il primer annidato tre, lo stesso primer casuale e un microlitro della seconda reazione come stampo. Eseguire i prodotti dell'ultima reazione PCR su un gel di agarosio all'1,5% e colorare con bromuro di etidio.Ritagliare una banda nell'intervallo compreso tra 100 e 800 paia di basi e isolare il DNA utilizzando un qualsiasi kit commerciale per l'estrazione del DNA da gel, seguendo le istruzioni del produttore. Per eseguire la citometria a flusso, bilanciare ogni coltura batterica mantenendola in fase esponenziale di crescita per almeno 10 generazioni. Misurare l'OD600 e assicurarsi che non superi mai il valore di 0.3.Per eseguire il run-out della rifampicina secondo il protocollo descritto nel testo, trasferire un millilitro di coltura in un tubo da 15 millilitri contenente 30 microlitri di RIF-CEF. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius con agitazione per un minimo di quattro ore. Per il campione EXP, trasferire un millilitro di coltura in fase esponenziale in un tubo da 1,5 millilitri posto sul ghiaccio.Quindi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 15.000 ×g e 4 °C per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet in 100 microlitri di tris 10 millimolare ghiacciato a pH 7,5 e aggiungere un millilitro di etanolo al 77% ghiacciato. Conservare i campioni a 4 °C fino all'uso.Colorare le cellule raccogliendo da 100 a 300 microlitri di cellule fissate mediante centrifugazione a 15.000 × g per 15 minuti. Rimuovere il soprannatante e utilizzare 130 microlitri di soluzione colorante per il DNA per risospendere il pellet. Successivamente, incubare i campioni sul ghiaccio e al buio per 10 minuti.Infine, utilizzare la citometria a flusso per determinare l'origine per cellula, la massa cellulare relativa e il contenuto relativo di DNA. Dopo l'estrazione del DNA dal pool iniziale di trasposoni e ogni circa 100 delle 700 generazioni previste di competizione, il DNA è stato digerito con Pvul, un enzima noto per tagliare una volta il trasposone NKBOR DARS2 in una regione non coperta dalla sonda, e successivamente è stata eseguita una blot di Southern. Come mostrato qui, il pool iniziale di DARS2 non presentava bande distinte, indicando che l'inserzione di DARS2 era avvenuta in modo casuale lungo il cromosoma.Nel tempo, è emerso un modello in cui il pool iniziale e ampio di cloni DARS2 si è evoluto in uno o pochi cloni DARS2 persistenti. Il sequenziamento dell'intero genoma è stato utilizzato per identificare i siti di inserzione di DARS2 a partire dal pool iniziale. E dopo 400, 500 e 700 generazioni di competizione, in un sottoinsieme rappresentativo di inserzioni sequenziate, il 98% di tutte le inserzioni di DARS2 è stato trovato vicino alla posizione cromosomica wild type di DARS2.E il 2%&nbsp;è stato trovato in altre posizioni sul cromosoma. È stato precedentemente dimostrato che le cellule carenti di DARS2 avviano la replicazione in modo asincrono e presentano una diminuzione della concentrazione di origini rispetto alle cellule di tipo selvaggio. Qui, la presenza di un elemento DARS2 nel sito terminale non ripristina la sincronia né il contenuto cellulare di origini ai livelli del tipo selvaggio, mentre le clone DARS2 selezionate IR e RPPH avviano effettivamente la replicazione in modo sincrono.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la posizione cromosomica ottimale di un determinato elemento di DNA. Questo viene fatto mediante inserimenti casuali basati sui trasposoni, seguiti da esperimenti di competizione e infine dal sequenziamento dell'intero genoma.

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