Comportamento di fase di caricate vescicole sotto soluzione simmetrica e asimmetrica condizioni monitorate con microscopia di fluorescenza

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di valutare quantitativamente l'effetto degli ambienti ad alta salinità e dell'asimmetria della soluzione transmembrana riscontrata in condizioni fisiologiche sugli stati di fase della membrana. Le soluzioni all'interno della cellula e all'esterno delle celle sono molto diverse. I nostri metodi aiutano a comprendere l'effetto dell'asimmetria della soluzione sulle proprietà della membrana e sul comportamento della fase.

Il vantaggio principale del nostro approccio è che le vescicole possono essere preparate in condizioni tampone fisiologiche e il dispositivo microfluidico può essere utilizzato per creare condizioni tampone asimmetriche. Per iniziare la procedura, irruvidire un lato di una lastra di PTFE con carta vetrata fine. Lavare la piastra, una fiala di vetro da 15 millilitri e un contenitore di vetro sigillabile con detersivo per piatti commerciale, etanolo e cloroformio.

Utilizzare una siringa di vetro da 25 microlitri per depositare da 10 a 15 microlitri di brodo lipidico in cloroformio sul lato ruvido della piastra in PTFE pulita e asciutta. Stendere il brodo lipidico con l'ago della siringa per creare un film lipidico uniforme. Utilizzare una pinzetta per trasferire la piastra nella fiala da 15 millilitri.

Riscaldare la piastra a 60 gradi Celsius e essiccare per due ore per far evaporare il solvente. Quindi, aggiungere acqua deionizzata in un contenitore di vetro ad un'altezza di circa un centimetro. Inserire il flaconcino con la piastra nel contenitore, assicurandosi che rimanga stabile e in posizione verticale e sigillare il contenitore.

Lasciare che il doppio strato lipidico si gonfi a 60 gradi Celsius per quattro ore. Quindi, rimuovere la fiala dal contenitore. Aspirare cinque millilitri di soluzione per il rigonfiamento in una siringa di plastica e collegare un filtro da 0,45 micrometri alla punta della siringa.

Aggiungere la soluzione di rigonfiamento filtrata alla fiala per idratare il film lipidico. Tappare il flaconcino e sigillare il flaconcino con un film di plastica di paraffina. Conservare la fiala a 60 gradi Celsius durante la notte per ottenere l'aggregato GUV.

Raffreddare le vescicole a temperatura ambiente entro un'ora dalla rimozione dal fuoco. Tagliare l'estremità di un puntale per micropipette in plastica da 200 microlitri, in modo che l'aggregato GUV possa essere aspirato nel puntale. Utilizzare la punta della pipetta tagliata per trasferire l'aggregato e 50 microlitri di soluzione rigonfiante in una fiala da due millilitri pulita e asciutta.

Aggiungere alla fiala 950 microlitri di soluzione di rigonfiamento fresco o di una soluzione isotonica per ottenere rispettivamente condizioni di soluzione simmetrica o asimmetrica. Pipettare la miscela su e giù, quindi capovolgere delicatamente la fiala più volte per risospendere i GUV. Per iniziare la valutazione, posizionare un'aliquota di sospensione GUV in un isolatore di silicone in un vetrino da microscopio.

Sigillare la camera con un vetrino coprioggetti. Lasciare riequilibrare il campione per cinque minuti. Quindi, posizionare il vetrino sul tavolino portacampioni di un microscopio a fluorescenza e acquisire immagini di almeno 30 GUV per lotto.

Ispezionare le immagini per determinare gli stati di fase delle GUV dell'immagine. I GUV in un singolo stato di fase liquida saranno sferici e lisci con un'etichetta fluorescente distribuita in modo omogeneo su tutta la membrana. I GUV in uno stato liquido ordinato e disordinato a due fasi saranno sferici con un'etichetta fluorescente partizionata in domini con confini lisci all'interno della membrana.

Verificare che i domini siano liberi di diffondersi sulle superfici delle vescicole e possano fondersi. I GUV in uno stato di fase liquida solida bifase o trifase saranno arrotondati con alcuni confini angolari. I domini liquidi su uno sfondo solido non dovrebbero mostrare diffusione, ma i domini solidi dovrebbero diffondersi liberamente su uno sfondo liquido.

Una volta identificato lo stato di fase di ciascun GUV dell'immagine, determinare lo stato di fase dominante per il batch. Ripetere il processo con campioni indipendenti se lo stato di fase dominante è una maggioranza ristretta. Prima di utilizzare il dispositivo microfluidico, preparare almeno cinque millilitri ciascuno di soluzioni di saccarosio e rigonfiamento salino.

Filtrare ogni soluzione attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Quindi, tagliare le estremità dei puntali delle pipette in plastica da 200 microlitri e posizionare un puntale per pipette in ciascun canale del dispositivo. Aggiungere al serbatoio del dispositivo 100 microlitri di soluzione di rigonfiamento filtrata fresca dello stesso tipo utilizzata per preparare i GUV.

Aggiungere cinque microlitri della soluzione rigonfiante a ciascun puntale della pipetta. Centrifugare il dispositivo a 900 volte G per 10 minuti per riempire i canali del dispositivo. Quindi, riempire una siringa di vetro da un millilitro con la stessa soluzione di gonfiore filtrata.

Collegare un pezzo di tubo alla siringa. Spingere la soluzione di rigonfiamento attraverso il tubo fino a quando lo stantuffo non è completamente premuto e il tubo è pieno di soluzione. Quindi, collegare il tubo al canale di uscita e montare la siringa su una pompa a siringa.

Quindi, collegare l'unità di controllo della pressione agli ingressi del canale microfluidico. Assicurarsi che le valvole siano chiuse e quindi impostare la pressione a tre bar. Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino portacampioni di un microscopio confocale invertito.

Utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione rigonfiante dal serbatoio del dispositivo fino a quando rimangono solo 25-50 microlitri di soluzione. Aggiungere 150 microlitri di sospensione GUV al serbatoio e miscelare la sospensione con un pipettaggio delicato. Far funzionare la pompa a siringa in modalità di estrazione a 10 microlitri al minuto per 20 minuti o fino a quando non è occupato più del 90% delle trappole del dispositivo.

Quindi, aprire le valvole dell'unità di controllo della pressione per chiudere le valvole ad anello nel dispositivo microfluidico. Arrestare la pompa a siringa e lasciare riposare il dispositivo per un'ora prima di acquisire immagini confocali dei GUV nel dispositivo. Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere la sospensione GUV dal serbatoio per lasciare solo da 25 a 50 microlitri.

Aggiungere al serbatoio 150 microlitri dell'altro tipo di soluzione di rigonfiamento filtrata e pipettare delicatamente la miscela su e giù. Ripetere questo processo almeno cinque volte per sostituire completamente la soluzione nel serbatoio. Far funzionare la pompa a siringa in modalità di prelievo a 10 microlitri al minuto per 10 minuti per sostituire la soluzione nei microcanali.

Quindi, diminuire la portata a un microlitro al minuto. Chiudere le valvole dell'unità di controllo della pressione per due secondi, quindi aprire le valvole e arrestare la pompa a siringa. Lasciare riposare il dispositivo per un'ora prima di registrare immagini confocali.

Per iniziare a preparare la camera di controllo della temperatura, collegare prima i raccordi del tubo spinato a un gruppo di flusso di calore in alluminio con finestre coprivetrino spesse due millimetri. Fissare un distanziatore di gomma a uno dei vetrini coprioggetti per formare la camera di osservazione. Caricare 100 microlitri di sospensione GUV nella camera di osservazione e sigillare la camera con un vetrino coprioggetti.

Capovolgere lentamente il gruppo. Collegare la camera di alluminio a un bagnomaria esterno. Montare il gruppo su un tavolino per campioni del microscopio.

Impostare il bagnomaria esterno alla temperatura più bassa desiderata e lasciare che il sistema si equilibri per 10-15 minuti. Acquisire immagini dei GUV e determinare gli stati di fase a varie temperature. I GUV sono stati preparati da rapporti variabili di DOPG e sfingomielina d'uovo e colesterolo in soluzioni simmetriche di saccarosio o sale.

I loro stati di fase dominanti sono stati determinati mediante microscopia a fluorescenza. Le composizioni selezionate sono state quindi trasferite in condizioni asimmetriche mediante diluizione per valutare le condizioni di soluzione efficaci sul comportamento della fase. Per studiare ulteriormente il comportamento della fase GUV in soluzioni asimmetriche, i GUV sono stati intrappolati in un dispositivo microfluidico per consentire lo scambio completo della soluzione esterna.

I GUV intrappolati sono stati valutati mediante microscopia confocale prima e dopo lo scambio fluidico. La frazione di GUV omogenei e separati in fase è stata monitorata in un intervallo di temperature per valutare la temperatura effettiva sul comportamento della fase GUV. Nei dati è stato osservato un pattern sigmoidale, che è stato poi adattato a un modello di Boltzmann.

La temperatura alla quale la frazione di GUV separati di fase era 0,5 è stata determinata dalla curva adattata. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sul comportamento della fase di membrana, le applicazioni possono essere utilizzate anche per altri esperimenti, come lo studio delle interazioni tra le membrane nelle biomolecole in condizioni fisiologiche.