Name: Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per lanalisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Scopri un metodo LC-MS/MS ottimizzato per l'analisi di ivacaftor, lumacaftor e metaboliti nei fluidi biologici di pazienti con fibrosi cistica. Questa tecnica HPLC-MS supporta studi farmacocinetici e il monitoraggio terapeutico.

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J.L. e T.V. sono supportati dal National Institute of Allergy e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (R01 AI111965). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e malattie infettive o il National Institutes of Health. MC è un australiano NHMRC Principal Research Fellow. J. L. è un Australian National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) Senior Research Fellow, e T.V. è un australiano NHMRC industria carriera sviluppo livello 2 Research Fellow. E.K.S è un nominato giovane ambasciatore 2017 per ASM (American Society for Microbiology) ed è supportato da Australian Postgraduate Award. Parti di questo lavoro è stato presentato presso la 12th Australiasian conferenza sulla fibrosi cistica In Melbourne (5-8th di agosto 2017).

approvazione per l'etica è stata ottenuta da Monash University umana ricerca etica Comitato (MUHREC).
 1. applicazione del dosaggio: raccolta del campione di paziente <ol><li>registrare il momento in cui il paziente prende loro dose standard di 150 mg ivacaftor o /lumacaftor di 125 mg di ivacaftor 200 mg.</li>
	<li>Nota giù l'ora esatta quando il campione di sangue del paziente è raccolto. 
	Nota: Si consiglia la raccolta di campioni di 4-5 sopra un corso di tempo di 24 ore. Se la raccolta di un solo campione è possibile, il punto di tempo indicato è 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione dosaggio come C max le concentrazioni allo steady state sarà raggiungibile dopo &#62; 5 giorni di trattamento consecutivo.</li>
	<li>Raccogliere 4-5 mL di sangue in provette blu non trattati commercialmente disponibile.</li>
	<li>Dopo la raccolta del sangue intero, permettere al sangue di coagularsi lasciando indisturbati a temperatura ambiente. 
	Nota: Questo di solito richiede 15-30 min.</li>
	<li>Rimuovere il coagulo mediante centrifugazione a 1.000-2.000 x g per 10 min a 4 ° C in una centrifuga refrigerata. Designare il surnatante risultante come plasma.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, immediatamente trasferire il surnatante (plasma) in una provetta pulita in polipropilene utilizzando una pipetta Pasteur. Etichetta il plasma tube con l'ID del paziente (ad es., 1 paziente), il farmaco somministrato (ad es., combinazione di ivacaftor-lumacaftor) e tempo campione del paziente era raccolti (ad esempio, post-dosaggio 2,5 h).</li>
	<li>Mantenere i campioni a 2-8 ° C durante la movimentazione. Una volta completata la gestione, conservare i campioni a &#8211; 20 ° C.</li>
	<li>Se necessario, nave campioni con un corriere autorizzato all'Istituto analyzing. 
	Nota: I campioni devono essere spediti su ghiaccio secco fino all'arrivo e deve essere tenuti a &#8211; 80° C fino all'analisi.</li>
</ol> 2. Preparazione ed elaborazione di campioni sostenute e standard Nota: Plasma da donatori sani naive alla terapia di ivacaftor/lumacaftor è stato ottenuto dalla croce rossa australiana. Per garantire l'integrità, tutti campioni/standard dovrebbe essere mantenuto a 2-8 ° C durante la raccolta e l'elaborazione. Una volta completata la gestione, conservare i campioni a &#8211; 20 ° C.
<ol><li>Pesare IVA, IVA-carbossilato, idrossimetil-IVA e LUMA che servirà come riferimento per le altre norme interne.</li>
	<li>Preparare due soluzioni di riserva indipendente di ciascun analita (IVA, M1, M6 e LUMA) in metanolo LC-MS a 100 µ g/mL e a 10 µ g/mL. 
	Nota: Composti scade dopo 10 giorni sul banco.</li>
	<li>Appena preparare gli standard di calibrazione di LC-MS prima di ogni esecuzione analitica diluendo gli standard di calibrazione soluzioni stock in plasma umano per realizzare a seguito di concentrazioni: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10.0 µ g/mL. Questi campioni sono indicati come standard.</li>
	<li>Di precipitare le proteine, preparare acido formico 0.1% (FA) in acetonitrile (ACN, grado di LC-MS) e lasciare in frigorifero fino a quando necessario.</li>
</ol> 3. Pretrattamento dei campioni sostenute e standard <ol><li>consentire entrambi campioni di plasma paziente e vuoto stabilizzare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vortice di mescolare ogni campione di plasma per 15 s per esempio.</li>
	<li>Trasferire un'aliquota di 100 µ l di entrambi plasma vuoto per standard o campioni per l'analisi in una provetta da 1,5 mL in polipropilene microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere l'IVA standard interna in ciascuna delle provette standard (ad es., 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10.0 µ g/mL per coprire la gamma potenziale di concentrazione), chiudere il coperchio e agitare con vortex per 2-3 s. nota che standard interno è solo aggiunto al plasma vuoto e standard interno non è aggiunto ai campioni dei pazienti.</li>
	<li>Ripetere il punto 3.4. per le altre norme interne M1, M6 e LUMA.</li>
	<li>Spin giù ogni tubo brevemente per garantire che non ci sono nessun goccioline sul coperchio.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l della miscela dello 0,1% FA in ACN in ciascuna provetta per precipitare le proteine del plasma.</li>
	<li>Vortice la miscela vigorosamente per circa 15 s.</li>
	<li>Consentire tubi riposare per 10 minuti in frigorifero.</li>
	<li>Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C, se possibile.</li>
	<li>Filtrare un'aliquota di 200 µ l del surnatante attraverso un filtro per siringa 13 mm in una fiala di 1,5 mL HPLC.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l del surnatante nel flaconcino di LC-MS per l'analisi di HPLC-MS.</li>
</ol> 4. Analisi HPLC-MS Nota: The HPLC-MS analisi è stata eseguita su un sistema LC-MS accoppiato con lo spettrometro di massa triplo quadrupolo (tabella 1).
<ol><li>Girare sul sistema LC-MS, posizionare il vassoio con i campioni nel auto-campionatore.</li>
	<li>Fissare la colonna a una colonna di guardia e connettersi al sistema LC-MS.</li>
	<li>Collegare entrambe le bottiglie di fasi mobili (bottiglia r: 100% ACN; bottiglia b: 0,1% acido formico in acqua) ed equilibrare il sistema LC-MS.</li>
	<li>Incorporare i seguenti parametri del protocollo di LC-MS.
	<ol><li>Dividere il flusso della fase mobile prima di entrare lo spettrometro di massa in un rapporto 2:1 (rifiuti: MS inlet).</li>
		<li>Eseguire un'eluizione di pendenza ad una portata di 0,5 mL/min utilizzando una fase mobile composto da 100% di acido formico ACN e 0,1% in acqua (partenza alle 40: 60, v/v). Si noti che la percentuale di volume della fase mobile cambia nel corso di analisi.</li>
		<li>Operare lo spettrometro di massa in una modalità di ionizzazione electrospray positivo.</li>
		<li>Assicurarsi che le impostazioni di LC-MS sono i seguenti: tensione di ioni spray 4,5 kV, energia di collisione 295,9 V, gas di nebulizzazione: azoto a 3 L/min; gas di collisione: argon; essiccazione gas portata 20 L/min, tensione Q3 dell'obiettivo:-22 V, desolvatazione temperatura 250 ° C con un blocco di calore temperatura di 400 ° C.</li>
		<li>Iniettare 10 µ l per campione.</li>
		<li>Rilevare analiti usando la reazione più monitoraggio (MRM). Monitorare le transizioni dello ione m/z 392.49 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 e m/z 452.40 &#8594; 453 per IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA, rispettivamente. 
		Nota: Il metodo appena ottimizzato ha ancora completamente essere convalidati secondo le norme FDA.</li>
	</ol></li></ol> 5. Curve di calibrazione <ol><li>costrutto la LC-MS curve di calibrazione prima di ogni esecuzione analitica utilizzando il rapporto tra i rapporti di area di picco di ciascuna delle quattro analiti di standard interno e le concentrazioni nominali standard di calibrazione di ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 o LUMA) all'interno del programma di impostazioni di LC-MS. 
	Nota: La procedura esatta per la costruzione della curva di taratura dipende dal modello di LC-MS attrezzature utilizzate. Queste informazioni possono essere disponibili nel manuale attrezzature.</li>
	<li>1/C 2 secondo il reciproco delle concentrazioni di ponderazione per eseguire analisi di regressione di minimi quadrati lineari.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
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<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come precedentemente segnalato, il nostro gruppo ha per la prima volta sviluppato e convalidato un metodo HPLC e LC-MS per tempestiva rilevazione e quantificazione di ivacaftor e dei suoi principali metaboliti M1 idrossimetil-IVA (attivo) e IVA-carbossilato M6 (inattivo); e lumacaftor nel plasma e dell'espettorato di pazienti CF14. Il saggio segnalato dal nostro gruppo precedentemente è stato usato con successo per quantificare la concentrazione di LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 nel plasma ed espettor...

Fibrosi cistica (CF) è una comune malattia genetica che coinvolge le ghiandole esocrine muco di polmone, fegato, pancreas e intestino provocando progressiva insufficienza multi-organo, come ad esempio un declino della funzione polmonare e insufficienza pancreatica1, 2,3. Ivacaftor (IVA) è il primo Food and Drug Administration (FDA-US) e Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha approvato la fibrosi cistica trans-membrana conduttanza regolatore (CFTR) potenziatore farmaco, con efficacia clinica dimostra producendo un significativo miglioramento nella funzione polmonare rispetto al placebo in un piccolo sottoinsieme dei pazienti CF cuscinetto G551D-CFTR [glicina (G) in posizione 551 è sostituita da acido aspartico (D)] mutazione di senso sbagliato (~ 4-5% della popolazione CF)4,5. Questo oralmente amministrato droga aumenta il canale CFTR aprire, così aumentando il flusso di ioni cloruro e che agiscono per il difetto primario che conduce alle manifestazioni cliniche di CF4,6. Purtroppo, l'IVA in monoterapia non è efficace in pazienti con la mutazione F508del omozigote più comune [in omissione della struttura del gene CFTR che provoca la perdita di fenilalanina (F) in posizione 508] che si traduce in misfolded CFTR, che è visto in circa 50% di la popolazione CF7,8.
Recentemente, il FDA ha concesso l'approvazione per la combinazione di IVA con il correttore CFTR droga lumacaftor. La strategia intelligente di combinare un correttore CFTR (lumacaftor, LUMA) che salva F508del-CFTR alla superficie delle cellule con un modulatore (IVA) che rafforza l'attività canale CFTR, efficacemente si espande la finestra di trattamento per la maggior parte della popolazione CF5 . Domande rimangono sopra se queste droghe soddisfare loro promessa come un numero di rapporti conflittuali è emerse che messo in dubbio sulla loro efficacia clinica9,10. Inoltre, miglioramenti nella funzione polmonare sono stati solo modesti (2.6-4% per la combinazione di ivacaftor-lumacaftor) rispetto al successo raggiunto con IVA in monoterapia in pazienti portatori di una mutazione (10.6-12,5%) di G551D8. Potenziali interazioni farmaco-farmaco antagonista tra IVA e LUMA che potenzialmente limitare l'efficacia clinica di ivacaftor-lumacaftor combinazione provengono dalla sua proprietà farmacocinetiche meno ideale7,11. IVA è ampiamente metabolizzata dagli enzimi del citocromo P450 (CYP), principalmente per un metabolita attivo idrossimetil-IVA (IVA-M1, M1) e una forma inattiva IVA-carbossilato (IVA-M6, M6)7,12. Induttore del CYP3A4, LUMA, d'altra parte, non è ampiamente metabolizzato e in gran parte viene escreta immodificata nelle feci11. Come induttori di CYP3A4 inducono il metabolismo del citocromo, concentrazioni di ivacaftor (substrato del CYP3A4) potrebbero essere ridotto. Inoltre, sia IVA e LUMA sono molecole molto idrofobe e sono ~ 99% legato alle proteine plasmatiche, che limita notevolmente la concentrazione di farmaco libero (attivo)1,13.
Collettivamente, questi fattori possono essere venuta insieme a limitare l'efficacia clinica di combinazione di ivacaftor-lumacaftor. Non è noto se le concentrazioni plasmatiche ottimali sono raggiunti sotto l'attuale regime di dosaggio per combinazione di ivacaftor-lumacaftor o se la soglia terapeutica è mantenuta8. Attualmente, ci è una scarsità di informazioni per quanto riguarda i parametri farmacocinetici come il picco e le concentrazioni plasmatiche allo steady-state di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dato il metabolismo noto di ivacaftor e lumacaftor, monitoraggio delle relazioni esposizione-risposta è il requisito per raggiungere regimi di dosaggio ottimale per il trattamento di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Il nostro gruppo ha recentemente pubblicato il primo metodo HPLC/LC-MS per il monitoraggio delle relazioni di esposizione-risposta di IVA e LUMA14. Nessun tecniche alternative di misurare le concentrazioni di ivacaftor, suoi metaboliti e lumacaftor sono stato segnalato fin qui. Per consentire l'analisi di alto-rendimento di un collettivo più grande paziente e ridurre drasticamente i tempi di analisi, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccola e un sistema solvente gradiente che riduce i costi e tempi di esecuzione.

<table><tbody><tr><td>IVA (Cat#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (Stati Uniti).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Gatto#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (Stati Uniti).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-carbossilato (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>idrossimetil-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (MeOH, grado LC-MS),&nbsp;</td><td>Acetonitrile Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(grado ACN, LC-MS)&nbsp;</td>Acido formico <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>triplo quadrupolo Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2,6 &; m C8 100 &Aring;; 50 &volte; 2,1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(KrudKatcher Ultrea HPLC Filtro in linea 0,5 m Filtro di profondità x 0,004 pollici).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga in polipropilene (VWR) da 1,5 mL.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa da 13 mm (0,45 &; micro; m nylon, GRACE, USA)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &micro; L, PTFE/Setti in silicone].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo ottimizzato di lc-ms/ms per l'analisi di high-throughput di campioni clinici di ivacaftor, suoi principali metaboliti e lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Difetti nel regolatore di conduttanza del trans-membrana di fibrosi cistica (CFTR) sono la causa della fibrosi cistica (CF), una malattia con le manifestazioni polmonari mortali. Ivacaftor (IVA) e combinazione di ivacaftor-lumacaftor (LUMA) sono due nuovi farmaci svolta CF che modulano direttamente l'attività e il traffico della proteina CFTR difettosa. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sui parametri di farmacocinetica/farmacodinamica e la farmacologia di ivacaftor e lumacaftor. La tecnica HPLC-MS per l'analisi simultanea delle concentrazioni di ivacaftor, idrossimetil-ivacaftor, ivacaftor-carbossilato e lumacaftor nei fluidi biologici in pazienti che ricevono la combinazione standard di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia è stata precedentemente sviluppato dal nostro gruppo e parzialmente convalidata a norme FDA. Tuttavia, per consentire l'analisi di alto-rendimento di un numero maggiore di campioni di pazienti, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccolo (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e un sistema solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: detenuta al 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: 90% lavaggio B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: detenuta al 40% B) invece di un'eluizione isocratica. L'obiettivo di questo studio era quello di ridurre i tempi di analisi di HPLC-MS per campione drammaticamente da ~ 15 min a solo 6 min per campione, che è essenziale per l'analisi di una grande quantità di campioni di pazienti. Questo metodo vantaggioso sarà di notevole utilità per gli studi di relazioni esposizione-risposta tra queste droghe CF svolta.

Recentemente abbiamo segnalato un metodo convalidato parzialmente ai campioni della FDA, su un triplo quadrupolo LC-MS e un sistema rivelatore HPLC, utilizzando una colonna C8 (5 µm, 3,9 mm x 50 mm di diametro interno) con la fase mobile composto da 100% ACN e 0,1% acido formico in acqua (40: 60 v/v) con una portata di 1 mL/min. Una correlazione lineare dei picchi è stata osservata in un intervallo di concentrazione da 0,01 a 10 µ g/mL in plasma umano per tutti i metaboliti, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva e lumacaftor<sup cla...

Combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor sono due nuovi farmaci CF. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sulle loro PK/PD e farmacologia. Presentiamo una tecnica ottimizzata di HPLC-MS per l'analisi simultanea di ivacaftor e suoi metaboliti principali e lumacaftor.

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Questo è il protocollo per la preparazione del campione per il saggio del plasma. Si noti che, per garantirne l'integrità, tutti i campioni e gli standard devono essere mantenuti a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius durante il prelievo e la lavorazione. Al termine della manipolazione, conservare tutti i campioni a meno 20 gradi.Per la preparazione standard, preparare due soluzioni stock indipendenti di ciascun anilide, ivacaftor, metabolita M1, metabolita M6 e lumacaftor in metanolo a 100 microgrammi per millilitro e 10 microgrammi per millilitro. Si noti che i composti scadono dopo 10 giorni a temperatura ambiente. Per gli standard, trasferire 100 microlitri di plasma umano in provette microcentrifuga in polipropilene da 1,5 millilitri.Procedere allo stesso modo per tutti gli altri campioni. Quindi aggiungere lo standard interno a ogni provetta. Ad esempio, scegliamo 0,01 microgrammi per millilitro dello standard preparato.Ora questo tubo contiene il plasma arricchito con lo standard interno. Procedere in questo modo con tutti gli altri standard. Prendere gli standard e centrifugarli per alcuni secondi per assicurarsi che tutto il liquido sia in fondo al tubo.Proseguire così per tutti i 40 standard. Per i campioni del paziente, trasferire 100 microlitri dal tubo del campione del paziente nel tubo da microcentrifuga. Il campione reale del paziente non è arricchito con lo standard interno.Centrifugare il campione del paziente per alcuni secondi per assicurarsi che tutto il liquido si trovi in fondo al tubo. I passaggi successivi sono progettati sia per i campioni che per gli standard. Aggiungere 200 microlitri di acido formico 0,1% in acetonitrile in ciascun tubo del campione per precipitare le proteine plasmatiche.Procedere allo stesso modo per tutti gli standard e i campioni dei pazienti. Vortexare ogni campione vigorosamente per circa 15 secondi. Procedere allo stesso modo per tutti gli standard e i campioni analizzati.Lasciare in riposo per 10 minuti in frigorifero per favorire la precipitazione. A scopo dimostrativo, centrifugherò un solo campione e un solo standard. La centrifugazione avviene a 10.000 giri/min per 10 minuti su una centrifuga Eppendorf Centrifuge 5430 a quattro gradi.Ora filtreremo il soprannatante nei vial Phenomenex. A tale scopo, stiamo utilizzando un filtro per siringa da 13 millimetri con filtri in nylon Grace da 0,45 micrometri acquistati negli USA, e stiamo filtrando nei vial per HPLC che possono contenere 1,5 millilitri. Dopo la filtrazione, trasferiremo 100 microlitri di soprannatante nei vial per LC/MS per l'analisi mediante LC/MS.Il campione è ora pronto per l'analisi. Posizionare semplicemente tutti i campioni nel portaprovette. Utilizziamo un sistema LC/MS Shimadzu 8030, abbinato a uno spettrometro di massa a tripla quadrupola.Lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio prima dell'analisi. Una volta raggiunto l'equilibrio, cosa che richiede circa 15 minuti, premere semplicemente il pulsante Avvia. Per ciascun metabolita, costruire una curva di calibrazione riportando in grafico i rapporti tra le aree dei picchi degli anilidi rispetto alla concentrazione nominale degli standard di calibrazione.Utilizzare l'equazione di regressione della curva di calibrazione per calcolare le concentrazioni di anilidi nel campione analizzato. In questa figura è mostrato un cromatogramma tipico. Una risoluzione cromatografica ottimizzata è stata ottenuta utilizzando una fase mobile costituita da acetonitrile al 100% e acido formico allo 0,1% in acqua, con un'eluzione a gradiente su una colonna Phenomenex Kinetex C8.I tempi di ritenzione della cromatografia liquida erano i seguenti. Per M6, un minuto. Per M1, 1,3 minuti.Per ivacaftor, 1,55 minuti. Per lumacaftor, 2,3 minuti. In tutti i campioni di plasma vuoti, non è stata osservata alcuna interferenza con il tempo di ritenzione di nessuno dei due anilidi, né è stata rilevata interferenza dalla combinazione di ivacaftor con lumacaftor.Mediante l'analisi ad alto rendimento di un elevato numero di campioni di pazienti, abbiamo ottimizzato il nostro metodo precedentemente descritto utilizzando una colonna cromatografica a fase inversa con dimensioni di poro ridotte, colonna Phenomenex C8, e un sistema di solventi in gradiente al posto dell'eluzione isocratica attualmente impiegata. Ciò riduce il tempo di analisi a sei minuti per campione, inclusa la fase di lavaggio. Questo metodo affidabile e innovativo offre un approccio semplice, sensibile e rapido per il monitoraggio terapeutico dei farmaci ivacaftor e della combinazione ivacaftor-lumacaftor in fluidi biologici.Dato il bisogno di sviluppare relazioni esposizione-risposta per massimizzare l'efficacia del farmaco e al contempo contenere i costi sanitari, è necessario sviluppare e validare strumenti più sensibili per assistere i clinici nell'uso di terapie basate su evidenze e di tecniche analitiche ad alto rendimento per i pazienti affetti da FC. Applicando il metodo analitico proposto a studi clinici di farmacocinetica e farmacodinamica, si presenta l'opportunità di indagare ulteriormente i parametri farmacocinetici di ivacaftor o della combinazione ivacaftor-lumacaftor su un collettivo di pazienti più ampio.

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La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo.  Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Qui descriviamo un test di cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) per quantificare l'immunosoppressore tacrolimus in macchie di sangue essiccato utilizzando una semplice fase manuale di precipitazione delle proteine ed estrazione online della colonna.

Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS

Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l'applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.

Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di<em&gt; In Vitro</em&gt; colture cellulari

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Qui descriviamo un metodo ad alta produttività per la sorveglianza dei medicinali completa che permette la risoluzione migliorata e l'individuazione di grandi pannelli delle droghe d'abuso e loro metaboliti, con controllo di qualità basato su multisegmento iniezione-capillare elettroforesi-spettrometria totale.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

Il filtraggio della frammentazione diagnostica, implementato in MZmine, è un approccio elegante e post-acquisizione per lo schermo di DataSet LC-MS/MS per intere classi di prodotti naturali conosciuti e sconosciuti. Questo strumento ricerca gli spettri MS/MS per gli ioni prodotto e/o le perdite neutre che l'analista ha definito come diagnostica per l'intera classe di composti.

Individuazione di prodotti naturali con filtraggio della frammentazione diagnostica LC-MS/MS: applicazione per l'analisi microcystin

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Gli attuali metodi di analisi dell'aderenza dei pazienti ai complessi regimi di tubercolosi farmacoresistente (DR-TB) possono essere imprecisi e dispendiosi in termini di risorse. Il nostro metodo analizza i capelli, una matrice facilmente raccolta e conservata, per concentrazioni di 11 farmaci DR-TB. Utilizzando LC-MS/MS, possiamo determinare i livelli di farmaci sub-nanogrammi che possono essere utilizzati per comprendere meglio l'aderenza ai farmaci.

Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli

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Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Scopri un metodo LC-MS/MS ottimizzato per l'analisi di ivacaftor, lumacaftor e metaboliti nei fluidi biologici di pazienti con fibrosi cistica. Questa tecnica HPLC-MS supporta studi farmacocinetici e il monitoraggio terapeutico.

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per lanalisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica (Video) | JoVE Journal

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

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