Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Questo è il protocollo per la preparazione del campione per il test del plasma. Si prega di notare che, per garantirne l'integrità, tutti i campioni e gli standard devono essere conservati a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius durante la raccolta e l'elaborazione. Una volta completata la manipolazione, conservare tutti i campioni a meno 20 gradi.

Per la preparazione standard, preparare due soluzioni madre indipendenti di ciascun anilide, ivacaftor, metabolita M1, metabolita M6 e lumacaftor in metanolo a 100 microgrammi per millilitro e 10 microgrammi per millilitro. Si prega di notare che i composti scadono dopo 10 giorni di giorni sul banco. Per gli standard, trasferire 100 microlitri di plasma umano nelle provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 millilitri.

Continua a farlo per tutti gli altri campioni. Quindi aggiungere lo standard interno a ciascun tubo. Ad esempio, scegliamo 0,01 microgrammi per millilitri dallo standard preparato.

Ora questa provetta contiene plasma addizionato con lo standard interno. Procedi in questo modo con tutti gli altri standard. Prendi i tuoi standard e ruotali verso il basso per alcuni secondi per assicurarti che tutto il liquido sia sul fondo del tubo.

Continuate a farlo per tutti i vostri 40 standard. Per i campioni dei pazienti, trasferire 100 microlitri dalla provetta del campione del paziente nella provetta della microcentrifuga. Il campione del paziente reale non è addizionato con standard interno.

Far girare il campione del paziente verso il basso per alcuni secondi per assicurarsi che tutto il liquido si trovi sul fondo della provetta. I passaggi successivi sono progettati sia per i campioni che per gli standard. Aggiungere 200 microlitri di acido formico allo 0,1% in acetonitrile in ciascuna provetta per precipitare le proteine plasmatiche.

Continuare a farlo per tutti gli standard e i campioni dei pazienti. Agitare energicamente ogni campione per circa 15 secondi. Continuare a farlo per tutti gli standard e i campioni sostenuti.

Lasciate riposare per 10 minuti in frigo per facilitare la precipitazione. A scopo dimostrativo, centrifugherò solo un campione e uno standard. Stiamo centrifugando a 10.000 giri/min per 10 minuti su una Eppendorf Centrifuge 5430 a quattro gradi.

Filtreremo ora il surnatante nelle fiale di Phenomenex. Per questo, stiamo utilizzando un filtro per siringa da 13 millimetri con filtri Grace in nylon da 0,45 micrometri acquistati dagli Stati Uniti e stiamo filtrando nelle fiale HPLC che possono contenere 1,5 millilitri. Dopo la filtrazione, trasferiremo 100 microlitri di surnatante nelle fiale LC/MS per l'analisi LC/MS.

Questo campione è ora pronto per l'analisi. Ora è sufficiente inserire tutti i campioni nel rack delle fiale. Stiamo utilizzando un sistema Shimadzu 8030 LC/MS, accoppiato con una spettrometria di massa a triplo quadrupolo.

Lasciare che il sistema si equilibri prima dell'analisi. Una volta equilibrato, che dura circa 15 minuti, basta premere il pulsante Start. Per ciascun metabolita, costruire una curva di calibrazione tracciando i rapporti di area del picco degli anilidi rispetto alla concentrazione nominale degli standard di calibrazione.

Utilizzare l'equazione di regressione per la curva di calibrazione per calcolare le concentrazioni di anilidi nel campione sostenuto. In questa figura è mostrato un cromatogramma tipico. La risoluzione cromatografica ottimizzata è stata ottenuta utilizzando una fase mobile di acetonitrile al 100% e acido formico allo 0,1% in acqua con un'eluizione in gradiente su una colonna Phenomenex Kinetex C8.

I tempi di ritenzione LC sono stati i seguenti. Per M6, un minuto. Per M1, 1,3 minuti.

Per ivacaftor, 1,55 minuti. Per lumacaftor, 2,3 minuti. In tutti i campioni di plasma bianco, non è stata osservata alcuna interferenza con il tempo di ritenzione di uno degli anilidi, né è stata rilevata alcuna interferenza dalla combinazione di ivacaftor con lumacaftor.

Attraverso l'analisi ad alto rendimento di una grande quantità di campioni di pazienti, abbiamo ottimizzato il nostro metodo riportato attraverso l'uso di una colonna per cromatografia in fase inversa di dimensioni dei pori più piccole, una colonna Phenomenex C8 e un sistema di solventi a gradiente invece dell'attuale eluizione isocratica. Ciò riduce il tempo di esecuzione a sei minuti per campione, compresa la fase di lavaggio. Questo metodo innovativo e affidabile offre un approccio semplice, sensibile e rapido per il monitoraggio terapeutico dei farmaci della combinazione ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor e dei fluidi biologici.

Data la necessità di sviluppare relazioni esposizione-risposta per massimizzare l'efficacia dei farmaci e contenere i costi sanitari, è necessario sviluppare e convalidare strumenti più sensibili per assistere i medici nell'utilizzo di terapie basate sull'evidenza e tecniche analitiche ad alto rendimento per i pazienti affetti da CF.By applicando il metodo analitico proposto a studi clinici di farmacocinetica e farmacodinamica, si presenta l'opportunità di studiare ulteriormente i parametri farmacocinetici di ivacaftor o Combinazione ivacaftor-lumacaftor su un collettivo di pazienti più ampio.