Name: Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Scopri come estrarre nanotubi di membrana da vescicole unilamellari giganti per studiare le interazioni proteina-membrana curva. Questo metodo quantifica il legame proteico e le proprietà meccaniche, illuminando processi come endocitosi e traffico intracellulare.

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Gli autori ringraziano Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quémeneur e Gil Toombes per i loro contributi essenziali per stabilire il metodo di nanotubi nel gruppo. Il gruppo di P.B. appartiene al Consorzio CNRS CellTiss, il Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) e di Scienze di Parigi et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai è stato finanziato dal EMBO fellowship a lungo termine (ALTF 1527-2014) e Marie Curie actions (H2020-MSCA-IF-2014, progetto membrana-ezrin-actina). M.S. è un Junior Fellow della Society of Fellows Simons.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo di tirare tubi da GUV dà ricco di informazioni sul sistema proteina di membrana, come non è solo il mezzo per misurare le proprietà meccaniche fondamentali della membrana, ma aiuta a far luce sull'accoppiamento tra membrana e proteine curvatura. Come discusso nell'introduzione, esistono altre tecniche per misurare gli effetti delle proteine di membrana-curvatura, o incubando le proteine con liposomi di sub-micron legati a una superficie passivata18,19 ,...

Molti processi cellulari, come endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, infezione, ecc., sono accompagnati da un drammatico cambiamento nella forma di membrane cellulari1,2. Nella cella, un numero di proteine partecipa a questi processi legandosi alla membrana e alterare la loro forma. Gli esempi più notevoli sono membri della famiglia di proteine Bin/anfifisina/Rvs (BAR), contenente una caratteristica intrinsecamente curvata BAR dominio3,4,5,6,7. In genere, essi interagiscono con la membrana aderendo il dominio di BAR alla superficie e, in molti casi, anche superficialmente inserimento eliche amphipathic in doppio strato. La forma, la dimensione e la carica del dominio BAR insieme al numero delle eliche amphipathic determina: (1) la direzione della curvatura della membrana (cioè, se inducono i invaginations o sporgenze) e (2) l'entità della membrana curvatura5,8. Di nota, qui curvatura positiva è definito come il lato convesso della membrana curvilinea, vale a dire, il rigonfiamento verso la particella interagente e negativa altrimenti. Inoltre, gli studi quantitativi di BAR proteine ha rivelato che il loro effetto sulla membrana dipende un set di parametri fisici: densità di proteine, tensione nelle membrane e forma di membrana (piatto contro tubolare contro sferica di superficie forma)7. In base a questi parametri BAR proteine può: (1) fungono da sensori di curvatura della membrana, (2) piegare membrane o (3) indurre membrana scissione7.
Dovuto il numero di componenti coinvolti nella membrana rimodellamento nella cella, studiando gli aspetti quantitativi dei fenomeni, quali endocitosi, in vivo è estremamente impegnativo. In vitro la ricostituzione del numero minimo di componenti che imita curve membrane nella cella fornisce mezzi per acquisire una comprensione meccanicistica di proteine di membrana-curvatura come operare. Questo articolo descrive un protocollo per ricostituire una membrana nanotubi in vitro mediante micromanipolazione, microscopia confocale e pinzette ottiche. L'approccio può essere utilizzato per studiare in modo quantitativo, come proteine, lipidi o piccole molecole interagiscono con le membrane curve. GUV del lipido sono utilizzati come modelli di una membrana cellulare, cui curvatura è trascurabile rispetto alle dimensioni delle molecole interagenti curvatura a membrana. Essi sono preparati utilizzando il metodo di electroformation9 in cui le vescicole sono formate da idratante un film lipidico e gonfiore in GUV sotto una corrente alternata (AC)10. Sono più comuni substrati su cui sono coltivati GUV o semi-conduttori piatti ricoperti di ossido della latta dell'indio (ITO) o fili di platino (Pt-fili)11. In questo lavoro, GUV sono coltivate su Pt-fili come questo metodo ha dimostrato di funzionare molto meglio rispetto all'alternativa nel rendere GUV in presenza di sali nei buffer12. Anche se il protocollo di electroformation è qui descritto in dettaglio sufficiente per riprodurlo, rimandiamo il lettore ad articoli precedenti in cui simili e altri metodi di fare GUV sono stati descritti in dettaglio13,14. Nelle nostre mani, electroformation il Pt-fili ha correttamente dato GUV da un mix di lipidi sintetici o da lipidiche naturali estratti in un tampone contenente ~ 100 mM NaCl. Inoltre, era anche possibile incapsulare GUV contiene proteine durante la crescita. Una camera di electroformation esempio è mostrata in Figura 1A; si compone di due ~ 10 cm-lunghezza Pt-fili inserite in un supporto effettuato in politetrafluoroetilene (PTFE) che può essere sigillato su entrambi i lati con lamelle di vetro ~ 1-2 cm di distanza (Figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figura 1: messa a punto sperimentale. (A) il GUV electroformation camera con connettori elettrici collegati ai fili di Pt. Sinistra (B): il sistema sperimentale mostrando il microscopio, la camera sperimentale sopra l'obiettivo e due Micropipette (sinistra e destra) associati ad i micromanipolatori e inseriti nella camera sperimentale per tubo tirando e proteina iniezione. A destra: una vista ravvicinata della camera sperimentale montato sopra l'obiettivo mostrando le punte di aspirazione e le micropipette di iniezione inserite. (C) A siringa dotata di un erogatore sottile inserito in una micropipetta a suo back-end. Il fondo è una vista ravvicinata del dispenser all'interno la micropipetta con la linea tratteggiata blu che delinea la micropipetta. Questo sistema è utilizzato per riempire la micropipetta con caseina per passivare la superficie di vetro e anche per eseguire il riempimento con olio minerale quando necessario. (D) A sistema utilizzato per aspirare quantità µ l della soluzione della proteina. L'ago è collegato ad una siringa e al tubo che è collegato alla micropipetta di iniezione. La punta della micropipetta è accuratamente immerso nella soluzione della proteina e aspirata così per riempire la punta della micropipetta. La micropipetta indietro viene poi riempita con olio minerale, utilizzando il sistema mostrato nel pannello di C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Un nanotubo di membrana, che vanno nel raggio da 7 a diverse centinaia nm, può essere tirato da un capo da una forza esterna. Questo metodo è stato inizialmente progettato per misurare le proprietà elastiche delle membrane cellulari e vescicole, ad esempio il piegamento rigidità15,16. Nelle opere più recenti, il metodo è stato esteso per studiare l'interazione delle proteine con membrane curve di microinjecting le proteine vicino il nanotubo tirato7,17. Altri metodi sono stati sviluppati per lo studio delle proteine di membrana-curvatura. In un unico metodo, proteine vengono incubate con diverse dimensioni liposomi legati ad una superficie passivata. La microscopia confocale è utilizzata per misurare il legame con le proteine in funzione del diametro di liposomi, che può indicare indotta da curvatura ordinamento18,19. In un altro metodo, proteine vengono iniettate nei pressi di un micro-aspirato GUV per misurare la loro capacità di indurre spontaneamente tubuli20,21. Il metodo descritto in questo protocollo è in grado di studiare la curvatura a membrana proteine coinvolte nell'endocitosi, dove la maggior parte delle proteine in genere incontrano nanotubi di membrana preformata collegando l'invaginazione della membrana contenenti merci con il fondo piatto della membrana plasmatica. Inoltre, in questo metodo, a differenza nell'analisi con liposomi piccoli tethered, i nanotubi di membrana sono continuamente collegato alla membrana; Pertanto, è in equilibrio meccanico con il capo, una situazione previsto in vivo. Quindi, fisica fondamentale della membrana si applica e si può dedurre una pletora di proprietà meccaniche da nostre misure22,23,24.
Per una piena attuazione di questo metodo, l'attrezzatura comprende un microscopio confocale, pinzette ottiche e uno o due Micropipette collegate ad un serbatoio di acqua (Figura 1B). Combinando tutti e tre, è possibile misurare la tensione della membrana, membrana della curvatura, densità di superficie delle proteine, e contemporaneamente forza25del tubo. Micropipetta aspirazione è essenziale e facilmente è costruito mediante l'inserimento di una micropipetta di vetro in un supporto collegato ad un serbatoio di acqua, che, tramite pressione idrostatica, controlla la pressione di aspirazione26. La micropipetta e il titolare sono controllati da un micromanipolatore e, idealmente, in una direzione da un attuatore piezoelettrico per il movimento di precisione. Per tirare un nanotubo, la microaspirated GUV brevemente è attaccato ad una perlina micron imprese poi tirata via creando un nanotubo. In questa implementazione, il tallone è detenuto da Pinzetta ottica, che può essere costruita seguendo un protocollo pubblicato27. È possibile fare a meno delle pinzette ottiche e nanotubi di tirare in modi diversi, anche se a costo di misure di forza accurata. Se è troppo difficile da costruire un'ottica trap o se misure di forza sono non essenziali, come se uno vuole semplicemente verificare la preferenza delle proteine per membrane curve, un tubo può essere estratto utilizzando una perlina aspirata all'estremità di una micropipetta secondo28. È anche possibile tirare tubi mediante forza gravitazionale29 o30,31di flusso. Inoltre, la microscopia confocale è non è essenziale; Tuttavia, si è preferito così per misurare la densità di superficie delle proteine. Permette inoltre di misurare il raggio di nanotubi da intensità di fluorescenza dei lipidi nel tubo, così indipendentemente dalla forza della membrana e la tensione. Raggio del tubo deduzione da fluorescenza è particolarmente importante se il rapporto tra queste quantità si discosta dalle equazioni ben consolidate a causa della presenza di proteine di membrana-aderito25. Cosa importante, uno non può erogare della trappola ottica e microscopia confocale, poichè non è possibile misurare la curvatura del tubo.
Il metodo descritto in questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'ordinamento di curvatura-indotta di varie proteine di membrana periferici su nanotubi, soprattutto quelli dalla famiglia25,BAR32,33,34 . Inoltre è stato indicato che il canale del potassio del transmembrane conicamente sagomato che KvAP si arricchisce il curvo nanotubi nello stesso modo come BAR proteine35. Grazie all'ottimizzazione del metodo per incapsulare GUV contiene proteine, l'interazione delle proteine con curvatura negativa è stato recentemente studiato come ben36. Inoltre, questo metodo è stato usato per delucidare la formazione di proteina scaffold25,37 e per studiare il meccanismo di scissione di membrana da entrambi linea tensione38, proteina dinamina39, o da BAR proteine40,41. Oltre alle proteine, piccole molecole o ioni possono anche indurre la curvatura. Utilizzando questo metodo, gli ioni di calcio sono stati indicati per indurre la curvatura positiva sotto condizioni senza sale42. Interessante, ha anche dimostrato che i lipidi possono subire curvatura differenziata, anche se solo per le composizioni che sono vicino a un demixing punto43,44. In sintesi, il metodo può essere utilizzato dai ricercatori interessati a indagare come entrambi componenti integrali di membrana (ad es., lipidi o proteine transmembrana) o marginalmente associazione molecole (sia all'interno o all'esterno di GUV) interagire con membrane cilindricamente curve, dal punto di vista meccanico e quantitativa. Inoltre è inteso per coloro che sono interessati a misurare le proprietà meccaniche della membrana stessa22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosfatidilcholine (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Esempio di lipidi utilizzati nei dati per la Figura 3</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-gliccerone-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotina]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>lipide biotinilato</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>lipidi fluorescenti</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-esadecanoil fosfatidilcolina (HPC*)</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td></td><td>lipidi fluorescenti per calibrazione</td></tr><tr><td>densità proteica uovo L-&alfa;-fosfatidilcolina (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>utilizzato per calibrare il raggio del tubo costante</td></tr><tr><td>&beta;-caseina da latte bovino (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>utilizzato per la passivazione della micropipetta e il camera sperimentale</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich 10708976001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>osmometro</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-wires, diametro 0,5 mm, puro al 99,99%</td><td>Goodfellow USA</td><td>PT005139</td><td>utilizzato per</td></tr><tr><td>il generatore</td><td></td> di funzioni di elettroformazione GUV <td>n/a</td><td>utilizzato per creare corrente per</td></tr><tr><td>il sigillante di stucco</td> per elettroformazione GUV <td>Vitrex (da CML France)</td><td>CRIT 140013</td><td>utilizzato per sigillare la camera di elettroformazione</td></tr><tr><td>del bagno sonicatore</td><td></td><td>n/a</td><td>utile per pulire la camera di elettroformazione, ma non cruciale</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Nikon TE2000, sistema confocale eC1 (Nikon), con due linee laser (&lambda; = 488 nm e 543 nm); pinzette ottiche indotte da un laser a onda continua in fibra di itterbio da 5 W (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Germania)</td><td></td><td></td><td>un esempio di sistema di microscopia confocale dotato di pinzette ottiche,</td></tr><tr><td>micromanipolatori</td><td></td>, <td>n/a,</td><td></td></tr><tr><td>capillari borosilicati (con raggi interni ed esterni rispettivamente di 0,78 mm e 1 mm)</td><td>Harvard apparatus</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>estrattore per micropipette</td>, <td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td> Attuatore piezoelettrico <td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>perle rivestite di polistirene streptavidina (diametro 3,2 & micro; m)</td><td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Il rimodellamento della membrana cellulare è parte integrante di molti fenomeni cellulari, come ad esempio endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, ecc. Molte proteine diverse associano con membrane curve a causa della loro capacità di percepire o indurre la curvatura della membrana. In genere, questi processi comportano una moltitudine di proteine che li rende troppo complessa per studiare quantitativamente nella cella. Descriviamo un protocollo per ricostituire una membrana curvilinea in vitro, che imita una struttura cellulare curva, come il collo di endocitosi. Delle vescicole unilamellari gigante (GUV) viene utilizzata come modello di una membrana cellulare, in cui pressione interna e la tensione superficiale sono controllato con l'aspirazione di una micropipetta. L'applicazione di una forza di trazione di punto su GUV utilizzando pinzette ottiche crea un nanotubo ad alta curvatura collegato ad una membrana piatta. Questo metodo è stato utilizzato tradizionalmente per misurare le proprietà meccaniche fondamentali delle membrane lipidiche, quali rigidità di piegamento. Negli ultimi anni, esso è stato ampliato per studiare come le proteine interagiscono con curvatura della membrana e il modo che interessano la forma e la meccanica delle membrane. Un sistema che unisce la micromanipolazione, microiniezione, Pinzetta ottica e microscopia confocale permette la misura della curvatura della membrana, tensione nelle membrane e la densità di superficie delle proteine, contemporaneamente. Da queste misurazioni, si può dedurre molte importanti proprietà meccaniche e morfologiche del sistema proteina-membrana. Inoltre, abbiamo stendere un protocollo di creazione GUV in presenza di concentrazione salina fisiologica e un metodo per quantificare la densità superficiale delle proteine sulla membrana da intensità di fluorescenza di etichettato proteine e lipidi.

L'esperimento di tubo-tirando può dare informazioni vitali meccaniche su membrana. In assenza di proteine o altre molecole che forza la coppia con curvatura della membrana, la membrana e raggio del tubo può essere correlato con tensione nelle membrane applicando l'Hamiltoniana di carnevali-Helfrich equazione ad un tubo tirato da un GUV50,51 
<img alt="Equation 3" src="/f...

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

L'obiettivo generale di questa metodologia di estrazione dei nanotubi è quello di studiare quantitativamente le interazioni tra specifiche proteine di interesse e membrane altamente curve. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia delle membrane cellulari, come l'endocitosi e il traffico intracellulare. Questa tecnica ci permette di quantificare direttamente come le proteine si legano alle membrane curve e le deformano reciprocamente.Inizialmente, questo metodo è stato utilizzato per misurare le proprietà meccaniche di base delle membrane lipidiche. Recentemente, è stato applicato per chiarire importanti meccanismi nelle interazioni di membrana delle proteine, in particolare le membrane che modellano le proteine. Inizia raccogliendo le vescicole unilamellari giganti direttamente dai fili di platino della camera di elettroformazione.Per costruire la camera sperimentale, posizionare due vetrini rettangolari di copertura a un millimetro di distanza l'uno dall'altro su una base metallica, lasciando aperture lungo i bordi lunghi abbastanza grandi da consentire a una punta di micropipetta di vetro di raggiungere almeno il centro della camera. Riempire sia la camera sperimentale che una micropipetta di vetro con cinque milligrammi per millilitro di una soluzione di beta-caseina altamente pura, facendo attenzione a evitare bolle. Durante la passivazione della camera, montarla su un microscopio ottico centrato sopra l'obiettivo e inserire la punta della micropipetta di aspirazione attraverso l'apertura lungo il bordo lungo fino a quando la punta non si trova sopra l'obiettivo.Regolare il livello del serbatoio dell'acqua in modo che la pressione di aspirazione sia vicina allo zero e riempire una micropipetta per iniezione con la molecola di interesse disciolta nel tampone sperimentale alla concentrazione sperimentale appropriata. Montare la micropipetta per iniezione all'interno di un micromanipolatore e inserire la micropipetta attraverso l'altro lato della camera sperimentale. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di beta-caseina dalla camera e sciacquare più volte la camera con tampone sperimentale.Quindi, aggiungere alcuni microlitri di soluzione di vescicola alla camera, seguiti da alcuni microlitri di perle rivestite di streptavidina, fino a una concentrazione finale di 0,1 volte 10 al tasso negativo di microsfere del 3% per volume o meno. Dopo che le vescicole e le perle si sono depositate sul fondo della camera, lasciare evaporare il tampone sperimentale per circa 15 minuti, a quel punto le vescicole dovrebbero ondulare visibilmente al microscopio ottico. Quando le vescicole sono adeguatamente flosce, aspirare le singole vescicole nella micropipetta fino a quando la lunghezza delle membrane all'interno della pipetta è uguale o superiore al raggio della pipetta.Quando è stata identificata una lingua di aspirazione di dimensioni adeguate, sigillare i bordi aperti della camera con olio minerale. Per impostare la posizione zero della pressione di aspirazione, posizionare l'estremità della pipetta di aspirazione vicino a un cordone e regolare l'altezza del serbatoio dell'acqua in modo che il cordone non venga aspirato né soffiato via dalla pipetta. La regolazione dell'altezza dell'acqua è fondamentale per controllare la tensione della membrana della vescicola che viene aspirata dalla micropipetta.Aspirare una vescicola e spostare la micropipetta verso l'alto e fuori fuoco senza rompere la micropipetta. Usando una pinzetta ottica, intrappolare una perlina a circa 20 micrometri di distanza dal fondo della camera. Riportare la vescicola a fuoco lontano dal cordone e allinearla con la trappola ottica, quindi registrare il movimento del cordone per uno o due minuti per misurare la posizione di equilibrio.Ridurre il più possibile la pressione all'interno della micropipetta senza perdere la vescicola per diminuire la tensione della membrana e portare con cautela la vescicola a contatto con il cordone per circa un secondo per stabilire i legami streptavidina-biotina. Quindi, utilizzando un attuatore piezoelettrico, tirare delicatamente indietro la vescicola per creare un nanotubo. Aumentare la pressione di aspirazione per ricreare la linguetta di aspirazione e allineare il tubo all'interno dell'asse della pipetta di aspirazione.Mettere a fuoco il tubo e la vescicola e registrare il movimento del cordone a una velocità di acquisizione di 30 hertz e l'altezza del serbatoio dell'acqua rispetto alla posizione zero per alcuni minuti al microscopio a campo chiaro. Quando tutte le immagini sono state ottenute, registrare nuovamente il movimento del cordone a diverse pressioni di aspirazione e tensioni della membrana. Per iniettare proteine o molecole di interesse, avvicinare la micropipetta per iniezione al nanotubo, facendo attenzione che la perlina nella trappola ottica non sia perturbata, e iniettare delicatamente le proteine a uno o due pascal di pressione.Dopo che il legame proteico si è equilibrato, ripetere le misurazioni graduali in presenza delle proteine aggiunte, come dimostrato per la membrana nuda. Le misurazioni della forza e del raggio su nanotubi estratti da vescicole DOPC al 100% sono indipendenti, poiché la forza viene misurata dallo spostamento della perlina nella trappola ottica e dal raggio dall'intensità della fluorescenza, fornendo due modi per calcolare la rigidità di flessione della membrana. L'arricchimento relativo di BAR o proteine canale del potassio sui tubi di membrana sopra le vescicole sottostanti indica che le proteine hanno maggiori probabilità di legarsi alle membrane curve.Infatti, il legame della proteina N-BAR endofilina A2 alla membrana riduce gradualmente la forza del tubo a zero, indicando la formazione di un'impalcatura tridimensionale che mantiene stabile il tubo. Seguendo questa procedura, altre tecniche possono essere combinate per rispondere a ulteriori domande, ad esempio la microscopia ad alta risoluzione per rilevare l'organizzazione delle proteine sui tubi a membrana o il tracciamento di singole particelle per misurare la mobilità delle proteine.

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