Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

L'obiettivo generale di questa metodologia di estrazione dei nanotubi è quello di studiare quantitativamente le interazioni tra specifiche proteine di interesse e membrane altamente curve. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia delle membrane cellulari, come l'endocitosi e il traffico intracellulare. Questa tecnica ci permette di quantificare direttamente come le proteine si legano alle membrane curve e le deformano reciprocamente.

Inizialmente, questo metodo è stato utilizzato per misurare le proprietà meccaniche di base delle membrane lipidiche. Recentemente, è stato applicato per chiarire importanti meccanismi nelle interazioni di membrana delle proteine, in particolare le membrane che modellano le proteine. Inizia raccogliendo le vescicole unilamellari giganti direttamente dai fili di platino della camera di elettroformazione.

Per costruire la camera sperimentale, posizionare due vetrini rettangolari di copertura a un millimetro di distanza l'uno dall'altro su una base metallica, lasciando aperture lungo i bordi lunghi abbastanza grandi da consentire a una punta di micropipetta di vetro di raggiungere almeno il centro della camera. Riempire sia la camera sperimentale che una micropipetta di vetro con cinque milligrammi per millilitro di una soluzione di beta-caseina altamente pura, facendo attenzione a evitare bolle. Durante la passivazione della camera, montarla su un microscopio ottico centrato sopra l'obiettivo e inserire la punta della micropipetta di aspirazione attraverso l'apertura lungo il bordo lungo fino a quando la punta non si trova sopra l'obiettivo.

Regolare il livello del serbatoio dell'acqua in modo che la pressione di aspirazione sia vicina allo zero e riempire una micropipetta per iniezione con la molecola di interesse disciolta nel tampone sperimentale alla concentrazione sperimentale appropriata. Montare la micropipetta per iniezione all'interno di un micromanipolatore e inserire la micropipetta attraverso l'altro lato della camera sperimentale. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di beta-caseina dalla camera e sciacquare più volte la camera con tampone sperimentale.

Quindi, aggiungere alcuni microlitri di soluzione di vescicola alla camera, seguiti da alcuni microlitri di perle rivestite di streptavidina, fino a una concentrazione finale di 0,1 volte 10 al tasso negativo di microsfere del 3% per volume o meno. Dopo che le vescicole e le perle si sono depositate sul fondo della camera, lasciare evaporare il tampone sperimentale per circa 15 minuti, a quel punto le vescicole dovrebbero ondulare visibilmente al microscopio ottico. Quando le vescicole sono adeguatamente flosce, aspirare le singole vescicole nella micropipetta fino a quando la lunghezza delle membrane all'interno della pipetta è uguale o superiore al raggio della pipetta.

Quando è stata identificata una lingua di aspirazione di dimensioni adeguate, sigillare i bordi aperti della camera con olio minerale. Per impostare la posizione zero della pressione di aspirazione, posizionare l'estremità della pipetta di aspirazione vicino a un cordone e regolare l'altezza del serbatoio dell'acqua in modo che il cordone non venga aspirato né soffiato via dalla pipetta. La regolazione dell'altezza dell'acqua è fondamentale per controllare la tensione della membrana della vescicola che viene aspirata dalla micropipetta.

Aspirare una vescicola e spostare la micropipetta verso l'alto e fuori fuoco senza rompere la micropipetta. Usando una pinzetta ottica, intrappolare una perlina a circa 20 micrometri di distanza dal fondo della camera. Riportare la vescicola a fuoco lontano dal cordone e allinearla con la trappola ottica, quindi registrare il movimento del cordone per uno o due minuti per misurare la posizione di equilibrio.

Ridurre il più possibile la pressione all'interno della micropipetta senza perdere la vescicola per diminuire la tensione della membrana e portare con cautela la vescicola a contatto con il cordone per circa un secondo per stabilire i legami streptavidina-biotina. Quindi, utilizzando un attuatore piezoelettrico, tirare delicatamente indietro la vescicola per creare un nanotubo. Aumentare la pressione di aspirazione per ricreare la linguetta di aspirazione e allineare il tubo all'interno dell'asse della pipetta di aspirazione.

Mettere a fuoco il tubo e la vescicola e registrare il movimento del cordone a una velocità di acquisizione di 30 hertz e l'altezza del serbatoio dell'acqua rispetto alla posizione zero per alcuni minuti al microscopio a campo chiaro. Quando tutte le immagini sono state ottenute, registrare nuovamente il movimento del cordone a diverse pressioni di aspirazione e tensioni della membrana. Per iniettare proteine o molecole di interesse, avvicinare la micropipetta per iniezione al nanotubo, facendo attenzione che la perlina nella trappola ottica non sia perturbata, e iniettare delicatamente le proteine a uno o due pascal di pressione.

Dopo che il legame proteico si è equilibrato, ripetere le misurazioni graduali in presenza delle proteine aggiunte, come dimostrato per la membrana nuda. Le misurazioni della forza e del raggio su nanotubi estratti da vescicole DOPC al 100% sono indipendenti, poiché la forza viene misurata dallo spostamento della perlina nella trappola ottica e dal raggio dall'intensità della fluorescenza, fornendo due modi per calcolare la rigidità di flessione della membrana. L'arricchimento relativo di BAR o proteine canale del potassio sui tubi di membrana sopra le vescicole sottostanti indica che le proteine hanno maggiori probabilità di legarsi alle membrane curve.

Infatti, il legame della proteina N-BAR endofilina A2 alla membrana riduce gradualmente la forza del tubo a zero, indicando la formazione di un'impalcatura tridimensionale che mantiene stabile il tubo. Seguendo questa procedura, altre tecniche possono essere combinate per rispondere a ulteriori domande, ad esempio la microscopia ad alta risoluzione per rilevare l'organizzazione delle proteine sui tubi a membrana o il tracciamento di singole particelle per misurare la mobilità delle proteine.