Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

L'obiettivo generale di questo protocollo istologico e di imaging è quello di presentare un sistema robusto che preservi l'antigenicità epitolica e l'integrità strutturale della pelle, consentendo il pieno sfruttamento delle modalità di imaging confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in cui è necessario esaminare la natura di qualsiasi tipo di cellula all'interno di una complessa architettura tissutale tridimensionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche istologiche standard è che è robusta e facile da eseguire.

Inoltre, il protocollo integra perfettamente l'analisi tridimensionale nella microscopia confocale. Inizia tagliando la pelle raccolta dalla regione mediale dorsale di un topo in pezzi rettangolari. Ogni pezzo dovrebbe essere dimensionato per adattarsi al fondo di un criostampo.

Qui viene dimostrata un'area di un centimetro quadrato di pelle dorsale che si inserisce in un criopoldo di 22 millimetri x 30 millimetri x 20 millimetri. Dopo il fissaggio, spingere la pelle lavata sul fondo dello stampo riempito con OCT in modo che sia a filo con il fondo. Segna l'orientamento del follicolo pilifero sul criostampo, poiché ciò determina l'orientamento del taglio criogenico.

Trasferisci i blocchi criogenici su una piastra metallica in un congelatore a meno 80 gradi per evitare il galleggiamento e la dislocazione del tessuto. Monitorare il processo di congelamento per mantenere l'orientamento della pelle nella parte inferiore del criostampo, poiché bolle d'aria invisibili possono causare la risalita della pelle sulla superficie del criostampo. Inizia fissando un crioblocco congelato allo stadio di un criostato con l'orientamento del follicolo pilifero, come indicato sul criopoldo lungo il piano di sezionamento.

La corretta regolazione dell'esatto orientamento del follicolo pilifero sul criostato è fondamentale, poiché questo passaggio determina il piano di sezione che genera fette di pelle con l'intera lunghezza dei follicoli piliferi intatta. Utilizzare il criostato per tagliare una sezione di 100 micron. Afferrare l'OCT attorno al pezzo di pelle incorporato con una pinza e trasferire la sezione fuori dal criostato nella coltura da 100 millimetri riempita di PBS.

A temperatura ambiente, il PBS dissolverà l'OCT, lasciando fette di pelle facili da maneggiare con una pinza. Dopo il sezionamento, utilizzare una pinza per trasferire le sezioni cutanee galleggianti nel pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 2,5 millilitri di PBS. Iniziare la marcatura con immunofluorescenza aggiungendo prima 500 microlitri di tampone PB alle provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettate.

Utilizzare con cautela una pinza per trasferire le fette di pelle dalla piastra a 12 pozzetti nelle provette per il bloccaggio. Assicurati che tutte le fette di pelle siano completamente sommerse. Posizionare le provette per microcentrifuga su un bilanciere per altalena a 10 oscillazioni al minuto o meno, per un'ora a temperatura ambiente.

Etichettare provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri separate per ogni fetta di pelle e aggiungere 500 microlitri di tampone PB contenente la quantità appropriata di anticorpi primari. Dopo un'ora di blocco, trasferire le fette di pelle nelle provette appena preparate contenenti gli anticorpi. Incubare le fette a quattro gradi Celsius per una notte a bassa velocità su un bilanciere.

Il giorno successivo, trasferire le fette in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di PBS e lavare per un'ora a temperatura ambiente su un bilanciere. Quindi, trasferire le fette in provette da microcentrifuga separate da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di tampone PB con la concentrazione appropriata di anticorpi secondari e DAPI. Incubare a temperatura ambiente per un'ora con oscillazione, se lo si desidera, i campioni possono essere conservati per un massimo di quattro giorni a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione.

Prima dell'imaging, trasferire le fette di pelle in provette da microcentrifuga separate contenenti 500 microlitri di PBS per lavare gli anticorpi secondari e il DAPI. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti da 22 millilitri per 50 millilitri su uno sfondo scuro sotto un microscopio da dissezione. Quindi, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri con l'estremità del puntale tagliata, per aggiungere una goccia di glicerolo al 100% sul vetrino coprioggetti.

Trasferire la fetta di pelle dalla provetta da microcentrifuga sulla gocciolina di glicerolo. Quindi, mentre guardi attraverso il microscopio da dissezione, usa una pinza appuntita per srotolare con cura le fette di pelle che sono arricciate convincendole a tornare alla loro forma naturale mentre galleggiano nel glicerolo. Non forzare il raddrizzamento innaturale della fetta, poiché ciò potrebbe causare danni al tessuto.

Una volta che l'intera lunghezza della sezione è correttamente orientata e appiattita sul vetrino coprioggetto. Monta il tessuto su un normale vetrino da microscopio, questo passaggio raddrizzerà ulteriormente la fetta di pelle. Immagine delle sezioni cutanee montate in glicerolo entro i prossimi due giorni.

Questa immagine mostra una criosezione cutanea di 10 micron di spessore, ottenuta in modo classico, marcata con integrina alfa sei e integrina alfa otto, per visualizzare rispettivamente il compartimento epidermico e i muscoli pili direzionali. Questa sezione trasversale di tessuto 3D spessa 100 micron è stata etichettata allo stesso modo. L'immagine mostrata è la proiezione massima di un grande stack z.

I dettagli di entrambe le immagini sono confrontati fianco a fianco qui, nelle classiche sezioni congelate, la maggior parte dei follicoli piliferi visualizzati con l'integrina alfa sei non sono stati sezionati per l'intera lunghezza, generando prevalentemente follicoli piliferi incompleti per sezione, rispetto ai montamenti interi orizzontali. I follicoli piliferi intatti e i muscoli arrettori dei pili intatti sono stati quantificati sia nella sezione classica che in quella orizzontale del montaggio domestico. È stata quantificata una sezione per la replicazione biologica, come si vede qui, l'intera sezione di montaggio ha una percentuale maggiore di follicoli intatti e muscoli erettori dei pili.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di criosezione può essere eseguita a velocità superiori a 15 sezioni al minuto, ottenendo campioni perfettamente orientati se il montaggio è stato eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare e analizzare sezioni trasversali di tessuti spessi in un ambiente tridimensionale.