Name: Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Impara un protocollo di elaborazione e imaging per sezioni trasversali spesse di pelle tridimensionale. Questo metodo preserva l'antigenicità e l'integrità strutturale, consentendo l'analisi completa con microscopia confocale.

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Gli autori riconoscono la sponsorizzazione da Thermo-Fisher Scientific e ringraziano il Centro Imaging Nikon di Kings College London per il supporto durante l&#39;acquisizione di immagini confocali.

Tutti gli esperimenti su animali sono stati sottoposti all&#39;approvazione etica locale e sono stati eseguiti in base a una licenza Home Office del governo del Regno Unito. 1. Raccolta della pelle e criopreservazione <ol><li> I preparativi. <ol><li> Preparare un piatto di coltura da 100 mm con 25 ml di PFA al 4% e due piatti da 100 mm di coltura con 25 ml di soluzione salina con tampone fosfato (PBS). </li><li> Riempire i criomodelli rettangolari di scorrimento per due terzi con composto ottimale della temperatura di taglio (OCT). </li><li> Posizionare una piastra metallica, su cui i crioblocchi possono essere posizionati in una fase successiva, nel congelatore -80 ° C. </li></ol></li><li> Raccolta della pelle, fissazione e crioconservazione. <ol><li> Clip la regione dorsale del cadavere animale con un rasoio elettrico asciutto. NOTA: In questo esempio sono stati utilizzati i topi selvatici tipo 21 del giorno postnatale. </li><li> Raccogli le aree di interesse sulla pelle. NOTA: la regione dorsomediale della pelle del topo ( <stronFigura 1a) contiene la più alta percentuale di follicoli piliferi che sono uniformemente distanziati e allineati, che consente un orientamento ottimale per la sezione. La rimozione del sottostante tessuto non dermico non è necessaria ma può essere eseguita se necessario. </li><li> Tagliare la pelle raccolta in pezzi rettangolari di dimensione appropriata per inserire nel fondo del criomolo, prendendo in considerazione la crescita direzionale del grano del follicolo pilifero. NOTA: Le fette della pelle più piccole potrebbero essere più facili da gestire per i novizi, in quanto sono meno probabili confondere durante l&#39;incubazione e il processo di montaggio. L&#39;esempio mostrato qui è una superficie di circa 1 cm 2 di pelle dorsale, che si inserisce in un criomodo da 22 x 30 x 20 mm ( Figura 2a ). </li><li> Fissare la pelle a temperatura ambiente in 25 mL di 4% PFA per 10-30 minuti, a seconda dello spessore dei campioni della pelle ( Figura 1b ). </li><li> Lavare i campioni della pelle due volte in 25 ml di PBSPer almeno 5 minuti ciascuno ( Figura 1b ). </li><li> Sfilare i campioni di pelle su un tovagliolo di carta per scaricare con cautela il tessuto dell&#39;eccesso di PBS, che può provocare la cristallizzazione durante il processo di congelamento e può influenzare i risultati della crisi. NOTA: Non è richiesto un gradiente standard di saccarosio. Tuttavia, questo può anche essere incorporato nel protocollo a discrezione dell&#39;utente. </li><li> Sii consapevole dell&#39;orientamento dei follicoli piliferi per ogni campione di pelle. Utilizzare un microscopio di dissezione per l&#39;assistenza visiva (in particolare chi esegue il protocollo per la prima volta). Inserire il campione della pelle nel criomolo riempito con OCT e bilanciare tutte le zone della pelle con OCT rimuovendo le bolle d&#39;aria collegate alla superficie dei capelli tagliati con le pinze ( figure 2a e 2b ). </li><li> Spingere la pelle nella parte inferiore del blocco OCT riempito in modo che si trovi in ​​filo con il fondo. NOTA: la pelle può essere orientata in qualsiasi direzione, aS lungo come il grano del follicolo pilifero è notato per le procedure di taglio corrette. I criomogeni saranno riorientati quando i blocchi sono attaccati al criostato per crioconservazione. Segnare l&#39;orientamento del follicolo pilifero sul criomolo, poiché questo passo determina l&#39;orientamento successivo del taglio del criosta. </li><li> Trasferire i criolablotti sulla piastra metallica nel congelatore -80 ° C per evitare galleggiamenti e dislocazione del tessuto. </li><li> Monitorare il processo di congelamento per mantenere l&#39;orientamento della pelle nella parte inferiore del criomolo, in quanto le bolle d&#39;aria invisibili possono causare la pelle a salire sulla superficie del crioacollo. NOTA: I cryomolds con tessuto congelato possono essere conservati per più di un anno a -80 ° C e possono essere riutilizzati per ulteriori sezioni. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Figura 1. Raccolta e fissazione della pelle del mouse. </strong&gt; (A) tessuto cutaneo è stato raccolto dalla regione dorsomediale del cadavere dell&#39;animale. I follicoli dei capelli in questa regione sono uniformemente distanziati e allineati e quindi consentono un orientamento ottimale durante la sezione, come indicato dalle frecce. B ) Dopo aver tagliato quadrati di una dimensione appropriata che si inserisce nel criomolo, il tessuto cutaneo è stato fissato in PFA al 4% per 15 minuti e lavato due volte in PBS per 5 minuti ciascuno. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 2. Sezione trasversale del tessuto spessore <ol><li> Preparazione e orientamento del tessuto per montare sul criostato. <ol><li> Preparare un piatto di coltura da 100 mm con 15 ml di PBS. Mettere su un&#39;area facilmente accessibile sul criostato. Inoltre, preparare una piastra da 12 pozzetti con 2,5 ml di PBS per pozzetto; Etichetta secondo i campioni per l&#39;immagazzinamento a lungo termine del seA 4 ° C. Utilizzare pinze per gestire le sezioni. </li><li> Regolare la temperatura del criostato a -20 ° C. NOTA: La temperatura può influenzare la sezione, ma una buona guida deve iniziare a -20 ° C. </li><li> Per ottenere sezioni di circa due follicoli follicoli spessi, regolare il criostato per tagliare sezioni 150 μm di spessore. NOTA: Lo spessore della sezione può essere variato, in funzione delle esigenze dell&#39;utente e delle limitazioni del microscopio che verrà utilizzato per l&#39;analisi. NOTA: L&#39;orientamento del campione è fondamentale per ottenere sezioni di pelle con follicoli piliferi nell&#39;orientamento appropriato. Ciò è ottenuto montando correttamente sul blocco criostato. Assicurarsi che il piano di sezione sia parallelo all&#39;orientamento del follicolo pilifero ( Figura 2c ). Come accennato in precedenza, l&#39;orientamento corretto del piano di sezione nel campione della pelle è un passo cruciale per determinare la qualità delle immagini che saranno acquisite inUn passaggio successivo. </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Figura 2. Embedding, cryopreservation e sectioning. (A) La marcatura della direzione del follicolo pilifero (HF) sul criomodello, indicata dalle frecce nere, è importante per un corretto orientamento durante la criocondensazione. ( B ) Il piano di sezione deve essere allineato con l&#39;orientamento del follicolo pilifero per generare sezioni in cui la lunghezza totale dei follicoli piliferi rimane intatta ( c ) Le sezioni sono state tagliate per orientamento del follicolo pilifero indicato dalle frecce nere sul cryomold. ( D ) Le sezioni trasversali del tessuto sono state raccolte con pinze metalliche e ( e ) trasferite in un piatto di coltura da 100 mm contenente 1x PBS. ( F ) A temperatura ambiente, il PBS si dissolve l&#39;OC.T. Composto che circonda le sezioni trasversali del tessuto spesso, come indicato dalle frecce bianche. Le sezioni poi galleggiano liberamente nel PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="2"><li> Criosezionamento. <ol><li> Tagliare una sezione usando il criostato. Utilizzare pinze per raccogliere l&#39;OCT che contiene il pezzo di pelle incorporato ( Figura 2d ). NOTA: utilizzare un criostato che consente movimenti e regolazioni indipendenti lungo gli assi X, Y e Z per il posizionamento ottimale del campione. Ciò consente la generazione di sezioni trasversali del tessuto idealmente allineate. </li><li> Trasferire la sezione dal criostato nel piatto di coltura da 100 mm riempito con PBS e proseguire con la fetta successiva. Non raccogliere i campioni su una diapositiva ( Figura 2e ). NOTA: a temperatura ambiente, il PBS si dissolveràIl PTOM, lasciando fette di pelle che sono facili da gestire con pinze ( Figura 2f ). NOTA: PBS fresco può essere necessario nel piatto di coltura da 100 mm dopo aver dissolto molte sezioni di tessuto 100 μm e può essere modificato di conseguenza. </li><li> Utilizzare pinze per trasferire le sezioni di pelle galleggianti al pozzetto correttamente etichettato in una piastra a 12 pozzetti riempiti di 2,5 ml di PBS ( figura 3a , sinistra). NOTA: a 4 ° C i campioni possono essere conservati per almeno due giorni. Per la conservazione a lungo termine di blocchi OCT contenenti pelle dopo la sezionatura, sigillare la superficie di taglio con una gocciolina di fresco OCT. Dopo il congelamento della gocce OCT, avvolgere il blocco OCT utilizzato in parafilm e riporlo nel congelatore -80 ° C . </li></ol></li></ol> 3. Etichettatura immunofluorescenti. <ol><li> Preparare il buffer PB (PBS integrato con 0,5% di latte scremato in polvere, 0,25% di gelatina di pesce e 0,5% di Triton X-100)T 2 h in anticipo, come descritto in precedenza 5 . NOTA: L&#39;azido di sodio può essere aggiunto al buffer PB per la conservazione degli anticorpi per l&#39;uso ripetuto del tampone di colorazione. </li><li> Etichetta 1,5 ml di tubi di microcentrifuga e aggiungere 500 μl di buffer PB per tubo. Utilizzare attentamente le pinze per trasferire le fette della pelle dal PBS in tubi separati contenenti il ​​buffer PB per bloccare ( Figura 3a , a destra). Assicurarsi che tutte le fette della pelle siano completamente sommerse. Posizionare i tubi di microcentrifuga su un bilanciere a sega a velocità non superiori a 10 oscillazioni al minuto, che non devono disturbare l&#39;integrità dei tessuti, per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: È fondamentale che la velocità non superi le 10 oscillazioni al minuto sul bilanciere della visiera, poiché indurirà la rottura. <ol><li> Mentre è possibile aggiungere più di una fetta per tubo di microcentrifuga, per salvare gli anticorpi, inserire solo una fetta per tubo. Per diminuire l&#39;utilizzo di anticorpi, utilizzare un volumeDi 250 μL. NOTA: se necessario, sostituire i tubi di microcentrifuga con, ad esempio, piatti a 96 pozzetti. Tuttavia, il posizionamento delle sezioni trasversali di tessuto spesso in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml consente la penetrazione più efficace nel tessuto a causa della maggiore perturbazione del liquido. </li></ol></li><li> Etichettare separare i tubi da 1,5 ml di microcentrifuga per ogni fetta della pelle e aggiungere 500 μl di PB buffer e la quantità appropriata di anticorpi primari. Dopo 1 ora di blocco, trasferire le fette della pelle nei tubi appena preparati contenenti gli anticorpi. Incubare le fette a 4 ° C per una notte. NOTA: In questo esempio sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: FITC ratto anti-umano CD49f ad una concentrazione di 1:50 e capsula anti-mouse / ratto integrin alfa 8 ad una concentrazione di 1: 100. </li><li> Il giorno dopo, preparare due piccoli tubi di microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 500 μL di PBS per campione. Lavare le fette della pelle due volte per 1 h a temperatura ambientee. </li><li> Preparare separati tubi di microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 500 μl di PB tampone con la concentrazione appropriata di anticorpi secondari applicabili e 4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI). NOTA: Gli anticorpi secondari utilizzati in questo esempio sono Alexa Fluor 488 asino anti-rat IgG e Alexa Fluor 555 asino anti-capra IgG a una concentrazione di 1: 500. DAPI è stato utilizzato ad una concentrazione di 1: 100. </li><li> Trasferire con cura i campioni della pelle nel tampone PB, che contiene l&#39;anticorpo secondario e DAPI e incubare le fette della pelle a temperatura ambiente per 1 ora a bassa velocità su un rotatore o scuotitore. </li><li> Memorizzare le fette a 4 ° C nel buffer PB contenente l&#39;anticorpo secondario e DAPI per un massimo di quattro giorni e forse più a lungo se l&#39;azide di sodio viene aggiunto al PBS. </li></ol><img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Figura 3. ImmunofluorescL&#39;etichettatura e il montaggio. (A) Le sezioni di tessuto galleggiante possono essere memorizzati in piastre da 12 pozzetti per almeno due giorni a 4 ° C. Prima dell&#39;etichettatura immunofluorescenti (IF), trasferire le sezioni tissutali di interesse interessate in 1,5 mL di microcentrifuga contenenti tampone PB per il blocco, come indicato dalla freccia 1. Per l&#39;etichettatura IF, attenersi alla procedura a più fasi elaborata al punto 3. Ogni Parte del passaggio 3 richiede l&#39;attento trasferimento delle sezioni di tessuto in tubi di microcentrifuga appena preparati contenenti soluzione anticorpale primaria, soluzione anticorpale secondaria o tampone di lavaggio indicata dalla freccia 2. b ) Dopo l&#39;etichettatura IF, Le sezioni vengono distrutte e appiattite in una gocciolina di glicerolo, utilizzando l&#39;assistenza di un microscopio di dissezione. ( C ) Una volta che la sezione trasversale del tessuto è interamente appiattita sul fondo di una sfoglia di copertura, viene utilizzata una scorrevole normale del microscopio per montare la sezione. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 4. Montaggio per la visualizzazione microscopica <ol><li> Prima dell&#39;immagine, trasferire le fette della pelle in tubi microcentrifuga separati contenenti 500 μL di PBS per lavare gli anticorpi secondari e DAPI. </li><li> Usare una pipetta da 1000 μL ma tagliare i primi 0,5 cm della punta della pipetta per consentire la corretta pipettazione del glicerolo altamente viscoso. Posizionare una copertura di 22 x 50 mm su uno sfondo scuro sotto un microscopio di dissezione ( Figura 3b ). </li><li> Aggiungere una gocciolina al glicerolo al 100% sullo scorrimento della copertura ( figura 3b ). Trasferire la fetta della pelle dal tubo di microcentrifuga sulla gocce di glicerolo. Utilizzare il microscopio di dissezione e le punte appuntite per disinnestare con attenzione le fette della pelle che sono arricciate. NOTA: quando la fetta galleggia nell&#39;aggCerolo, può essere incastrato dal coassificare la naturale propensione del tessuto per ritornare alla sua forma normale. Non forzare il raddrizzamento innaturale della fetta, in quanto ciò potrebbe causare danni al tessuto. </li><li> Montare il tessuto una volta che l&#39;intera lunghezza della sezione della pelle sia correttamente orientata e appiattita sullo scivolo della copertura; Utilizzare una diapositiva normale del microscopio. Questa fase consente di raddrizzare ulteriormente la fetta della pelle. NOTA: Evitare l&#39;entrapimento dell&#39;aria ( Figura 3c ). </li><li> Inserire le sezioni della pelle in glicerolo nei prossimi due giorni. NOTA: L&#39;archiviazione prolungata influenzerà negativamente la qualità del tessuto e dell&#39;immagine. In questo esempio, tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale verticale usando un obiettivo di 20x. </li></ol>

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</ol>

Gli autori vorrebbero rivelare che la pubblicazione di questo manoscritto è stata finanziata da Thermo-Fisher Scientific Inc.

Qui presentiamo la tecnica del "montaggio intero orizzontale", che presenta diversi vantaggi rispetto alle classiche sezioni congelate. Un vantaggio della nostra tecnica è che può essere facilmente eseguita con apparecchiature istologiche standard e un microscopio confocale. In secondo luogo, l'integrità dei tessuti viene preservata in modo superiore rispetto alle criosezioni standard. Ad esempio, gli adipociti all'interno dello strato ipodermico (cioè gli adipociti bianchi dermici (DWAT))9 sono gravemente danneggiati nelle criosezioni standard, il che rende impossibile lo studio dei tessuti carichi di adiposi. La nostra tecnica consente l'analisi completa degli adipociti in questo strato e può essere adattata ad altri tessuti con un alto contenuto di adipociti. Inoltre, ciò consente una migliore rilevazione delle cellule mesenchimali negli studi di tracciamento del lignaggio 2,10.
Le criosezioni standard, per loro stessa natura, non possono mai rivelare i veri aspetti 3D di un tessuto attraverso la microscopia confocale. Ciò significa che le sezioni più spesse sono vantaggiose nell'analisi della pelle, poiché i follicoli piliferi, così come le loro sottostrutture, possono attraversare una profondità che supera lo spessore standard di 10 μm utilizzato nelle crisosezioni classiche. Siamo incuriositi dal fatto che altri tessuti, come l'intestino e il cervello, ad esempio, possiedano sfide simili per quanto riguarda la visione del tessuto come una struttura 3D 2,7,11,12,13. Curiosamente, la nostra tecnica ha già dimostrato di essere utile per l'uso in alcune applicazioni nell'intestino14. Riteniamo che il nostro protocollo orizzontale a montaggio intero abbia il potenziale per essere applicato a qualsiasi altro tessuto che richieda un'analisi 3D.

La rivoluzione dell&#39;apparecchiatura di imaging microscopica prevede sofisticati strumenti di imaging ad alta risoluzione. Tuttavia, quando acquisisce un&#39;immagine microscopica di una sezione trasversale del tessuto tridimensionale (3D) completa, la preparazione del campione presenta notevoli sfide e può essere il fattore limitante nella definizione della qualità dell&#39;immagine. Ogni passo separato merita una considerazione attenta per preservare la morfologia del tessuto e l&#39;antigenicità delle proteine ​​bersaglio, per ridurre al minimo gli artefatti derivanti dalla trasformazione e per massimizzare la qualità dell&#39;immagine finale. Ad esempio, l&#39;analisi tradizionale della pelle richiede un&#39;immagine in vista dell&#39;epidermide e del derma, con follicoli piliferi che sono correttamente orientati, consentendo l&#39;analisi anatomica dei contributi del compartimento delle cellule staminali all&#39;omeostasi cutanea 1 , 2 . Ciò richiede una concentrazione approfondita su come la pelle sia incorporata e sezionata. Importante, i follicoli piliferi possono essere più spessoDi 100 μm, che supera notevolmente lo spessore della paraffina o dello spessore congelato, determinando uno standard inferiore di analisi rispetto ai montanti interi o alle sezioni trasversali 3 , 4 , 5 . Considerati insieme, ogni fase di preparazione del campione per l&#39;analisi microscopica è un determinante critico che influenzerà l&#39;analisi delle immagini. Qui viene presentato un nuovo protocollo di elaborazione per l&#39;analisi trasversale del tessuto 3D, che noi chiamiamo &quot;montaggio orizzontale intero&quot;. Il protocollo altamente conserva l&#39;antigenicità e consente il pieno sfruttamento di spessori della pelle usando apparecchiature standard per la formazione di immagini confocali. Questa è una guida completa per l&#39;utilizzo della pelle per la lavorazione e l&#39;imaging della sezione trasversale del tessuto spesso, inclusa la criopreservazione assistita da paraformaldehide (PFA) (fase 1), la generazione di sezioni trasversali di 100 μm con un criostato (passo 2) E l&#39;etichettatura e il montaggio immunofluorescenti (punti 3 e 4). I risultati rappresentativi confrontano le immagini confocali di due distinte tecniche di preparazione istologica: la criocondazione classica e la sezione trasversale di tessuto 3D, spesso evidenziando i vantaggi di &quot;montanti interni orizzontali&quot; per il potenziale utente di questo protocollo.

<table><tbody><tr><td>PBS Gelatina</td><td></td><td></td><td>fatta in casa</td></tr><tr><td>, da pelle di pesce d'acqua fredda</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>BDH Forniture da laboratorio</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. composto</td><td>VWR prodotti chimici</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way stampi per inclusione Sigma</td><td></td><td>E6032-1CS</td><td>Square S-22</td></tr><tr><td>Latte in polvere senza grassi</td><td>Bio Base Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilidolo, dilattato (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody</td><td>R& D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-ratto IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 asino anti-capra IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm Piatti</td><td></td><td></td><td></td>di coltura</tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr>pinze <td></td><td></td><td></td><td>metalliche appuntite</td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 12 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul e 1000 ul Pipetta</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro; l Punta graduata XLun puntale filtrante (sterile)</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro; l Puntale filtrante TipOne smussato (sterile)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td><td></td>shaker oscillante</tr><tr><td>Vetrini per microscopio, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td> Occhiali di copertura <td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

L&#39;elaborazione di un tessuto di interesse per generare un&#39;immagine microscopica che supporta un argomento scientifico può essere impegnativa. L&#39;acquisizione di immagini microscopiche di alta qualità non dipende interamente dalla qualità del microscopio, ma anche dai metodi di elaborazione dei tessuti, che spesso comportano azioni o passi multipli. Inoltre, i tipi di cellule mesenchimali nella pelle e negli altri tessuti rappresentano una nuova sfida per la preparazione e l&#39;imaging dei tessuti. Qui presentiamo un processo completo, dalla raccolta dei tessuti alla microscopia. La nostra tecnica, chiamata &quot;montatura orizzontale&quot;, è quella che i novizi possono rapidamente diventare competenti e che consente la conservazione e la rilevazione di antigeni in sezioni di spessore di 60-300 μm tagliate con un criostato. Le sezioni di questo spessore forniscono una migliore visualizzazione della microarchitettura del tessuto in un ambiente tridimensionale. Inoltre, il protocollo conserva le cellule mesenchimali in modo da migliorare la qualità dell&#39;immagine quandoRispetto alle sezioni di criostato o paraffina standard, aumentando così l&#39;efficacia e l&#39;affidabilità dell&#39;immunodellazione. Crediamo che questo protocollo beneficerà di tutti i laboratori che visualizzano la pelle e possibilmente altri tessuti e organi.

Per sottolineare i vantaggi della nostra tecnica, abbiamo confrontato la nostra tecnica di crociatura 3D, &quot;montatura orizzontale intera&quot;, a sezioni classiche congelate. Le sezioni congelate classiche sono state tagliate come descritto in precedenza 5 . Per fornire una struttura visiva per l&#39;epidermide in immagini microscopiche, abbiamo immaginato per l&#39;integrin alfa-6 (Itga6), che è un componente che ancora le cellule epidermiche alla membrana basale sottostante 6 . Abbiamo anche etichettato l&#39;arretro pili muscle (APM), che è responsabile della piloerection (conosciuta anche come &quot;goosebumps&quot;), con integrin alpha-8 7 . Nelle sezioni congelate classiche, la maggior parte dei follicoli piliferi visualizzati con Itga6 non sono stati tagliati lungo tutta la lunghezza, generando follicoli piliferi prevalentemente incompleti per sezione, rispetto ai montanti interni orizzontali ( Figura 4a- 4d </strong&gt;). Le sezioni trasversali del tessuto spesso consentono di acquisire ulteriori livelli di Z-stack rispetto ai tradizionali sezioni di 10 μm, consentendo un&#39;immagine 3D più completa. Ciò diventa ancora più evidente quando si studia l&#39;integrità di APM, associati ai follicoli piliferi e alla membrana sovrastante. Nelle criose classiche, la vasta parte di APM è stata frazionata ( Figura 4a- 4d ). Inoltre, l&#39;integrità tissutale del compartimento ipodermico è conservata in montanti orizzontali, rispetto alla distruzione degli adipociti, quando le criose sono collegate a vetrate calde, che è un noto artefatto di congelamento e scongelamento ( Figura 4a- b , confronta ipodermica Regioni) 8 . <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Figura 4. Mou orizzontale interoNt rispetto ad una crisi classica. (A) rivestimento classico ottenuto criosezioni 10 um (b) 100 um di spessore del tessuto 3D sezioni sono state marcate con integrina alfa-6 (Itga6) e integrina alfa-8 (Itga8) per visualizzare le vano epidermica e arrector muscoli spessi e Pili , Rispettivamente. Le immagini delle sezioni trasversali del tessuto spesso sono rappresentate come proiezioni massime di un grande stack Z. I fotogrammi bianchi indicano le aree ingrandite, visualizzate in ( c ) le sezioni di montaggio classiche e ( d ) orizzontali. ( E ) i follicoli dei capelli intatti e ( f ) i muscoli intestinali del pili sono stati quantificati sia nelle sezioni classiche che orizzontali. Le barre di scala indicano 100 μm. I dati sono rappresentati come Medio ± errore standard del valore medio (SEM). Una sezione per replicazione biologica ( n = 3) è stata quantificata. T-test non accoppiato * P &lt;0,05, *** P &lt;0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo lavoro presenta un nuovo protocollo di elaborazione e di imaging per un&#39;analisi trasversale di tessuto tridimensionale che consente di sfruttare appieno le modalità di imaging confocale. Questo protocollo conserva l&#39;antigenicità e rappresenta un sistema robusto per analizzare l&#39;istologia cutanea e potenzialmente altri tipi di tessuti.

Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

L'obiettivo generale di questo protocollo istologico e di imaging è presentare un sistema affidabile che preservi l'antigenicità epiteliale e l'integrità strutturale della pelle, consentendo di sfruttare appieno le modalità di imaging confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in cui è necessario esaminare la natura di qualsiasi tipo di cellula all'interno di un'architettura tissutale tridimensionale complessa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche istologiche standard è che è affidabile e facile da eseguire.Inoltre, il protocollo si integra perfettamente con l'analisi tridimensionale mediante microscopia confocale. Iniziare tagliando la pelle prelevata dalla regione dorsale mediale di un topo in pezzi rettangolari. Ogni pezzo deve essere delle dimensioni adatte a entrare nella base di uno stampo criogenico.Viene mostrata un'area di pelle dorsale di un centimetro quadrato, che si adatta a un cryomold di 22 millimetri per 30 millimetri per 20 millimetri. Dopo la fissazione, spingere la pelle lavata sul fondo del mold riempito di OCT, in modo che aderisca completamente al fondo. Indicare sull'cryomold l'orientamento dei follicoli piliferi, poiché questo determina l'orientamento del taglio in criostato.Trasferire i blocchi criogenici su una piastra metallica all'interno di un congelatore a meno 80 gradi per evitare il galleggiamento e lo spostamento del tessuto. Monitorare il processo di congelamento per mantenere l'orientamento della pelle in fondo allo stampo criogenico, poiché bolle d'aria non visibili potrebbero far risalire la pelle alla superficie dello stampo. Iniziare fissando un blocco criogenico congelato sulla piattaforma di un criostato, rispettando l'orientamento dei follicoli piliferi indicato sullo stampo criogenico lungo il piano di sezionamento.L'adeguata regolazione dell'orientamento preciso del follicolo pilifero sul criostato è fondamentale, poiché questo passaggio determina il piano di sezione che genera fette di pelle con l'intera lunghezza dei follicoli piliferi intatti. Utilizzare il criostato per tagliare una sezione di 100 micron. Afferrare l'OCT intorno al campione di pelle inclusa con una pinzetta e trasferire la sezione dal criostato nella piastra da coltura da 100 millimetri riempita con PBS.A temperatura ambiente, il PBS scioglierà l'OCT, lasciando fette di pelle facili da maneggiare con pinzette. Dopo il sezionamento, utilizzare pinzette per trasferire le sezioni di pelle galleggianti nel pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 2,5 millilitri di PBS. Iniziare l'etichettatura immunofluorescente aggiungendo prima 500 microlitri di tampone PB in provette microcentrifughe da 1,5 millilitro precedentemente etichettate.Utilizzare con attenzione la pinzetta per trasferire le fette di pelle dalla piastra a 12 pozzetti nei tubi per il bloccaggio. Assicurarsi che tutte le fette di pelle siano completamente immerse. Posizionare i tubi da microcentrifuga su un agitatore oscillante a 10 oscillazioni al minuto o meno, per un'ora a temperatura ambiente.Etichettare provette microcentrifughe da 1,5 millilitro separate per ciascuna fetta di pelle e aggiungere 500 microlitri di tampone PB contenente la quantità appropriata di anticorpo primario. Dopo un'ora di bloccaggio, trasferire le fette di pelle nelle provette appena preparate contenenti gli anticorpi. Incubare le fette a quattro gradi celsius durante la notte a bassa velocità su un agitatore rocker.Il giorno successivo, trasferire le sezioni in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di PBS e lavare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore rocker. Successivamente, trasferire le sezioni in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri separate, contenenti 500 microlitri di tampone PB con la concentrazione appropriata di anticorpi secondari e DAPI. Incubare a temperatura ambiente per un'ora con agitazione; se desiderato, i campioni possono essere conservati fino a quattro giorni a quattro gradi Celsius prima di ulteriori elaborazioni.Prima dell'acquisizione delle immagini, trasferire le fette di pelle in provette microcentrifuga separate contenenti 500 microlitri di PBS per lavare gli anticorpi secondari e il DAPI. Quindi posizionare un'immersione da 22 millilitri per 50 millilitri su uno sfondo scuro sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri con l'estremità del puntale tagliata per aggiungere una goccia di glicerolo al 100% sull'immersione.Trasferire la fetta di pelle dal tubo microcentrifuga sulla goccia di glicerolo. Quindi, osservando attraverso il microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette appuntite per svolgere con cura le fette di pelle arrotolate, riportandole delicatamente alla loro forma naturale mentre galleggiano nel glicerolo. Non forzare il distendimento innaturale della fetta, poiché ciò potrebbe causare danni al tessuto.Una volta che l'intera lunghezza del campione è stata correttamente orientata e appiattita sul vetrino coprioggetto, montare il tessuto su un normale vetrino da microscopio; questo passaggio contribuirà ulteriormente a raddrizzare la sezione cutanea. Acquisire le immagini delle sezioni di pelle montate in glicerolo entro i successivi due giorni.Questa immagine mostra una sezione crio di pelle ottenuta classicamente, spessa 10 micron, marcata con integrina alfa sei e integrina alfa otto, per visualizzare rispettivamente il compartimento epidermico e i muscoli arrectori del pelo. Una sezione trasversale di tessuto 3D spessa 100 micron è stata marcata nello stesso modo. L'immagine mostrata è la proiezione massima di un ampio stack z.Il dettaglio di entrambe le immagini viene confrontato qui fianco a fianco: nelle sezioni congelate classiche, la maggior parte dei follicoli piliferi visualizzati con integrina alfa sei non erano sezionati lungo tutta la loro lunghezza, generando prevalentemente follicoli incompleti per ogni sezione, rispetto ai preparati interi orizzontali. I follicoli piliferi integri e i muscoli arrectori del pelo integri sono stati quantificati sia nelle sezioni classiche che in quelle di montaggio orizzontale. È stata quantificata una sezione per replica biologica; come mostrato qui, la sezione in preparato intero presenta una proporzione maggiore di follicoli e muscoli arrectori del pelo integri.Una volta padroneggiata, questa tecnica di criosezionamento può essere eseguita a velocità superiori a 15 sezioni al minuto, ottenendo campioni perfettamente orientati se il montaggio è stato effettuato correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come processare e analizzare sezioni trasversali di tessuto spesse in un ambiente tridimensionale.

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Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

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