Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

L'obiettivo generale di questo protocollo istologico e di imaging è presentare un sistema affidabile che preservi l'antigenicità epiteliale e l'integrità strutturale della pelle, consentendo di sfruttare appieno le modalità di imaging confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in cui è necessario esaminare la natura di qualsiasi tipo di cellula all'interno di un'architettura tissutale tridimensionale complessa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche istologiche standard è che è affidabile e facile da eseguire.

Inoltre, il protocollo si integra perfettamente con l'analisi tridimensionale mediante microscopia confocale. Iniziare tagliando la pelle prelevata dalla regione dorsale mediale di un topo in pezzi rettangolari. Ogni pezzo deve essere delle dimensioni adatte a entrare nella base di uno stampo criogenico.

Viene mostrata un'area di pelle dorsale di un centimetro quadrato, che si adatta a un cryomold di 22 millimetri per 30 millimetri per 20 millimetri. Dopo la fissazione, spingere la pelle lavata sul fondo del mold riempito di OCT, in modo che aderisca completamente al fondo. Indicare sull'cryomold l'orientamento dei follicoli piliferi, poiché questo determina l'orientamento del taglio in criostato.

Trasferire i blocchi criogenici su una piastra metallica all'interno di un congelatore a meno 80 gradi per evitare il galleggiamento e lo spostamento del tessuto. Monitorare il processo di congelamento per mantenere l'orientamento della pelle in fondo allo stampo criogenico, poiché bolle d'aria non visibili potrebbero far risalire la pelle alla superficie dello stampo. Iniziare fissando un blocco criogenico congelato sulla piattaforma di un criostato, rispettando l'orientamento dei follicoli piliferi indicato sullo stampo criogenico lungo il piano di sezionamento.

L'adeguata regolazione dell'orientamento preciso del follicolo pilifero sul criostato è fondamentale, poiché questo passaggio determina il piano di sezione che genera fette di pelle con l'intera lunghezza dei follicoli piliferi intatti. Utilizzare il criostato per tagliare una sezione di 100 micron. Afferrare l'OCT intorno al campione di pelle inclusa con una pinzetta e trasferire la sezione dal criostato nella piastra da coltura da 100 millimetri riempita con PBS.

A temperatura ambiente, il PBS scioglierà l'OCT, lasciando fette di pelle facili da maneggiare con pinzette. Dopo il sezionamento, utilizzare pinzette per trasferire le sezioni di pelle galleggianti nel pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 2,5 millilitri di PBS. Iniziare l'etichettatura immunofluorescente aggiungendo prima 500 microlitri di tampone PB in provette microcentrifughe da 1,5 millilitro precedentemente etichettate.

Utilizzare con attenzione la pinzetta per trasferire le fette di pelle dalla piastra a 12 pozzetti nei tubi per il bloccaggio. Assicurarsi che tutte le fette di pelle siano completamente immerse. Posizionare i tubi da microcentrifuga su un agitatore oscillante a 10 oscillazioni al minuto o meno, per un'ora a temperatura ambiente.

Etichettare provette microcentrifughe da 1,5 millilitro separate per ciascuna fetta di pelle e aggiungere 500 microlitri di tampone PB contenente la quantità appropriata di anticorpo primario. Dopo un'ora di bloccaggio, trasferire le fette di pelle nelle provette appena preparate contenenti gli anticorpi. Incubare le fette a quattro gradi celsius durante la notte a bassa velocità su un agitatore rocker.

Il giorno successivo, trasferire le sezioni in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di PBS e lavare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore rocker. Successivamente, trasferire le sezioni in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri separate, contenenti 500 microlitri di tampone PB con la concentrazione appropriata di anticorpi secondari e DAPI. Incubare a temperatura ambiente per un'ora con agitazione; se desiderato, i campioni possono essere conservati fino a quattro giorni a quattro gradi Celsius prima di ulteriori elaborazioni.

Prima dell'acquisizione delle immagini, trasferire le fette di pelle in provette microcentrifuga separate contenenti 500 microlitri di PBS per lavare gli anticorpi secondari e il DAPI. Quindi posizionare un'immersione da 22 millilitri per 50 millilitri su uno sfondo scuro sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri con l'estremità del puntale tagliata per aggiungere una goccia di glicerolo al 100% sull'immersione.

Trasferire la fetta di pelle dal tubo microcentrifuga sulla goccia di glicerolo. Quindi, osservando attraverso il microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette appuntite per svolgere con cura le fette di pelle arrotolate, riportandole delicatamente alla loro forma naturale mentre galleggiano nel glicerolo. Non forzare il distendimento innaturale della fetta, poiché ciò potrebbe causare danni al tessuto.

Una volta che l'intera lunghezza del campione è stata correttamente orientata e appiattita sul vetrino coprioggetto, montare il tessuto su un normale vetrino da microscopio; questo passaggio contribuirà ulteriormente a raddrizzare la sezione cutanea. Acquisire le immagini delle sezioni di pelle montate in glicerolo entro i successivi due giorni.

Questa immagine mostra una sezione crio di pelle ottenuta classicamente, spessa 10 micron, marcata con integrina alfa sei e integrina alfa otto, per visualizzare rispettivamente il compartimento epidermico e i muscoli arrectori del pelo. Una sezione trasversale di tessuto 3D spessa 100 micron è stata marcata nello stesso modo. L'immagine mostrata è la proiezione massima di un ampio stack z.

Il dettaglio di entrambe le immagini viene confrontato qui fianco a fianco: nelle sezioni congelate classiche, la maggior parte dei follicoli piliferi visualizzati con integrina alfa sei non erano sezionati lungo tutta la loro lunghezza, generando prevalentemente follicoli incompleti per ogni sezione, rispetto ai preparati interi orizzontali. I follicoli piliferi integri e i muscoli arrectori del pelo integri sono stati quantificati sia nelle sezioni classiche che in quelle di montaggio orizzontale. È stata quantificata una sezione per replica biologica; come mostrato qui, la sezione in preparato intero presenta una proporzione maggiore di follicoli e muscoli arrectori del pelo integri.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di criosezionamento può essere eseguita a velocità superiori a 15 sezioni al minuto, ottenendo campioni perfettamente orientati se il montaggio è stato effettuato correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come processare e analizzare sezioni trasversali di tessuto spesse in un ambiente tridimensionale.