Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

I mitocondri assorbono il calcio citosolico in quanto è essenziale per il loro corretto funzionamento.

L'eccessivo afflusso di calcio nella matrice mitocondriale - sovraccarico di calcio mitocondriale - innesca l'apertura di un canale interno della membrana, il poro di transizione della permeabilità mitocondriale, o MPTP. Il poro aperto consente un aumento dell'efflusso di calcio dai mitocondri, causando disfunzione mitocondriale.

Per misurare l'assorbimento mitocondriale del calcio, iniziare con una piastra a più pozzetti contenente mitocondri isolati sospesi in un tampone adatto. Integrare il pozzo con piruvato e malato, che sono substrati produttori di ATP. Mescolare il contenuto del pozzetto e incubare.

Durante l'incubazione, il piruvato e il malato vengono convertiti in ATP, energizzando i mitocondri. Aggiungere una soluzione contenente molecole di colorante fluorescente impermeabili alla membrana mitocondriale e sensibili al calcio. Erogare il tampone contenente calcio ai mitocondri energizzati.

Monitora la fluorescenza del calcio del colorante mentre le molecole del colorante si legano al calcio libero nel tampone.

Aggiungi più ioni calcio per avviare l'afflusso di calcio mi