Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

I mitocondri assorbono il calcio citosolico in quanto è essenziale per il loro corretto funzionamento.

L'eccessivo afflusso di calcio nella matrice mitocondriale - sovraccarico di calcio mitocondriale - innesca l'apertura di un canale interno della membrana, il poro di transizione della permeabilità mitocondriale, o MPTP. Il poro aperto consente un aumento dell'efflusso di calcio dai mitocondri, causando disfunzione mitocondriale.

Per misurare l'assorbimento mitocondriale del calcio, iniziare con una piastra a più pozzetti contenente mitocondri isolati sospesi in un tampone adatto. Integrare il pozzo con piruvato e malato, che sono substrati produttori di ATP. Mescolare il contenuto del pozzetto e incubare.

Durante l'incubazione, il piruvato e il malato vengono convertiti in ATP, energizzando i mitocondri. Aggiungere una soluzione contenente molecole di colorante fluorescente impermeabili alla membrana mitocondriale e sensibili al calcio. Erogare il tampone contenente calcio ai mitocondri energizzati.

Monitora la fluorescenza del calcio del colorante mentre le molecole del colorante si legano al calcio libero nel tampone.

Aggiungi più ioni calcio per avviare l'afflusso di calcio mitocondriale. Il calcio mitocondriale in graduale aumento diminuisce gli ioni calcio nel tampone, riducendo la fluorescenza del calcio del colorante.

Una volta che i mitocondri raggiungono la loro massima capacità di trasporto del calcio, l'ulteriore aggiunta di ioni calcio apre i canali MPTP e importa il calcio nel tampone. Il calcio tampone si lega alle molecole del colorante, causando un aumento della fluorescenza del calcio del colorante.

Tracciare la fluorescenza del colorante in diversi punti temporali dell'aggiunta di calcio per monitorare la cinetica dell'assorbimento mitocondriale del calcio.

Per avviare la misurazione dell'assorbimento di calcio mitocondriale utilizzando un lettore di piastre, programmare il lettore in modo che esegua una lettura cinetica della fluorescenza del verde di calcio-5N ogni secondo, per un tempo totale di 1.000 secondi.

Programmare gli iniettori dei reagenti in modo che eseguano 5 microlitri di soluzione di cloruro di calcio in vari punti temporali. Quindi, adescare gli iniettori con la soluzione di cloruro di calcio che verrà utilizzata.

Quindi, aggiungere 200 microgrammi di mitocondri isolati a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere il volume appropriato di tampone di cloruro di potassio per ottenere un volume totale di 197 microlitri. Quindi, aggiungere 1 microlitro di piruvato molare, 1 microlitro di malato da 500 millimolari e 1 microlitro di brodo di calcio verde-5N millimolare e mescolare delicatamente pipettando.

Incubare al riparo dalla luce a temperatura ambiente per 2 minuti, in modo che i mitocondri si energizzino. Infine, avviare il protocollo cinetico pre-programmato e monitorare la fluorescenza del verde di calcio-5N.