Un flusso di lavoro semplice migrazione/invasione utilizzando un Imager di vivere-cella automatizzata

L'attuale protocollo descrive un metodo integrato, indagando la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione su un'unica piattaforma in tempo reale, fornendo un'opzione facilmente riproducibile e tempo efficiente per studiare la morfologia e la mobilità delle cellule.

La mobilità delle cellule tumorali è fondamentale per l'inizio della metastasi. Pertanto, l'indagine sul movimento cellulare e sulla capacità invasiva delle cellule tumorali è di grande interesse. Questo metodo integrato per indagare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, su un'unica piattaforma in tempo reale, offre un'opzione facilmente riproducibile ed efficiente in termini di tempo per studiare la mobilità cellulare e la patologia.

Questo metodo può fornire informazioni sull'invasione delle cellule tumorali, attraverso la matrice extracellulare, e può essere applicato ad altri tipi di cellule. Per ottenere un tempo di graffio ottimale, assicurarsi che la densità di semina sia stata ottimizzata e non prolungare il periodo di incubazione una volta che il monostrato cellulare ha raggiunto la confluenza al 100%. Per determinare il numero ottimale di cellule sementi per un test di migrazione, posizionare le cellule in una serie di densità in triplice copia in una piastra a 96 pareti.

Inserire la lastra nell'imager delle celle dal vivo e selezionare le scansioni di pianificazione dall'elenco delle attività nel software imager. Nel riquadro di configurazione del cassetto determinare le posizioni della piastra e fare clic su aggiungi contenitore per selezionare il tipo di piastra. Nel riquadro di configurazione dell'analisi selezionare o modificare il modello di scansione in base alla configurazione sperimentale della piastra e impostare il tipo di scansione come standard.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare imposta intervalli. Quindi imposta aggiungi scansioni ogni due ore per 24 ore e fai clic su Applica. Dopo 24 ore, aprire la configurazione del cassetto per consentire la selezione della piastra sperimentale e fare clic su rimuovi contenitore.

Selezionare da tre a sei immagini rappresentative e posizionarle in una nuova raccolta di immagini. Per determinare una definizione di elaborazione corretta, utilizzare la regolazione della segmentazione, la pulizia e i filtri per applicare una maschera di confluenza appropriata e utilizzare l'anteprima corrente all'per visualizzare l'accuratezza delle maschere. Avviare il processo di analisi e determinare una densità cellulare ottimizzata, in base a una confluenza approssimativa del 100% rispetto al tempo, entro sei-diciotto ore, a seconda di quando inizia il test di migrazione.

Quindi, applicare lo strumento di analisi dell'elaborazione della confluenza alle immagini di contrasto di fase ad alta definizione raccolte automaticamente per generare una curva di proliferazione cellulare rispetto al tempo. Prima di iniziare il test, rivestire la piastra per il saggio di invasione con 50 microlitri di gel a matrice extracellulare, diluito in mezzo di coltura di celle ghiacciate, a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Quindi, posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare durante la notte.

Il pomeriggio successivo, aspirare delicatamente il mezzo in eccesso e placcare le cellule alla densità ottimizzata, in triplice copia, nei pozzi appropriati della piastra rivestita con matrice extracellulare e in un'ulteriore piastra non rivestita da 96 pozzetti. Quindi, posizionare i piatti nell'incubatore di coltura cellulare durante la notte. La mattina successiva, posizionare la piastra di dosaggio di migrazione non patinato nel supporto della piastra di base dello strumento scratch e utilizzare i tasselli guida per posizionare con cura la parte superiore del supporto sulla base.

Tenere premuta la leva nera sollevando con cura il blocco di perni per fare i graffi. I graffi in ogni pozzo dovrebbero essere visibili ad occhio nudo, così come al microscopio. Quindi, lavare la piastra una o due volte con un mezzo di coltura pre-riscaldato per rimuovere eventuali celle o fogli cellulari staccati.

Per il test di invasione, graffiare la piastra rivestita come appena dimostrato. Dopo aver rimosso eventuali celle e fogli staccati, utilizzare una scatola fredda pre-refrigerata per equilibrare la piastra a quattro gradi Celsius per cinque minuti prima di aspirare attentamente il mezzo freddo. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di gel a matrice extracellulare diluito nei pozzi appropriati e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per trenta minuti.

Le bolle sono comuni quando si lavora con gel a matrice extracellulare, ma possono essere eliminate aspirando il 70% di etanolo. Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo fresco e caldo, con o senza il composto di prova, ai pozzi appropriati della piastra di dosaggio di migrazione o invasione e posizionare la piastra nella piattaforma di imaging delle cellule vive. Per pulire lo strumento scratch, posizionare il blocco del perno superiore in singoli lavatoi da 45 millilitri, contenente il 5% di detersivo uno, l'uno per cento di detersivo due, l'acqua distillata sterile o il 70% di etanolo per cinque minuti per lavaggio prima di riposizionare lo strumento scratch sulla sua piastra di base, per lo stoccaggio in un ambiente privo di polvere.

Per l'imaging dei test della ferita, dopo aver permesso alla piastra di equilibrare per cinque minuti, selezionare il tipo di nave come piano del registro dell'immagine e impostare il tipo di scansione come ferita da graffio. Selezionare o modificare il modello di scansione, in base alla configurazione sperimentale della piastra, e pianificare 24 ore di scansione ripetuta ogni una o due ore per 72 ore o fino a quando le ferite non vengono guarite come dimostrato. Quando tutte le ferite sono guarite, interrompere la scansione e selezionare da tre a sei immagini rappresentative, che coprono una gamma di percentuali sonore, incluse le immagini subito dopo la ferita e la chiusura della ferita del 10 e 50%.

Per determinare una definizione di elaborazione corretta, applicare una maschera ferita da graffio appropriata e una maschera di confluenza come illustrato e utilizzare la corrente di anteprima all'per visualizzare l'accuratezza delle maschere. Quindi, avviare il processo di analisi. In un saggio di migrazione, la larghezza della ferita è la distanza media tra i fogli cellulari accanto alla ferita.

La confluenza della ferita è la confluenza all'interno dell'area ferita. La confluenza iniziale ideale della ferita dovrebbe essere vicina allo zero percento. La densità relativa della ferita e la confluenza della ferita suggeriscono la velocità delle cellule che occupano l'area della ferita da graffio.

Questi dati si sovrappongono quasi in entrambe queste linee cellulari rappresentative. Linee cellulari diverse dimostrano abilità di guarigione delle ferite molto diverse, indicando abilità migratorie differenziali tra le linee cellulari. Ad esempio, la lamellipodia si osserva in questa linea cellulare adenocarcinoma mammario sul fronte della migrazione all'inizio della migrazione, mentre questa linea cellulare di cellule tumorali mammari produttrice di mucina 1 non mostrava alcun segno di migrazione cellulare nello stesso momento.

Inoltre, la densità relativa della ferita della linea di adenocarcinoma mammario è stata satura dopo 50 ore, mentre la densità relativa della ferita della linea cellulare del cancro al seno produttrice di mucina 1 non è cambiato nel tempo, sottoscendo il fenotipo altamente invasivo delle cellule adenocarcinoma e e la non invasività delle cellule tumorali mammaria produttrici di mucina 1. Anche le cellule adenocarcinoma si comportavano in modo diverso mentre invadevano attraverso il gel della matrice extracellulare, dimostrando una morfologia allungata con sporgenze principali, e nei test di migrazione, è stato visualizzato un bleb sul fronte della migrazione. Durante la placcatura, ricorda che se troppo poche cellule vengono seminate, il graffio non si formerà correttamente e se troppe cellule vengono seminate, ci sarà sovraffollamento.

Seguendo questa procedura, è possibile aggiungere trattamenti di traccia, consentendo di adattare questo metodo per lo screening della traccia ad alta produttività. Questo metodo consente ai ricercatori di eseguire questi test su un'unica piattaforma, che è ad alta produttività, e consente ai ricercatori di monitorare le loro cellule in tempo reale, piuttosto che in endpoint sperimentale. I disinfettanti utilizzati per sterilizzare lo strumento scratch possono essere pericolosi.

Assicurati di raccogliere e smaltire le soluzioni in base all'MSDS pertinente e alle normali linee di attivazione della tua struttura.