Modellazione di infezione del Virus di Zika dello sviluppo del cervello umano In Vitro utilizzando cellule staminali derivate Organoids cerebrale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare l'infezione da virus Zika nel cervello umano in via di sviluppo utilizzando organoidi cerebrali derivati da cellule staminali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia, come ad esempio quali cellule sono in grado di essere infettate e quali proteine sono coinvolte nel percorso di infezione. I principali vantaggi di questa tecnica sono che imita le prime infezioni umane, può essere utilizzata in saggi ad alto rendimento e può essere combinata con tecniche di genetica focalizzata come CRISPR.

Questo metodo può fornire informazioni sul meccanismo dell'infezione da virus Zika. Può anche essere applicato ad altri sistemi come gli screening dei farmaci e la pseudotipizzazione dei virus. Utilizzando metodi regolari di manutenzione delle cellule staminali, portare le colture a una confluenza compresa tra il 50% e il 70%.

Ispeziona le colture utilizzando la microscopia a campo chiaro con un ingrandimento da 10 a 20x e assicurati che la colonia abbia una morfologia sana senza differenziazioni rilevabili. Portare il terreno di mantenimento delle cellule staminali prive di xeno a 37 gradi Celsius in un bagno di acqua calda e scongelare due millilitri di reagente per il distacco enzimatico e una fiala da 50 microlitri dell'inibitore della roccia madre a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U con attacco ultra basso, una pipetta p200 multicanale e un serbatoio di reagenti da 25 millilitri.

Quindi, aliquotare 45 millilitri di terreno in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 45 microlitri di acido inibitore e mescolare accuratamente l'inibitore triteando la miscela, seguita da due a quattro nelle versioni. Aspirare sotto vuoto due pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente cellule staminali e aggiungere rapidamente un millilitro di reagente di distacco privo di enzimi a ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro minuti.

Successivamente, aspirare sotto vuoto i pozzetti trattati e aggiungere un millilitro di reagente di distacco enzimatico a ciascun pozzetto. Dopo un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Picchiettare delicatamente sulla piastra per rompere eventuali cellule aggregate.

Quindi, ispeziona le cellule al microscopio. Se sono ancora visibili grandi ammassi di cellule, incubare la piastra per altri due minuti a 37 gradi Celsius. Ripetere il passaggio fino a quando i grappoli non sono più visibili ad occhio nudo.

Una volta che le cellule sono correttamente dissociate, aggiungere un millilitro di terreno di mantenimento delle cellule staminali prive di xeno a ciascun pozzetto, per disattivare gli enzimi di dissociazione. Tirare la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e prelevare una piccola aliquota per il conteggio delle cellule. Durante la centrifugazione, contare le cellule e determinare il volume di risospensione necessario per ottenere 60.000 cellule per millilitro di sospensione.

Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule a 60.000 cellule per millilitro in un terreno contenente l'inibitore della roccia. Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, mescolare delicatamente le cellule da cinque a 10 volte per garantire una sospensione cellulare uniforme. Aggiungere immediatamente la sospensione cellulare nel serbatoio del reagente e utilizzare una pipetta p200 multicanale per trasferire 150 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti con attacco ultra basso.

Quindi, centrifugare la piastra a 150 x G per un minuto e quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Non disturbare la piastra per 48 ore. A partire dal secondo giorno, preparare 17 millilitri di terreno contenente 17 microlitri di inibitore della roccia madre in una provetta conica da 50 millilitri.

Scaldare il composto a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Prelevare la piastra dell'organoide dall'incubatore e, utilizzando una pipetta multicanale p200, aspirare lentamente 75 microlitri di terreno dai bordi dei pozzetti della prima fila. Quindi, espellerlo rapidamente nel pozzetto per sollevare le cellule sciolte e gli organoidi.

Ripetere questo processo di dispersione per ogni riga. Attendere 15 secondi per assicurarsi che gli organoidi siano affondati sul fondo di ciascun pozzetto, quindi aspirare lentamente e con attenzione 75 microlitri di terreno da ciascun pozzetto utilizzando la pipetta multicanale p200 ed erogarlo in un serbatoio di scarico. Successivamente, trasferire il terreno contenente l'inibitore della roccia in un serbatoio di reagenti, erogare 150 microlitri di terreno in ciascun pozzetto dell'organoide e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius.

Scaldare 17 millilitri di terreno di coltura fresco a 37 gradi Celsius, questa volta senza alcun inibitore di roccia. Utilizzando una pipetta multicanale p200 impostata su 100 microlitri, ripetere il processo di dispersione precedentemente mostrato e attendere 15 secondi per assicurarsi che gli organoidi siano affondati sul fondo dei loro pozzetti. Quindi, aspirare con cura 125 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e sostituirli con 150 microlitri di terreno riscaldato.

Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Preparare il terreno secondo la ricetta mostrata qui e poi filtrare sterile la soluzione miscelata in un filtro da 500 millilitri. Dal quarto giorno fino a quando le cellule sono state infettate, intorno al giorno 24, condurre una manutenzione regolare a giorni alterni utilizzando il mezzo di induzione neurale.

Una volta filtrato, scaldare 17 millilitri del mezzo di induzione neurale a 37 gradi Celsius e conservare il resto a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta p200 multicanale, impostata a 100 microlitri, disperdere tutti i pozzetti della piastra dell'organoide precedentemente mostrato. Attendere 15 secondi per assicurarsi che gli organoidi siano affondati sul fondo dei loro pozzetti.

Aspirare con cura 125 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 125 microlitri di terreno di induzione neurale fresco. Ripeti questa impresa di induzione nerale a giorni alterni fino a quando gli organoidi sono pronti per l'infezione da virus Zika. Portare 1x soluzione salina bilanciata di earle, 1x PBS e mezzo di induzione neurale a 37 gradi Celsius in un bagno di acqua calda.

Successivamente, diluire il virus Zika di una concentrazione nota nella soluzione di 1x earle alla molteplicità target di infezione, che è tipicamente compresa tra 0,1 e 10. Utilizzando una pipetta p200, rimuovere con cura tutto il terreno da ciascun pozzetto dell'organoide. Quindi, lavare rapidamente gli organoidi con 200 microlitri di 1x PBS riscaldato.

Quando si rimuove il terreno da ciascun pozzetto, è fondamentale non toccare l'organoide o aspirarlo nella pipetta. Ciò può causare danni irreparabili all'organoide. Se ciò dovesse accadere, è meglio scartare l'organoide.

Quindi, rimuovere con cura tutto il liquido rimanente da ciascun pozzetto dell'organoide utilizzando una pipetta p200 a canale singolo. Quindi, aggiungi rapidamente 50 microlitri di soluzione di 1x earle per un'infezione simulata o di una soluzione per il virus Zika a ciascun pozzetto. Assicurarsi che ogni organoide sia completamente immerso al termine, riposizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore.

Dopo che l'esposizione virale è stata completata, lavare ogni pozzetto degli organoidi con 200 microlitri di PBS. Lasciare riposare gli organoidi per 15 secondi, quindi rimuovere il PBS utilizzando una pipetta p200 a canale singolo. Infine, aggiungere 200 microlitri di terreno di induzione neurale fresco a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatrice.

La colorazione con DAPI, fosfo-vimentina, TBR2 e MAP2 può essere combinata per mostrare le strutture corticali che si formano all'interno degli organoidi. Queste strutture includono la zona ventricolare, la zona sub-ventricolare, la zona intermedia e la placca corticale all'interno di ciascuna rosetta. La coltura degli organoidi fino al giorno 108, permette di osservare le fasi successive dello sviluppo.

Sebbene la stratificazione corticale non sia così prominente in questo tipo di organoide, il passaggio naturale alla gliogenesi avviene in modo molto simile a quello in vivo. Tre giorni dopo l'infezione da virus Zika, diventa visibile una differenza nelle dimensioni dell'organoide. L'entità di questa differenza dipende dalla molteplicità virale dell'infezione che viene applicata agli organoidi.

Questa differenza nelle dimensioni degli organoidi aumenterà nel corso della settimana successiva fino a quando gli organoidi infetti inizieranno a rompersi. Dopo tre giorni, ci sarà anche un aumento dei detriti cellulari nei pozzetti infetti rispetto ai pozzetti finti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire pratiche di laboratorio sicure poiché vengono utilizzati materiali infettivi vitali.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunoistochimica o l'RNAC per rispondere a ulteriori domande sulla biologia coinvolta nell'infezione da virus Zika dello sviluppo neurale.