Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire condizioni standardizzate per il successo della sterilizzazione delle sementi di un gran numero di genotipi di Arabidopsis, prevenendo al contempo la crescita microbica. Questo metodo consente di sterilizzare centinaia di campioni di semi alla volta, semplificando così una fase critica di preparazione del materiale vegetale nei campi della genomica, della proteomica, della metabolomica e di altri studi ad alto rendimento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce le condizioni in cui una sterilizzazione efficiente è combinata con un alto tasso di germinazione per un gran numero di campioni di semi.

Per iniziare, prepara una soluzione di candeggina al 50% con acqua distillata. A ogni 200 millilitri di soluzione di candeggina, aggiungere 50 microlitri di detersivo TWEEN 20. La soluzione di candeggina può essere conservata fino a un mese, purché venga aperta solo in condizioni sterili.

Quindi, aliquotare 100 semi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando un robot di semina su misura. Ora, in una cappa a flusso laminare, aggiungere 500 microlitri della soluzione di candeggina al 50% ai semi.

Quindi, trasferire i tubi in un rotatore e incubare i semi nella candeggina con una leggera agitazione per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aspirare la soluzione di candeggina dai tubi rimuovendo il più possibile. Quindi, aggiungere nuovamente 500 microlitri di acqua distillata sterile e capovolgere i tubi per mescolare.

Lasciare depositare i semi, quindi aspirare l'acqua e sostituirla con un'altra aliquota per lavare nuovamente i semi. Eseguire un totale di sei lavaggi di questo tipo con acqua distillata sterilizzata. Una volta che i semi sono stati accuratamente lavati con acqua, sospendeteli in un millilitro d'acqua prima di impiattarli.

Prima di iniziare il processo di sterilizzazione, calcolare i volumi di candeggina e acido cloridrico necessari per produrre cloro gassoso. Utilizzare l'equazione fornita per ottenere il 6% di cloro gassoso raccomandato. Assicurati di calcolare con precisione il volume di HCl necessario per garantire una sterilizzazione di successo e per evitare schizzi.

Assicurati di indossare guanti e un camice da laboratorio durante questo protocollo e cambia i guanti ogni volta che vengono bagnati con acido o candeggina. Sotto una cappa aspirante, trasferire le fiale di semi in una griglia con i coperchi aperti. Quindi, posizionare la griglia in un contenitore di plastica in cui possa avvenire la sterilizzazione e preparare strisce di pellicola di paraffina per sigillare il coperchio del contenitore.

Ora, carica il becher con 100 millilitri di candeggina e poi posiziona all'interno un becher da 250 millilitri. L'uso di un eccesso di candeggina è una caratteristica di sicurezza e il becher dovrebbe essere almeno il doppio del volume totale della soluzione che contiene. Inoltre, maneggiare sempre la candeggina e gli acidi separatamente.

Quindi, aggiungi tre millilitri di acido cloridrico al becher, quindi chiudi immediatamente il contenitore e sigillalo con parafilm. Monitorare il contenitore per un'ora per assicurarsi che il gas si accumuli durante la sterilizzazione. Il cloro gassoso dovrebbe essere visibile come una debole foschia gialla all'interno del contenitore oppure si può controllare che la soluzione non diventi gialla.

Controllare periodicamente la chiusura del contenitore. Se il coperchio si stacca o il sigillo di paraffina inizia ad allentarsi, richiudere ermeticamente il coperchio con un ulteriore strato di pellicola di paraffina. Dopo la sterilizzazione di un'ora, aprire un angolo del contenitore per far sfiatare il gas per un periodo di tre ore.

Dopo tre ore di ventilazione, tappare tutti i tubi e conservare i semi sterilizzati in condizioni asciutte fino a quando non vengono impiattati. Ora, neutralizza la reazione aggiungendo lentamente 1,5 grammi di polvere di bicarbonato di sodio mescolando con una bacchetta di vetro per sciogliere i solidi. Continua ad aggiungere bicarbonato di sodio fino a quando le bolle di anidride carbonica non hanno smesso di formarsi.

Quindi, misurare il pH della soluzione e, se necessario, aggiungere altro bicarbonato di sodio fino a quando il pH non è neutro. A condizione che la soluzione non sia maleodorante, può essere smaltita. In caso contrario, attendere che tutti gli odori si disperdano.

Aggiungi 500 microlitri di acqua distillata sterilizzata a ciascun tubo di semi sterilizzati a gas. Quindi, versare i semi su una piastra MS e distribuirli uniformemente utilizzando un anello di inoculazione sterile monouso o un puntale per pipetta sterile. Dopo tre giorni di stratificazione dei semi a quattro gradi Celsius, trasferire le piastre a 23 gradi Celsius con 16 ore di esposizione giornaliera alla luce.

Tieni i coperchi sopra in modo che le radici crescano nel terreno. Dopo otto giorni di crescita, segna la frazione di semi che sono germogliati. La germinazione viene contata quando il radicale si è proiettato al di fuori del rivestimento del seme e i due cotiledoni sono visibili.

Inoltre, conta il numero di semi colpiti dalla muffa per determinare l'efficacia delle condizioni di sterilizzazione. Quattro diverse concentrazioni di candeggina in cinque diversi tempi di esposizione sono state testate su semi di tipo selvatico Columbia. Alte concentrazioni di candeggina hanno influenzato negativamente la germinazione con un'esposizione eccessiva.

Tuttavia, sono stati osservati alti tassi di germinazione con il 40 e il 50% di candeggina in tutti i tempi di esposizione. I semi sterilizzati con alte concentrazioni di candeggina avevano un'elevata mortalità e spesso mostravano difetti di crescita, ma di solito erano completamente privi di muffa. La sterilizzazione con candeggina al 50% per 10 minuti è stata determinata per avere l'equilibrio ottimale tra inibizione della muffa e germinazione sana.

Per ottimizzare le condizioni di sterilizzazione con cloro gassoso, sono state utilizzate tre diverse concentrazioni di cloro gassoso per sterilizzare i semi Columbia wild-type in due diversi periodi di tempo. C'era un'interazione significativa tra il tempo e la concentrazione di gas. A un'ora, non c'è stato alcun effetto sulla germinazione, mentre la concentrazione di gas più alta è stata dannosa a tre ore.

Pertanto, è stato scelto un periodo di sterilizzazione di un'ora. La crescita della muffa è stata efficacemente inibita da esposizioni di gas di tre ore o per esposizioni di un'ora utilizzando il sei o il 17% di gas. Pertanto, è stato determinato che una concentrazione di gas del 6% per un'ora è ottimale per la germinazione e l'inibizione delle muffe.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per sterilizzare con successo centinaia di linee di semi al giorno se eseguita correttamente. I semi sterilizzati a gas possono anche essere conservati per un lungo periodo di tempo in condizioni asciutte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le equazioni fornite per calcolare i volumi richiesti di HCl e candeggina.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come gli studi di associazione genome-wide, al fine di collegare una varietà di genotipi diversi e i fenotipi di interesse. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.