Name: Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Impara a sterilizzare semi di Arabidopsis in modo standardizzato per studi ad alto rendimento. Questo metodo ottimizza la sterilizzazione con ipoclorito di sodio e gas cloro, garantendo alta germinazione e prevenendo la contaminazione microbica.

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Vorremmo ringraziare Gauri Datta per la sua assistenza nella preparazione di materiali sperimentali. Siamo inoltre grati a Bettina Wittler e James Mann per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NSF sovvenzioni DBI-1049341 e MCB-1143813.

1. preparazione di Murashige e Skoog (MS) medio: 1x <ol><li>aggiungere 4,31 g di MS basale miscela di sale, 10 g di saccarosio e 0,5 g di 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acido (MES) in un becher contenente 0,8 L di acqua distillata e mescolare per sciogliere. Controllare e regolare il pH a 5.7 utilizzando 1 M di idrossido di potassio (KOH). Aggiungere acqua distillata per fare 1 L.</li>
	<li>Dividere i media in due bottiglie da 1 L, 500 mL cadauna. Aggiungere 5 g di agar ad ogni bottiglia. Tenere il coperchio allentato.</li>
	<li>Autoclave per 20 min a 121 ° C, 15 psi con un ancoretta magnetica in bottiglia.</li>
	<li>Dopo la sterilizzazione in autoclave, mettete le bottiglie in un piatto mescolare a bassa velocità e lasci che il media MS raffreddare a 45-50 ° C (fino a quando la bottiglia può essere tenuta con le mani nude).</li>
	<li>a partire da questo passaggio, eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Aggiungere 500 µ l Gamborg ' s soluzione di vitamine per ogni bottiglia e mescolare il mezzo di MS per distribuire uniformemente la soluzione vitamina.</li>
	<li>Versare abbastanza media in piastre a coprire circa la metà della profondità della piastra.</li>
	<li>Lasciate raffreddare a temperatura ambiente per circa 1 h per consentire l'agar solidificare le piastre. 
	Nota: Se le piastre non sono deve essere usato immediatamente, li avvolgono in plastica e conservare a 4 ° C (temperatura del frigorifero). Coperto di piastre, scatole o tubi con agar solidificato possono essere conservati per diverse settimane a 4 ° C in un contenitore ermetico.</li>
</ol> 2. Sterilizzazione dei semi di Arabidopsis con candeggina <ol><li>preparare il MS Piastre conformemente al punto 1 del protocollo. Autoclave 100 mL di acqua distillata allo stesso tempo come i Media di MS. Utilizzare questo più tardi come acqua di risciacquo e consente di sospendere i semi per aiutare nella placcatura. 
	Nota: Se lo si desidera, miscela di agar 0,8% (p/v) (ad es. phytagar) può anche essere autoclavato in questo passaggio. La miscela di agar può essere sostituito con acqua distillata durante placcatura (passo 2.5.3.). La viscosità supplementare della miscela agar rende più facile ai semi di spazio sulla piastra o pianta in righe se necessario.</li>
	<li>Preparare 50% (v/v) di candeggina soluzione da utilizzare per sterilizzare i semi. Per diluire la candeggina, aggiungere 100 mL di candeggina per 100 mL di acqua distillata. Aggiungere 50 µ l di Tween 20 detergente alla soluzione di candeggina. 
	Nota: Soluzione di candeggina preparata può essere conservata per fino a un mese, fino a quando viene aperto solo in condizioni di sterilità.</li>
	<li>Aliquot 100 semi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Sterilizzare i semi utilizzando una soluzione di candeggina al 50%.
	<ol><li>In una cappa a flusso laminare, aggiungere 500 µ l di soluzione di candeggina al 50% per il tubo del microcentrifuge contenente i semi. Toccare il fondo del tubo di sospendere i semi della soluzione di candeggina. 
		Nota: In alternativa, un rotatore o shaker a piattaforma può essere utilizzato per tenere i semi sospesi.</li>
	</ol></li> <li>Risciacquare la soluzione di candeggina dal tubo.
	<ol><li>Dopo 10 min, rimuovere la soluzione di candeggina dal tubo del microcentrifuge utilizzando una pipetta o un aspiratore dotato di un puntale all'estremità.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di acqua distillata sterile al tubo. Tappare la provetta e invertire per mescolare. Consentire semi a depositarsi sul fondo del tubo. Una volta che i semi sono depositati alla parte inferiore del tubo con attenzione rimuovere la soluzione di candeggina di pipettaggio. Ripetere l'operazione di risciacquo processo 6 volte.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di acqua distillata in autoclave al tubo di sospendere i semi.</li>
	</ol></li> <li>Piastra semi sterilizzati sulle piastre di MS.
	<ol><li>In una cappa a flusso laminare, etichettare il fondo del piatto con il nome e la data corrente MS.</li>
		<li>Versare i semi dal tubo del microcentrifuge sulla piastra di MS. Spargere i semi intorno alla piastra di MS utilizzando un'ansa sterile, monouso da inoculo o una pipetta sterile. 
		Nota: Se semi devono essere seminati in righe, può essere utilizzata una pipetta con una punta di 200 µ l di individualmente i semi nelle posizioni desiderate. Per migliorare il flusso di semi, alla fine della punta della pipetta può essere tagliata da 3-5 mm utilizzando le forbici. Ogni seme fuori luogo o grappoli di semi può quindi essere riposizionati o separati utilizzando un'ansa da inoculo monouso sterile.</li>
		<li>Mettere la piastra di MS sul retro della della cappa a flusso laminare con il coperchio chiuso a metà. Permettere all'acqua in eccesso di evaporare dalla piastra MS.</li>
		<li>Mettere il coperchio sulla piastra di MS. Guarnizione piastra MS avvolgendo la piastra con carta microporosa chirurgica nastro (vedere la Tabella materiali).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilizzazione del seme di Arabidopsis con Gas di cloro <ol><li>preparare il MS Piastre conformemente al punto 1 del protocollo. Autoclave 100 mL di acqua distillata allo stesso tempo come la MS Media; Questo verrà utilizzato in seguito per aiutare sospendere i semi per aiutare nella placcatura. 
	Nota: Se lo si desidera, miscela di agar 0,8% (p/v) (ad es. phytagar) può anche essere autoclavato in questo passaggio. La miscela di agar può essere sostituito con acqua distillata durante placcatura (passo 3.6.2.). La viscosità supplementare della miscela agar rende più facile ai semi di spazio sulla piastra o pianta in righe se necessario.</li>
	<li>Prima di iniziare la sterilizzazione, calcolare la quantità di candeggina e acido cloridrico (HCl) per produrre gas di cloro necessaria.
	<ol><li>Calcolare la quantità di HCl necessari per produrre il 6.1% Cl 2 necessaria per la sterilizzazione.</li>
		<li>Utilizzare la seguente formula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"> con 7.000 mL come il volume del contenitore di sterilizzazione e 6.1% Cl 2; il volume di HCl è calcolato per essere 3ml. 
		Nota: Un foglio di calcolo programmato per effettuare il calcolo per diversi volumi del contenitore e % Cl 2 viene fornito come supplementare nella tabella 1.</li>
	</ol></li> <li>Aliquot 100 semi in microcentrifuga 0,5 mL. Chiudere i tappi per ciascun flaconcino, posizionare le fiale in un rack di plastica e mettere da parte. 
	Nota: Finché sono memorizzati in opportune condizioni, semi possono essere memorizzati per un periodo prolungato di tempo a questo punto. Condizioni di conservazione possono essere trovate nella sezione 3.3.2 del protocollo di Rivero e colleghi 4. piastra a 96 pozzetti formato può essere utilizzato anche.</li>
	<li>Preparare i materiali necessari per eseguire la sterilizzazione del gas cloro.
	<ol><li>Ottenere candeggina e HCl dalle loro posizioni di archiviazione.</li>
		<li>Taglio una striscia di paraffina grande film (Vedi la Tabella materiali) da utilizzare nel passaggio 3.5.3. per sigillare il contenitore per sterilizzazione.</li>
		<li>Inserire il contenitore di plastica con coperchio in cui la sterilizzazione si svolgerà all'interno di una cappa aspirante. Aprire i tappi su tutti i flaconi di seme e dispongono la cremagliera di seme intero all'interno del contenitore di plastica.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire la sterilizzazione del gas di cloro a temperatura ambiente. 
	Attenzione: Lavorare con candeggina e acido separatamente. Non lasciare una bottiglia non livellata per ridurre il rischio di fuoriuscite. Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) compresi guanti e un camice da laboratorio. Se candeggina o acido spruzza su guanti, cambiare i guanti prima di maneggiare altri materiali. Rimuovere sempre i guanti nella cappa fumi in caso di contaminazione di candeggina o acido.
	<ol><li>Mettere un becher da 250 mL all'interno del contenitore e aggiungere 100 mL di candeggina. 
		Nota: La reazione tra HCl e candeggina richiede almeno 22 volumi eccesso di candeggina. La reazione si consuma l'HCl e candeggina rilasciando gas 2 Cl con acqua e cloruro di sodio (NaCl) come sottoprodotti. Utilizzando un grande eccesso di candeggina consente il consumo di ulteriori HCl durante il periodo di ventilazione, che diminuisce la quantità di sodio bicarbonato (NaHCO 3) necessari per neutralizzare la soluzione per lo smaltimento. 
		Attenzione: Il contenitore dovrebbe essere almeno due volte il volume totale di liquido di candeggina + HCl. Questo impedisce spruzzi evasione Becher durante il passaggio successivo, che possono danneggiare i semi, candeggina vestiti o bruciare la pelle esposta.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di HCl per il becher contenente candeggina. 
		Attenzione: La reazione iniziale produce bolle, soprattutto alle concentrazioni di gas superiore a 6,1%. Un camice a maniche lunghe è necessario per questo passaggio.</li>
		<li>Chiudere il contenitore per sterilizzazione e sigillare con pellicola di paraffina immediatamente.</li>
		<li>Monitorare il contenitore per sterilizzazione durante il tempo di sterilizzazione per garantire l'accumulo di gas; l'accumulo di gas di cloro deve essere visibile come una debole foschia giallo all'interno del contenitore. 
		Attenzione: Controllare periodicamente il contenitore di sterilizzazione per assicurare che la pressione all'interno non ha disarcionato il coperchio o pellicola di paraffina. Se il coperchio è venuto disarcionato o il film di paraffina si è allentato, chiudere il coperchio e avvolgere attentamente il contenitore con un ulteriore strato di pellicola paraffina.</li>
		<li>h dopo l'1-sterilizzazione periodo, aprire il contenitore di rimozione della pellicola di paraffina e aprendo il coperchio su un angolo. Consentire il contenitore sfogare per 3 ore per completare la reazione ed eliminare il gas cloro.</li>
		<li>Chiudere i tappi di tutte le provette microcentrifuga nel rack seme. 
		Nota: Semi sterilizzati possono essere memorizzati fino a tempo di placcatura, purché essi sono immagazzinati in condizione asciutta.</li>
		<li>Rimuovere il rack di seme e posizionarlo in una cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Neutralizzare la reazione del gas cloro <ol><li>aggiungere 1,5 g NaHCO 3 polvere lentamente per il becher contenente la soluzione di candeggina/HCl e mescolare con una bacchetta di vetro per sciogliere il NaHCO 3 nella soluzione. Continuare ad aggiungere NaHCO 3 fino a quando hanno smesso di bolle di gas di anidride carbonica (CO 2) formando. 
			Attenzione: Aggiungere lentamente per evitare schizzi. Uso dei DPI appropriati, compresi i guanti e un camice da laboratorio.</li>
			<li>Verificare il pH della soluzione utilizzando strisce pH o un pH-metro. Aggiungere ulteriori NaHCO 3 se necessario fino a quando il pH della soluzione è neutro (pH 7.0). A questo punto la soluzione può essere rimosso dalla cappa fumi e smaltita secondo le linee guida di smaltimento tutti. 
			Attenzione: Se durante lo smaltimento è notato alcun odore, quindi la soluzione dovrebbe immediatamente essere rinviata per la cappa.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Piastra semi sterilizzati sulle piastre di MS.
	<ol><li>In una cappa a flusso laminare, etichettare il fondo del piatto con il nome e la data corrente MS.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di acqua distillata sterile per ogni tubo del microcentrifuge per sospendere i semi. Versare semi verso la piastra di MS e spargere i semi in modo uniforme intorno alla piastra utilizzando un'ansa sterile, monouso da inoculo o una pipetta sterile.</li>
		<li>Mettere la piastra di MS sul retro della della cappa a flusso laminare con il coperchio chiuso a metà. Permettere all'acqua in eccesso di evaporare dalla piastra MS.</li>
		<li>Mettere il coperchio sulla piastra di MS. Sigillare la piastra MS avvolgendo la piastra con nastro chirurgico di carta microporosa.</li>
	</ol></li></ol> 4. Crescita di Arabidopsis sulle piastre di MS <ol><li>posizionare le piastre con il coperchio sulla parte superiore per tre giorni a 4 ° c e umidità ambiente. 
	Nota: Questo processo si chiama stratificazione e serve per sincronizzare la germinazione dei semi individuali.</li>
	<li>Le piastre di trasferimento per l'ambiente di crescita.
	<ol><li>Mantenere temperatura a 23 ° C e intensità della luce a 120-150 µmol/m 2 s con luce di 16 h / 8h scuro fotoperiodo. Collocare i piatti piatto nell'ambiente crescere con il coperchio sulla parte superiore così le radici si sviluppano nel terreno.</li>
	</ol></li> <li>Let crescono le piantine sulle piastre per 8 giorni. 
	Nota: Un periodo di crescita di 8 giorno permette tardi germinare semi di germinare. Piastre possono essere segnati prima di 8 giorni se tutti i semi hanno germinato.</li>
	<li>Punteggio ottenuto i tassi di germinazione.
	<ol><li>Record il numero di semi che hanno germinato e che non hanno germinato. Tasso di germinazione viene calcolato dividendo il numero di semi germinati per il numero totale di semi sul piatto. 
		Nota: Germinazione viene conteggiato quando la radichetta ha proiettato fuori il cappotto di seme e i due cotiledoni sono visibili.</li>
		<li>Anche contare il numero di semi colpiti da muffa per determinare l'efficacia delle condizioni di sterilizzazione.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
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<li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+screening+for+insertional+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li>
<li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando crescere semi di Arabidopsis su terreno sterile, qualche forma di sterilizzazione deve essere applicato. Trattamenti di sterilizzazione di gas sia candeggina e cloro causare inibizione simile di crescita tasso e muffa di germinazione. Nessuno dei due metodi di sterilizzazione causa una riduzione significativa nel tasso di germinazione di semi con alta germinazione potenziale; Tuttavia, candeggina sterilizzazione è consigliata per linee con più basso potenziale di germinazione (20-70%), dovuto la piccola, seppur non significativo, miglioramento nel tasso di germinazione rispetto alla sterilizzazione del gas (Figura 3A).
Semi di Arabidopsis con concentrazioni di candeggina da 40-100% per fino a 10 min di sterilizzazione fornisce percentuali di germinazione soddisfacente e muffa efficace soppressione. Anche se le concentrazioni di candeggina meno del 40% fornire adeguata sterilizzazione per la maggior parte delle partite di sementi, utilizzando una concentrazione di 40% o superiore garantisce una sterilizzazione efficace anche pesantemente contaminati di lotti di sementi. È importante non superare i 10 min di sterilizzazione quando usando candeggina concentrazioni pari o superiori a 80% per evitare difetti di sviluppo del semenzale e semi di alta mortalità.
Il trattamento semi di Arabidopsis con le concentrazioni di gas di cloro del 6,1% e 16,5% per risultati 1H in tassi di germinazione alta e muffa adeguata eliminazione. Concentrazione di gas di cloro basso (2,1%) può essere utilizzato con successo da aumento della durata della sterilizzazione a 3 h.
Quando poche righe devono essere sterilizzati, si consiglia sterilizzazione liquida in una soluzione di candeggina al 50% per 10 min. Per un numero maggiore di righe, sterilizzazione a gas con una concentrazione di gas del 6,1% per 1 h è un'opzione migliore poiché molte linee possono essere sterilizzati in modo facile e veloce con meno manipolazione.
I nostri risultati forniscono condizioni standardizzate per la sterilizzazione sia grande numero di semi di diversi genotipi e i semi con basso potenziale di germinazione. L'unica limitazione di queste tecniche di sterilizzazione è che non possono essere applicati ai semi con tassi di germinazione meno del 20% a causa di mortalità di vasto seme. Metodi alternativi, come sonicazione17, per aumentare il tasso di germinazione in assenza di sterilizzazione potrebbero essere utile in quei casi.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) è un organismo modello privilegiata per la ricerca di base e applicata in pianta biologia1,2,3. Mentre le condizioni standard per crescita di Arabidopsis sono stati affermati4, l'effetto di sterilizzazione di seme sulla vitalità del seme non è stato rigorosamente testato. Terreni solidi in lastre o scatole sono usato ordinariamente per facilitare la crescita delle piantine di Arabidopsis per molte applicazioni sperimentali, come l'identificazione di mutanti omozigoti letale in una popolazione segregating, osservazione dei fenotipi sparare e radice a presto fasi, isolamento del patogeno-libero tessuto, raccolta di grandi quantità di tessuto semenzale, selezione di piante resistenti alla droga o trasformanti e valutazione di germinazione1,2,3,4 . Semi raccolti da piante coltivate in una serra o camera di crescita occasionalmente sono contaminati da microrganismi e polvere. Crescita delle piantine di Arabidopsis su diversi tipi di terreno sterile richiede sterilizzazione preventiva seme per rimuovere i contaminanti microbici quali funghi e batteri presenti sulla superficie del seme. L'uso di un regime di sterilizzazione efficace seme è fondamentale per un equilibrio di alta germinazione, contaminazione minima e la pianta vigorosa crescita.
I due metodi più comuni utilizzati per la sterilizzazione del seme di Arabidopsis sono basati su candeggina commerciale (fase liquida) e gas di cloro (fase gassosa). Varie procedure sono state impiegate per entrambi fase liquida sterilizzazione1,4,5,6,7,8,9 , sterilizzazione del vapore-fase e 10 di Arabidopsis semi8,10,11,12,13,14,15 ,16. Tuttavia, mentre queste procedure sono state efficaci nell'effettuazione sterilizzazione seme dei genotipi utilizzati, un'analisi dettagliata degli effetti di trattamenti diversi sterilizzazione sui semi di differenti genotipi non è stata segnalata. Pertanto, l'ottimizzazione di queste procedure di sterilizzazione è necessaria per definire le condizioni in cui efficiente sterilizzazione è combinato con alta germinabilità.
Centro di risorse biologiche (ABRC) di The Arabidopsis è posizionata per) sperimentare la vitalità di sementi di una varietà di differenti genotipi nel vantaggio raccolta e b) di adottare le procedure di controllo della qualità applicate internamente e in risposta al feedback degli utenti sulla germinazione del seme. Gli obiettivi degli esperimenti presentati qui erano di determinare gli effetti dei vari metodi di sterilizzazione sulla germinazione dei semi di una gamma di Arabidopsis genotipi. Procedure di sterilizzazione ottimizzato che provocare tassi di germinazione di semi di alta mantenendo la contaminazione da agenti patogeni minimal sono presentate per la sterilizzazione a gas sia candeggina e cloro.

metodo standardizzato per la sterilizzazione di high-throughput di semi di arabidopsis

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana Piantine (Arabidopsis) spesso bisogno di essere coltivato su terreno sterile. Ciò richiede sterilizzazione seme preventiva per prevenire la crescita di contaminanti microbici presenti sulla superficie del seme. Attualmente, i semi di Arabidopsis sono sterilizzati usando due tecniche di sterilizzazione distinti in condizioni che differiscono leggermente tra i laboratori e non sono state standardizzate, spesso con conseguente sterilizzazione solo parzialmente efficace o nella mortalità eccessiva seme. La maggior parte di questi metodi non sono anche facilmente scalabile per un gran numero di linee di semi diversi genotipi. Come tecnologie per analisi di alto-rendimento di Arabidopsis continuano a proliferare, tecniche standardizzate per la sterilizzazione dei numerosi semi di differenti genotipi sono sempre essenziali per lo svolgimento di questi tipi di esperimenti. È stata valutata la risposta di un certo numero di linee di Arabidopsis a due tecniche di sterilizzazione diversi basato sul tasso di germinazione del seme e il livello di contaminazione del seme con microbi ed altri agenti patogeni. I trattamenti incluso diverse concentrazioni di agenti e tempi di esposizione, combinati per determinare le condizioni ottimali per la sterilizzazione del seme di Arabidopsis di sterilizzazione. Sono stati sviluppati protocolli ottimizzati per due metodi di sterilizzazione diversi: candeggina (fase liquida) e cloro (Cl2) gas (fase gassosa), entrambi con conseguente tassi di germinazione di semi di alta e minima contaminazione microbica. L'utilità di questi protocolli è stato illustrato attraverso la sperimentazione di wild type e mutanti semi con una gamma di potenziali di germinazione. I nostri risultati indicano che semi possono essere efficacemente sterilizzati utilizzando qualsiasi metodo senza mortalità eccessiva seme, anche se sono stati osservati effetti nocivi di sterilizzazione per semi con minore potenziale di germinazione ottimale. Inoltre, un'equazione è stata sviluppata per consentire ai ricercatori di applicare le condizioni di sterilizzazione del gas cloro standardizzato per contenitori ermetici di diverse dimensioni. I protocolli descritti qui consentono sterilizzazione seme facile, efficiente e poco costoso per un gran numero di linee di Arabidopsis.

Semi di Arabidopsis raccolti da una camera aperta del campo, serra o crescita a volte sono contaminati da vari microrganismi come batteri e funghi1,4. Così, germinazione di semi sul terreno sterile può essere particolarmente impegnativo a causa della contaminazione delle piastre, soprattutto quando la fornitura di sementi è limitato. Il protocollo ottimizzato per la sterilizzazione a gas candeggina e il cloro, i cui risultati sono presentati qui di seguito, riduce al minimo questo problema e preserva la vitalità dei semi richiesto per le applicazioni ad alta velocità.
Effetti di sterilizzazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Arabidopsis Col-0
Bleach è l'agente più comunemente utilizzato per la sterilizzazione di seme in numerose specie di piante. La concentrazione ottima dell'agente di sterilizzazione e il tempo di esposizione varia tra specie. Diversi protocolli sono stati impiegati con candeggina per la sterilizzazione di Arabidopsis semi1,4,5,6,7,8,9 , 10. quattro differenti concentrazioni di candeggina con cinque tempo di esposizione diversi periodi sono stati testati e i risultati sono presentate in Figura 1. I trattamenti sono stati applicati ai semi di Columbia selvaggio-tipo (Col-0). L'effetto della concentrazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Col-0 varia a seconda del tempo di sterilizzazione, come dimostrato da un'interazione significativa fra concentrazione di candeggina e tempo di sterilizzazione (Figura 1, P &lt; 0.001, ANOVA-analisi della varianza).
Negli esperimenti con tempi di sterilizzazione tra 5 e 10 min, trattamenti con tutte le concentrazioni di candeggina provocato ugualmente alta germinabilità dei semi Col-0 (Figura 1). Tariffe alta germinazione inoltre sono state osservate per le concentrazioni di candeggina per uso domestico del 40% e 50% per tutti i tempi di sterilizzazione. Trattamenti con candeggina 80% e 100% per periodi più lunghi di 10 min ha provocato una significativa diminuiscono del tasso di germinazione rispetto ai tempi di immersione totale (P &lt; 0.01, ANOVA). Inoltre, per l'80% e il 100% di candeggina trattamenti per 20 min, germinazione è stata significativamente diminuita rispetto al corrispondente 40% e 50% candeggina trattamenti (P &lt; 0.001, ANOVA).
Semi vari livelli di candeggio e avvizzimento quando usando candeggina alte concentrazioni per 15 min o più visualizzati. In aggiunta alla relativamente alta (fino a 32%) mortalità seme, semi germinati sterilizzati in queste condizioni spesso ha mostrate i difetti di crescita, si riflette in un fallimento dei cotiledoni e ipocotili per spiegare e allungare, con conseguente arresto dello sviluppo. Maggior parte dei trattamenti (14 su 20) erano completamente privo di muffa, con conseguente muffa livello media complessiva di 0,21% ± 0,003 (tabella 1).
Un trattamento con candeggina al 50% e un tempo di macerazione di 10 min è stato selezionato come il miglior regime di sterilizzazione perché combinato alto tasso di germinazione con buona inibizione di sviluppo del patogeno superficiale. Questo trattamento è stato selezionato per testare l'effetto di sterilizzazione di candeggina su diverse linee mutanti come descritto di seguito.
Effetti della sterilizzazione del gas di cloro sulla germinazione dei semi di Col-0
Per ottimizzare le condizioni di sterilizzazione del gas di cloro, tre differenti concentrazioni di gas di cloro sono state usate per sterilizzare semi Col-0 per due periodi di tempo (tabella 2). La concentrazione di gas è stata calcolata in base il volume di HCl concentrato e il volume del contenitore di sterilizzazione usando la seguente equazione:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Questa equazione è stata derivata utilizzando la legge dei gas perfetti assumendo 12,3 M HCl, una temperatura di 23 ° C e pressione atmosferica standard di 101,3 kPa.
L'effetto della concentrazione di gas di cloro sulla germinazione dei semi di Col-0 è stato indicato per dipendere dal tempo di sterilizzazione, come indicato da un'interazione significativa fra il tempo e i fattori di concentrazione (Figura 2A, P &lt; 0.01, ANOVA) . Concentrazione di gas di cloro ha avuto alcun effetto significativo sulla germinazione dei semi di Col-0 sottoposto a sterilizzazione 1 h. Con questo tempo di sterilizzazione, tutte le concentrazioni di gas di cloro promosso allo stesso modo alti livelli di germinazione, superiore all'85% (P &gt; 0,05, ANOVA). D'altra parte, una sterilizzazione h-lungo 3 ha provocato una diminuzione significativa del tasso di germinazione per la più alta concentrazione di gas di cloro, confrontato con le due concentrazioni più basse di gas (P &lt; 0,05, ANOVA). Questi risultati indicano che i trattamenti di semi di Arabidopsis con una qualsiasi delle concentrazioni del gas di cloro testata per 1 h, o con le concentrazioni di gas inferiore al 16,5% per 3 h, sono ugualmente efficaci nel preservare la vitalità del seme dal momento che i tassi di germinazione erano sempre maggiori al 82%. Tuttavia, semi per 3 h con 16,5% gas di sterilizzazione è stato dannoso per la germinazione dei semi.
Anche l'incidenza di muffa era dipenda sulla concentrazione di gas e tempo di esposizione. Crescita di muffa efficacemente è stata inibita con concentrazioni relativamente elevate di gas di cloro 6,1% e 16,5% per 1 h-lungo trattamento e con tutte le concentrazioni di gas per 3 h (Figura 2B).
Basato su questi risultati, un trattamento con una concentrazione di gas del 6,1% per 1 h (tabella 2) è stato selezionato come la migliore condizione per sterilizzazione a vapore-fase per testare l'effetto di sterilizzazione a gas su diverse linee mutanti, poiché ha combinato (tasso di germinazione alta 85%) con bassissimo livello di contaminazione di muffa (0,02%).
Effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina sui semi con diversi potenziali di germinazione
L'analisi statistica ha mostrato che la risposta di germinazione a metodi di sterilizzazione dipendeva il potenziale di germinazione delle linee (Figura 3A, P &lt; 0.01, ANOVA). Sterilizzazione a gas né candeggina né cloro ridotto tasso di germinazione dei semi con elevato potenziale di germinazione (gruppi di 4 e 5). Né il trattamento ha avuto un effetto sul tasso di germinazione già basso del gruppo con il più basso di germinazionepotenziale (gruppo 1). Al contrario, sterilizzazione del gas di cloro ha provocato una riduzione significativa di circa 12-18% (P &lt; 0.01, ANOVA) nella germinazione dei semi con potenziale di germinazione intermedio (gruppi 2 e 3). Candeggina sterilizzazione inoltre è diminuito tasso di germinazione del 13% del gruppo 2, ma esso non ha fatto diminuire il tasso di germinazione del gruppo 3. Anche se non c'era differenza significativa nel tasso di germinazione tra la candeggina e il cloro trattamenti di gas in qualsiasi gruppo di germinazione (Figura 3A, P &gt; 0.442, ANOVA), semi sterilizzati con candeggina hanno avuto un leggermente superiore tasso di germinazione di semi sterilizzati con gas in tutti i gruppi di germinazione.
Trattamenti di sterilizzazione alterati significativamente (P &lt; 0.001, ANOVA) la percentuale di semi colpiti da muffa (Figura 3B). Entrambi sterilizzazione di candeggina e gas di cloro ha provocato meno crescita di muffe (P &lt; 0,05, ANOVA) rispetto a nessuna sterilizzazione. Non c'era differenza nel livello di muffa rilevata tra gas e candeggina sterilizzazione in qualsiasi gruppo (Figura 3B, P &gt; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figura 1: gli effetti del tempo di concentrazione e sterilizzazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Arabidopsis Col-0. I valori sono mezzi ± SD ottenuta da 5 replicazioni indipendenti dell'esperimento. * indica le differenze significative rispetto a 5min ammollo durata per un intervallo di concentrazioni di candeggina (P &lt; 0.01, ANOVA). #indica le differenze significative di 80% e 100% candeggina concentrazioni rispetto al 40% e 50% per un 20 min periodo di tempo (P &lt; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figura 2: gli effetti del cloro gas concentrazione e sterilizzazione tempo sui semi di Arabidopsis Col-0. (A) (B) muffa livello e tasso di germinazione. Barre di errore rappresentano mezzi ± SD ottenuta da 5 biologici e tecnici 5 replicazioni dell'esperimento. Significa che non condividono una lettera sono significativamente differenti (P &lt; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figura 3: effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina sui semi con diversi potenziali di germinazione. (A) (B) muffa livello e tasso di germinazione. Le 100 righe di SALK T-DNA sono state classificate in cinque gruppi secondo la loro germinazione potenziale definiti come il tasso di germinazione in assenza di qualsiasi agente di sterilizzazione. I gruppi sulla base del tasso di germinazione erano come segue: gruppo 1 (0-20%), gruppo 2 (21-50%), gruppo 3 (51-70%), gruppo 4 (71-90%) e gruppo 5 (91-100%). Le linee sono stati scelti in modo casuale e loro germinazione potenziale non dipendeva dal genotipo. I valori sono mezzi ± SD ottenuti da tre repliche indipendenti dell'esperimento. Lettere ("a", "ab", "c", ecc.) sopra ogni valore indicano i raggruppamenti statistici dei mezzi di categoria. Significa che non condividono una lettera sono significativamente differenti (P &lt; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tempo di sterilizzazione (min)</td>
			<td colspan="4">Concentrazione di candeggina (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0,36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Livello di stampo di candeggina-sterilizzata semi Col-0.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Candeggina</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Tempo</td>
			<td rowspan="2">% Gas di cloro (mol gas totale Cl2/mol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Cloro (Cl2) gas trattamenti di sterilizzazione sui semi di selvaggio-tipo Columbia utilizzando un contenitore di 7 L.
Supplementare tabella 1: Un foglio di calcolo programmato per effettuare il calcolo per diversi volumi del contenitore e % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

L'obiettivo di questo studio era di determinare gli effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina su germinazione del seme di una gamma di Arabidopsis genotipi coltivati in terreno sterile. Sono stati sviluppati protocolli di sterilizzazione ottimizzato per impedire la crescita di contaminanti microbici fornendo al contempo sopravvivenza seme soddisfacente.

Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire condizioni standardizzate per il successo della sterilizzazione delle sementi di un gran numero di genotipi di Arabidopsis, prevenendo al contempo la crescita microbica. Questo metodo consente di sterilizzare centinaia di campioni di semi alla volta, semplificando così una fase critica di preparazione del materiale vegetale nei campi della genomica, della proteomica, della metabolomica e di altri studi ad alto rendimento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce le condizioni in cui una sterilizzazione efficiente è combinata con un alto tasso di germinazione per un gran numero di campioni di semi.Per iniziare, prepara una soluzione di candeggina al 50% con acqua distillata. A ogni 200 millilitri di soluzione di candeggina, aggiungere 50 microlitri di detersivo TWEEN 20. La soluzione di candeggina può essere conservata fino a un mese, purché venga aperta solo in condizioni sterili.Quindi, aliquotare 100 semi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando un robot di semina su misura. Ora, in una cappa a flusso laminare, aggiungere 500 microlitri della soluzione di candeggina al 50% ai semi.Quindi, trasferire i tubi in un rotatore e incubare i semi nella candeggina con una leggera agitazione per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aspirare la soluzione di candeggina dai tubi rimuovendo il più possibile. Quindi, aggiungere nuovamente 500 microlitri di acqua distillata sterile e capovolgere i tubi per mescolare.Lasciare depositare i semi, quindi aspirare l'acqua e sostituirla con un'altra aliquota per lavare nuovamente i semi. Eseguire un totale di sei lavaggi di questo tipo con acqua distillata sterilizzata. Una volta che i semi sono stati accuratamente lavati con acqua, sospendeteli in un millilitro d'acqua prima di impiattarli.Prima di iniziare il processo di sterilizzazione, calcolare i volumi di candeggina e acido cloridrico necessari per produrre cloro gassoso. Utilizzare l'equazione fornita per ottenere il 6% di cloro gassoso raccomandato. Assicurati di calcolare con precisione il volume di HCl necessario per garantire una sterilizzazione di successo e per evitare schizzi.Assicurati di indossare guanti e un camice da laboratorio durante questo protocollo e cambia i guanti ogni volta che vengono bagnati con acido o candeggina. Sotto una cappa aspirante, trasferire le fiale di semi in una griglia con i coperchi aperti. Quindi, posizionare la griglia in un contenitore di plastica in cui possa avvenire la sterilizzazione e preparare strisce di pellicola di paraffina per sigillare il coperchio del contenitore.Ora, carica il becher con 100 millilitri di candeggina e poi posiziona all'interno un becher da 250 millilitri. L'uso di un eccesso di candeggina è una caratteristica di sicurezza e il becher dovrebbe essere almeno il doppio del volume totale della soluzione che contiene. Inoltre, maneggiare sempre la candeggina e gli acidi separatamente.Quindi, aggiungi tre millilitri di acido cloridrico al becher, quindi chiudi immediatamente il contenitore e sigillalo con parafilm. Monitorare il contenitore per un'ora per assicurarsi che il gas si accumuli durante la sterilizzazione. Il cloro gassoso dovrebbe essere visibile come una debole foschia gialla all'interno del contenitore oppure si può controllare che la soluzione non diventi gialla.Controllare periodicamente la chiusura del contenitore. Se il coperchio si stacca o il sigillo di paraffina inizia ad allentarsi, richiudere ermeticamente il coperchio con un ulteriore strato di pellicola di paraffina. Dopo la sterilizzazione di un'ora, aprire un angolo del contenitore per far sfiatare il gas per un periodo di tre ore.Dopo tre ore di ventilazione, tappare tutti i tubi e conservare i semi sterilizzati in condizioni asciutte fino a quando non vengono impiattati. Ora, neutralizza la reazione aggiungendo lentamente 1,5 grammi di polvere di bicarbonato di sodio mescolando con una bacchetta di vetro per sciogliere i solidi. Continua ad aggiungere bicarbonato di sodio fino a quando le bolle di anidride carbonica non hanno smesso di formarsi.Quindi, misurare il pH della soluzione e, se necessario, aggiungere altro bicarbonato di sodio fino a quando il pH non è neutro. A condizione che la soluzione non sia maleodorante, può essere smaltita. In caso contrario, attendere che tutti gli odori si disperdano.Aggiungi 500 microlitri di acqua distillata sterilizzata a ciascun tubo di semi sterilizzati a gas. Quindi, versare i semi su una piastra MS e distribuirli uniformemente utilizzando un anello di inoculazione sterile monouso o un puntale per pipetta sterile. Dopo tre giorni di stratificazione dei semi a quattro gradi Celsius, trasferire le piastre a 23 gradi Celsius con 16 ore di esposizione giornaliera alla luce.Tieni i coperchi sopra in modo che le radici crescano nel terreno. Dopo otto giorni di crescita, segna la frazione di semi che sono germogliati. La germinazione viene contata quando il radicale si è proiettato al di fuori del rivestimento del seme e i due cotiledoni sono visibili.Inoltre, conta il numero di semi colpiti dalla muffa per determinare l'efficacia delle condizioni di sterilizzazione. Quattro diverse concentrazioni di candeggina in cinque diversi tempi di esposizione sono state testate su semi di tipo selvatico Columbia. Alte concentrazioni di candeggina hanno influenzato negativamente la germinazione con un'esposizione eccessiva.Tuttavia, sono stati osservati alti tassi di germinazione con il 40 e il 50% di candeggina in tutti i tempi di esposizione. I semi sterilizzati con alte concentrazioni di candeggina avevano un'elevata mortalità e spesso mostravano difetti di crescita, ma di solito erano completamente privi di muffa. La sterilizzazione con candeggina al 50% per 10 minuti è stata determinata per avere l'equilibrio ottimale tra inibizione della muffa e germinazione sana.Per ottimizzare le condizioni di sterilizzazione con cloro gassoso, sono state utilizzate tre diverse concentrazioni di cloro gassoso per sterilizzare i semi Columbia wild-type in due diversi periodi di tempo. C'era un'interazione significativa tra il tempo e la concentrazione di gas. A un'ora, non c'è stato alcun effetto sulla germinazione, mentre la concentrazione di gas più alta è stata dannosa a tre ore.Pertanto, è stato scelto un periodo di sterilizzazione di un'ora. La crescita della muffa è stata efficacemente inibita da esposizioni di gas di tre ore o per esposizioni di un'ora utilizzando il sei o il 17% di gas. Pertanto, è stato determinato che una concentrazione di gas del 6% per un'ora è ottimale per la germinazione e l'inibizione delle muffe.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per sterilizzare con successo centinaia di linee di semi al giorno se eseguita correttamente. I semi sterilizzati a gas possono anche essere conservati per un lungo periodo di tempo in condizioni asciutte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le equazioni fornite per calcolare i volumi richiesti di HCl e candeggina.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come gli studi di associazione genome-wide, al fine di collegare una varietà di genotipi diversi e i fenotipi di interesse. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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