Estrazione del DNA basata su matrice per il sequenziamento mirato di nuova generazione su campioni di espettorato decontaminato

La nostra ricerca riguarda la riduzione dei tempi di risposta alla diagnosi di TBC e il successivo inizio incorporando l'NGS per un'assistenza personalizzata al paziente. Il nostro protocollo ottimizza il TNGS per l'uso di routine affrontando l'integrazione del flusso di lavoro, i costi e i tempi di consegna, con l'obiettivo di ridurre i ritardi diagnostici e migliorare l'inizio tempestivo del trattamento.

Questo protocollo consente un'estrazione del DNA da campioni clinici in poche ore in modo economico, rapido e di qualità sufficiente rispetto ai metodi CTAB convenzionali, che richiedono fino a tre giorni.

I nostri risultati sollevano questioni chiave sull'integrazione del TNGS nella diagnostica di routine e sull'ottimizzazione dei metodi di estrazione per campioni negativi allo striscio e scarsi per migliorare la sensibilità e l'utilità clinica. Esploreremo se i campioni residui della diagnostica di routine possono essere utilizzati per il sequenziamento a valle, incluso il sequenziamento diretto dell'intero genoma dell'espettorato per semplificare ed espandere la sorveglianza genomica della TBC.

[Narratore] Per iniziare, ottenere un sedimento di espettorato inattivato termicamente. Centrifugare il campione a 16.800 g o alla massima velocità per 15 minuti. Con una pipetta da 20 a 200 microlitri, aspirare delicatamente ed eliminare il surnatante, assicurandosi che il pellet rimanga indisturbato. Agitare delicatamente la sospensione della matrice per mescolare, quindi pipettare 200 microlitri della matrice ben miscelata per risospendere il pellet. Trasferire l'intero volume in una provetta con tappo a vite da 1,5 millilitri contenente tre perle di vetro pre-sterilizzate di due millimetri di diametro. Ora, posizionare i campioni in un blocco riscaldante a 56 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo l'incubazione, omogeneizzare i campioni con un vortice per 10 secondi per disperdere le cellule, quindi incubare i campioni in un blocco riscaldante a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore ad alta velocità con un ciclo di 60 secondi a 4,0 metri al secondo. Quindi, centrifugare la sospensione a 12.000 G per cinque minuti. Trasferire 130 microlitri di surnatante contenente DNA in una provetta fresca da 1,5 millilitri a basso legame senza disturbare il pellet. Scartare la prima provetta contenente la matrice e i detriti cellulari. Per purificare il DNA utilizzando le microsfere magnetiche, prima agitare il flacone della perlina magnetica o l'aliquota preparata accuratamente per risospendere le perle prima dell'uso, quindi aggiungere 1,2 volte il volume delle perle magnetiche al DNA estratto, pipettare la sospensione 10 volte per mescolare i campioni prima di incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Posizionare i campioni su una rastrelliera magnetica per provette da 1,5 millilitri per tre minuti, o fino a quando il liquido diventa limpido, quindi aspirare con cura e scartare il surnatante senza disturbare le microsfere. Con i tubi sul magnete, aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80%, assicurandosi che le perle rimangano indisturbate. Dopo un'incubazione di 30 secondi, aspirare e scartare con cura l'etanolo senza disturbare le perle. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere eventuali residui di etanolo utilizzando una pipetta da uno a 10 microlitri. Lasciare i tubi aperti per asciugare all'aria le perline per 10 minuti, o fino a quando non avranno un aspetto opaco. Una volta che le perle hanno un aspetto opaco, rimuovere i tubi dal magnete e aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi direttamente sulle perle in ogni campione. Quindi, miscelare ogni singolo campione pipettandolo 10 volte. Ispezionare il tubo per eventuali perline bloccate all'interno. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, riposizionare le provette sul rack magnetico per tre minuti o fino a quando il liquido non è limpido. Con le provette sul rack magnetico, trasferire il surnatante contenente DNA in una provetta sterile a basso legame chiaramente contrassegnata. La concentrazione di DNA era più alta nei campioni di sedimenti da due millilitri, rispetto ai 500 microlitri di tutti i gradi di striscio. Una maggiore variabilità nella resa del DNA è stata osservata in campioni di sedimenti da 500 microlitri. La profondità di copertura delle letture di sequenziamento era più alta nei campioni di sedimento da due millilitri rispetto ai 500 microlitri in tutti i gradi di striscio. La variabilità era maggiore nei campioni di grado più tre strisci estratti da sedimenti da 500 microlitri. I punteggi di accettabilità del sequenziamento erano generalmente più alti nei campioni da due millilitri rispetto a 500 microlitri, con una percentuale maggiore di risultati altamente accettabili. I campioni di grado tre plus hanno avuto la percentuale più alta di risultati accettabili, rispetto ai gradi uno e due più. I campioni da 500 microlitri avevano più casi classificati come inaccettabili o non determinati.