Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione del Plasmodium falciparum in acquosi globuli rossi infetti utilizzando un spettrometro a infrarossi riflessione totale attenuata e analisi multivariata dei dati.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un modello di regressione per la previsione della parasitemia della malaria utilizzando la spettroscopia ATR-FTIR con analisi dei dati multivariata. Questo metodo può aiutare ad accelerare la diagnostica del punto di cura che può aiutare a migliorare i risultati dei pazienti in futuro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mentre il modello può richiedere del tempo per essere costruito, è altamente portatile, intuitivo, altamente sensibile e a basso costo.

Sebbene questo metodo consenta la quantificazione dei parassiti della malaria, può anche essere utilizzato per osservare la risposta fenotipico ai cambiamenti ambientali come i cambiamenti nella composizione dei parassiti dovuti ad agenti antimicrobici. L'idea è nata dal lavoro che abbiamo fatto al sincrotrone australiano sulle cellule infettate dalla malaria. Questo era a livello di cella singola.

Da lì, abbiamo deciso di utilizzare la spettroscopia ATR-FTIR per sviluppare effettivamente il test diagnostico. Prima di iniziare la procedura di sincronizzazione, coltura 30 millilitri di 3D7 ceppo Plasmodium falciparum parassiti come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando una pipetta automatizzata, resuspend la coltura e trasferirla in un tubo conico da 50 millilitri.

Centrifugare la coltura da 300 a 400 volte g in condizioni di laboratorio standard per cinque minuti. Rimuovere il supernatante disegnarlo con una pipetta automatizzata senza disturbare il pellet. Scartare i supporti di scarto in una soluzione di candeggina al 10%.

Aggiungere lentamente 12-15 millilitri di una soluzione di sorbitolo al 4% al pellet e mescolare la coltura tappando e invertendo il tubo fino a quando la coltura non è omogenea. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, centrifuga la coltura per cinque minuti.

Utilizzare una pipetta automatizzata per rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Aggiungere da 10 a 15 millilitri dello 0,9% di soluzione salina al pellet e mescolare la soluzione tappando e invertendo il tubo fino a quando la coltura non è omogenea. Ripetere la centrifugazione e la soluzione salina lavare altre due volte per rimuovere tutti i resti di sorbitolo.

Per iniziare questa procedura, centrifugare i globuli rossi stock o RBC. Rimuovere il supernatante e lavare con lo 0,9% di soluzione salina per un totale di tre volte. Centrifugare gli RBC di serie e la coltura da 300 a 400 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante da ogni tubo.

Etichettare otto tubi a microcentrifugo come indicato. Quindi utilizzare una pipetta da 0,2 a 20 microliter per aggiungere la quantità appropriata di coltura a ciascun tubo. Successivamente, aggiungere la quantità appropriata di RBC stock a ciascun tubo per ottenere la diluizione della parasitemia desiderata.

Centrifugare il sangue fresco del donatore raccolto in tubi anticoagulanti a 1, 200 volte g e condizioni di laboratorio standard per 10 minuti. Rimuovere il plasma disegnarlo con una pipetta e scartarlo in una soluzione di candeggina al 10%. Aggiungere 900 microlitri di RBC donatori isolati in ogni tubo di microcentrifugo e mescolare accuratamente invertendo 10 volte.

Per acquisire lo spettro verrà utilizzato un semplice spettrometro a riflessione totale attenuata a riflessione fourier a infrarossi o spettrometro ATR-FTIR. Preparare e pulire il cristallo utilizzando salviette senza pelucchi inumidite con acqua ultra pura per strofinare delicatamente il cristallo con un movimento circolare. Quindi, utilizzare un'altra salvietta priva di pelucchi per asciugare accuratamente il cristallo.

Per misurare lo sfondo dell'aria, fare clic su Misurazione sfondo. Ogni 20 minuti, pulire il cristallo e ripetere questa misurazione. Aprire la visualizzazione dal vivo facendo clic su Anteprima.

Osservare una linea di base piatta e orizzontale che indica che il cristallo è pulito. Pipettare 10 microlitri di acqua deionizzata direttamente al centro del cristallo e fare clic su Misura campione. Asciugare il cristallo con una salvietta priva di pelucchi e un delicato movimento circolare.

Pipettare 10 microlitri di campione al centro del cristallo e fare clic su Misura campione. Pulire il cristallo tra i campioni. In questa dimostrazione, l'analisi dei dati multivariata verrà eseguita utilizzando MATLAB.

Per iniziare il trattamento dei dati, inserire l'analisi nella finestra di comando per aprire l'interfaccia utente grafica. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella X per trovare Importa dati. Selezionare il tipo di file per l'analisi.

Importare spettri di esempio, acqua e baseline come set di dati nell'ambiente di lavoro selezionando tutti gli spettri in ogni set separatamente, facendo clic su Apri e dando a ciascun set un nome breve. Fate clic su Nuova variabile (New Variable) nella finestra di comando e date al vettore il nome Parasitemia. Inserire la Parasitemia di ogni campione.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella X per trovare Plot Data. Fate clic sull'icona Traccia dati (Plot Data) per tracciare i dati. Ispezionare gli spettri per gli effetti del vapore acqueo facendo clic su Zoom e ingrandindo su 1.800 a 1.400 per centimetro, più chiaramente osservati come picchi brevi, affilati e stretti lungo le pendici delle bande Amide I e Amide II.

In caso di vapore acqueo estremo, aprite la scheda Modifica dati pre-elaborazione e selezionate Smussatura (Smoothing). Ridurre il rumore e/o forti contributi di vapore acqueo levigando il campione e gli spettri d'acqua. Dopo un ulteriore trattamento dei dati come descritto nel protocollo di testo, aprire la scheda Modifica dati e, nelle variabili di colonna, selezionare da 2980 a 2800 per centimetro e da 1750 a 850 per centimetro assicurandosi che solo le relative caselle siano spuntate.

I dati sono ora pronti per l'analisi. Per eseguire l'analisi dei componenti principali o PCA, fate clic su Scomposizione analisi (Analysis Decomposition) e selezionate PCA. Fate clic su Modello di compilazione (Build Model).

Osservare il limite di confidenza del 95%, l'anello tratteggiato, nel grafico dei punteggi tra PC 1 e PC 2. Utilizzate lo strumento Seleziona spettri (Select Spectra) per contrassegnare gli spettri campione con punteggi che si verificano al di fuori del limite come potenziali valori anomali. Per eseguire la regressione parziale dei quadrati almeno, o PLSR, fate clic su Regressione analisi (Analysis Regression) e selezionate PLSR.

Fate clic con il pulsante destro del mouse sul blocco Y e selezionate il modello di costruzione del vettore Parasitemia. Analizzare il modello di regressione e il vettore di regressione e identificare le bande biologiche. Un grafico di regressione parziale dei meno quadrati di RBC è piaciuto tra lo zero e l'uno per cento La Parasitemia ha generato un valore al quadrato R di 0,87 e un errore di convalida incrociata quadratica media radice dello 0,13%Parasitemia.

Ciò dimostra la capacità del modello di prevedere la Parasitemia in ogni campione con la Parasitemia nota sull'asse x e la Parasitemia prevista sull'asse y. Il coefficiente di regressione associato descrive il contributo di ogni banda alla capacità predittiva del modello. Più intensa è la banda, più contribuisce al modello e, quindi, come il parassita altera la composizione chimica del sangue.

I risultati mostrano che il segnale dei parassiti è abbastanza distinto dagli RBC che possono essere utilizzati per formare un modello di regressione lineare per la previsione dei parassiti nei futuri set di dati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere meno di tre minuti per campione se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di pulire i cristalli ATR da tutti i residui.

A seguito di questa procedura, altre specie di malaria come P vivax e P malariae possono essere modellate per rispondere a domande come, La spettroscopia ATR-FTIR è abbastanza sensibile da distinguere tra le specie? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biospectroscopia per esplorare il rilevamento e la quantificazione di altri agenti patogeni trasmessi dal sangue e persino analizzare nel sangue come glucosio e urea. Dopo aver guardato questo video, è necessario avere una buona conoscenza della spettroscopia ATR-FTIR e dell'analisi NVDA per creare un modello di regressione.

Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue e malaria dei pazienti può essere pericoloso e un adeguato allenamento e contenimento del livello di biosicurezza dovrebbe sempre essere fatto quando si tenta questa procedura.