Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del RNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di garantire un'adeguata raccolta di campioni di depositi di tessuto adiposo bianco da diversi topi e di isolare un'elevata quantità di RNA di buona qualità dal tessuto. Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi del metabolismo, della biochimica e della biologia molecolare che, ad esempio, riguardano l'espressione genica nel tessuto adiposo di topi trattati o geneticamente modificati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento di elevate quantità di RNA di buona qualità dal tessuto adiposo che in genere ha un basso contenuto di RNA.

A dimostrare la procedura sarà Emilie Pepin, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Dopo l'eutanasia di un topo, tagliare la pelle sopra la linea alba secondo il protocollo di testo, quindi praticare due incisioni di circa due centimetri dal centro della gabbia toracica verso il braccio destro e vicino agli organi genitali sopra l'arto posteriore destro. Allungare un angolo della pelle aperta e utilizzare un ago calibro 22 per fissarlo sul tampone.

Quindi, appunta l'altro angolo. Utilizzando le forbici chirurgiche posizionate contro la pelle il più piatta possibile, eseguire una dissezione smussata del grasso sottocutaneo addominale, o SCF, quindi trasferirlo su un foglio di alluminio pretagliato. Ripetere la dissezione per il lato sinistro dell'animale.

Quindi, tirare i cuscinetti adiposi raccolti a sinistra e a destra nel foglio di alluminio e utilizzare azoto liquido per congelare il campione. Per accedere al tessuto adiposo viscerale, tagliare il muscolo addominale lungo la linea alba. Quindi, praticare un'incisione nei muscoli addominali dai genitali verso la parte posteriore del topo su entrambi i lati.

Il grasso intorno agli organi riproduttivi è il grasso perigonadico, o PGF. Staccare i cuscinetti adiposi sinistro e destro dall'epididimo, dai testicoli e dal dotto deferente e trasferirli nel foglio di alluminio pre-marcato. Quindi, congelare il campione in azoto liquido.

Partendo dal lato sinistro, esponi i reni spostando l'intestino dalla cavità addominale al lato destro. Il tessuto adiposo che circonda il rene e le ghiandole surrenali è il grasso perirenale, o PRF. Isolare e rimuovere le ghiandole surrenali prima di raccogliere il PRF.

Questo può essere noioso in quanto sono solo un po' più rosa del tessuto adiposo. Ora, isolare il PRF dalla parete muscolare posteriore e tagliare l'uretere, l'arteria renale e la vena che separa il PRF e il rene dal resto del corpo. Quindi, isolare il PRF dal rene tagliando e rimuovendo la capsula renale.

Dopo aver isolato il PRF destro, trasferire il campione nel foglio di alluminio con il tessuto dal lato sinistro e utilizzare azoto liquido per congelare i campioni. Raffreddare tubi conici privi di RNasi da 1,5 millilitri, un mortaio e un pestello e una spatola in azoto liquido secondo il protocollo di testo. Metti il campione di tessuto adiposo nel mortaio, quindi usa alcuni strati di carta marrone per sollevare il pestello dall'azoto liquido e inserirlo nel mortaio.

Tenendo il pestello con la carta, usa il martello per colpire la parte superiore del pestello una o due volte. Quindi, macinare il campione con un movimento rotatorio fino ad ottenere una polvere fine. Quindi, rimuovere il pestello, recuperare la spatola dall'azoto liquido e utilizzarla per trasferire il campione nel corrispondente tubo conico pre-raffreddato da 1,5 millilitri.

Immergere di tanto in tanto la spatola nell'azoto liquido per evitare che il campione si sciolga. Inoltre, tenere la provetta conica su ghiaccio secco per evitare che il campione si scongeli. Riempire la provetta conica a circa 2/3 della capacità con il campione macinato per un'adeguata resa di RNA.

Quindi, preparare i campioni rimanenti secondo il protocollo di testo. Sotto un cappuccio chimico e indossando un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza, rimuovere un campione macinato dall'azoto liquido. Aprire lentamente il tubo e aggiungere 500 microlitri di soluzione fenolica.

Chiudere il coperchio del tubo e vorticare alla massima velocità per circa cinque secondi, quindi aprire lentamente e con attenzione il tubo per rilasciare la pressione dall'azoto. Si sentirà il suono dell'aria che esce dal tubo. Pipettare altri 500 microlitri di soluzione fenolica nella provetta.

Quindi, vortice e aprilo lentamente come prima. Agitare il campione fino a quando non è completamente sciolto. Quindi, aprire la provetta per rilasciare la pressione prima di elaborare ulteriori campioni.

Una volta che tutti i campioni sono stati elaborati, farli roteare brevemente alla massima velocità e incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare le provette a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, riportare i tubi a temperatura ambiente.

Per evitare la contaminazione, per ogni campione, utilizzare una pipetta P1000 con una punta filtrata per isolare quanto più RNA possibile dallo strato rosa intermedio perforando la fase lipidica vicino al lato della provetta. Erogare l'RNA nelle nuove provette coniche senza toccare i lati delle provette per evitare il trasferimento dei lipidi presenti all'esterno della punta. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio puro a ciascun campione e mescolare le provette per inversione per 15 secondi.

Quindi, dopo aver incubato i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti, centrifugare le provette a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti e riportare le provette a temperatura ambiente. Per ogni campione, utilizzare una pipetta P1000 e puntali filtrati per trasferire la maggior quantità possibile di fase superiore acquosa contenente RNA trasparente alla seconda serie di provette coniche corrispondenti. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di isopropanolo al 100% a ciascun campione e mescolare le provette per inversione per 15 secondi.

Quindi, incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare le provette a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti prima di riportare le provette a temperatura ambiente. Eliminare l'isopropanolo versandolo fuori da ogni tubo.

Ora, aggiungere un millilitro di etanolo al 75% a ciascun campione e agitare brevemente le provette alla massima velocità. Quindi, centrifugare i campioni a 7, 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver girato i campioni e averli portati a temperatura ambiente, scartare l'etanolo al 75% capovolgendo ciascuna provetta e accendendola picchiettandola contro la carta marrone per rimuovere eventuali residui di etanolo.

Lasciare il coperchio aperto e asciugare all'aria il pellet di RNA per circa 15-20 minuti. Dopo aver valutato le dimensioni dei pellet di RNA, aggiungere da 10 a 25 microlitri di acqua priva di RNasi a ciascun campione. Incubare i campioni in un blocco termico a 60 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi, agitare brevemente i tubi. Incubare i campioni nello stesso blocco termico per altri cinque minuti. Quindi, centrifugare rapidamente tutti i campioni e posizionarli immediatamente sul ghiaccio.

Eseguire la RT-PCR per l'espressione genica nel tessuto adiposo secondo il protocollo di testo. Come previsto, i topi con la dieta ricca di grassi avevano un aumento di peso corporeo e di peso rispetto ai compagni di cucciolata con la dieta normale. Queste osservazioni sono state accompagnate da un aumento di oltre due volte del peso di PGF, PRF e SCF nei topi obesi rispetto a quelli che seguivano la dieta normale.

Questa tabella mostra che per ogni tessuto adiposo bianco, l'isolamento dell'RNA con una soluzione fenolica ha prodotto campioni con un OD260 su OD280 di circa 2,0, che è considerato puro per l'RNA. Come si vede in questo grafico a barre, i dati della PCR in tempo reale hanno mostrato che l'espressione dell'mRNA della leptina era significativamente più alta nei topi obesi, PRF e SCF rispetto a quelli che seguivano una dieta normale. Le differenze osservate nell'espressione dell'mRNA della leptina non erano dovute a una variazione di s16, il gene di riferimento utilizzato per normalizzare i risultati tra i due gruppi di topi poiché i valori di CT non erano alterati.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in un ambiente privo di RNasi durante la procedura di estrazione dell'RNA. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'amplificazione della PCR in tempo reale per rispondere a ulteriori domande come le modifiche dell'espressione genica.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo per esplorare le modulazioni del tessuto adiposo legate all'obesità e al diabete nei roditori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare diversi cuscinetti adiposi e isolare l'RNA da essi. Non dimenticare che lavorare con la soluzione di fenolo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti.