Name: Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per lanalisi del RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Impara a raccogliere il tessuto adiposo bianco del topo e a estrarre RNA di alta qualità per studi di espressione genica in metabolismo e biologia molecolare. Questo metodo è essenziale per la ricerca sui disturbi metabolici.

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Questo lavoro è stato supportato da diabete Canada.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

HF-dieta seguente nutrire, topi obesi sono stati trovati una maggiore corpo e tessuto adiposo bianco pesi rispetto ai topi alimentati con una dieta di N. RNA estratto usando fenolo soluzione dato i campioni con buona purezza. Leptina è un'adipochina prodotta principalmente da tessuto adiposo ed è conosciuta per correlare positivamente con massa grassa16. Come previsto, espressione di mRNA di leptina aumentata di topi obesi in concomitanza con la loro massa grassa.
Quest...

L'obesità è un'epidemia mondiale che può portare a complicazioni quali 2 diabete di tipo1. Modelli animali obesi e geneticamente indotta da dieta sono frequentemente utilizzati per la ricerca in obesità e delle complicanze associate. Tradizionalmente, il tessuto adiposo bianco è conosciuto come un vano portaoggetti per l'energia in eccesso ed è prevalentemente composto da lipidi mentre il tessuto adiposo bruno converte l'energia in calore2,3. Tessuto adiposo è dinamico e sarà ampliata e ridursi a seconda di molti fattori come l'ingestione di cibo e attività fisica. Quindi, per determinare i fattori che contribuiscono a questi cambiamenti, tessuto adiposo adeguata raccolta e manipolazione sono necessari4.
Tra i tessuti adiposi bianchi, è generalmente accettato che i depositi di grasso sottocutanei e viscerali hanno proprietà diverse, ad esempio la localizzazione anatomica e funzionano2,5. Di conseguenza, per evitare risultati contraddittori o grande variabilità, attenzione deve essere presa per evitare la contaminazione incrociata tra questi diversi depositi di grasso quando si raccolgono i cuscinetti adiposi.
Inoltre, ci sono tre grandi sfide quando isolando RNA o proteine da tessuto adiposo di topi bianchi. In primo luogo, raccogliendo i cuscinetti adiposi in topi obesi non è un compito facile come il confine che separa i diversi depositi di grasso bianchi non è sempre chiaro, a differenza di altri organi come i reni e cuore6. In secondo luogo, a causa del contenuto elevato del lipido del tessuto adiposo, durante l'isolamento di RNA o proteine, uno strato di lipidi galleggia sulla parte superiore e impedisce l'accesso diretto al campione. In terzo luogo, in contrasto con il tessuto adiposo bruno o altri tessuti, tessuto adiposo bianco è considerevolmente minore contenuto di RNA e proteine e questo è di grande preoccupazione quando si utilizza giovani topi, topi alimentati una dieta normale (N) e topi che dovrebbero abbiano basse masse grasse (cioè KO modelli, trattamento con farmaci, esercitano di formazione, ecc.) 7 , 8.
Di conseguenza, scegliere il metodo appropriato per isolare il RNA dal tessuto adiposo è fondamentale. Metodi alternativi all'estrazione del fenolo/cloroformio sono kit commerciali. In genere si basano su una fase di estrazione del fenolo iniziale, seguita da purificazione RNA su una colonna9. Tuttavia, quei kit sono in genere più costosi e dare campioni di rendimento più basso, mentre la qualità di RNA potrebbe essere variabile ma sono molto meno tempo. Tuttavia, uno dei maggiori vantaggi di estrazione del fenolo soluzione/cloroformio descritto qui è la possibilità di isolamento del RNA, DNA e proteina da un singolo campione10. Dal momento che i rilievi grassi topi sono solitamente piccoli e dare piccole quantità di RNA e proteine (soprattutto in modelli murini magra), questi protocolli massimizzano i dati uno può uscire da un piccolo campione.
L'obiettivo di questa carta è di descrivere in dettaglio un metodo per garantire la raccolta di campioni adeguati da depositi di tessuto adiposo bianco tre topi come pure la quantità e la qualità di isolamento del RNA. RNA ottenuto seguendo questo protocollo consente di eseguire analisi di PCR in tempo reale. Questo protocollo non è destinato all'isolamento del RNA dai adipocytes primario coltivati.

<table><tbody><tr><td>1 mL di seringi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X soluzione TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA&bull; Na2. pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aghi da 22 g aghi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 26 g Riscaldatore</td><td></td><td></td><td></td></tr> a blocchi di <tr><td>etanolo</td><td></td><td></td><td></td>al 75%</tr><tr><td>(bagno a secco)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Termo scientifico</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Termo scientifico</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (1 U/&micro; l)&nbsp;</td><td>Termo scientifico</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR verde Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universale SYBR verde master (Rox) colorante fluorescente&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Punte</td><td></td><td></td><td></td>filtrate</tr><tr><td>Pincipe</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Martello</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta per roditori ad alto contenuto di grassi</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR diretto alla leptina (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR inverso alla leptina (5'-GGCTATCTGCAGCAGCATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>Maxima Trascrittasi inversa (enzima e tampone 5x)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Acqua nanopura (indicata come acqua ultrapura)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>Guanti <td></td><td></td><td></td>da <td>esplorazione in nitrile</td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td><td></td>in nitrile</tr><tr><td>Dieta normale per roditori</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di fenolo (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr>Foglio <td></td><td></td><td></td>di<td>alluminio pre-identificato</td></tr><tr><td>Cuvetta</td><td></td><td></td><td></td>spettrofotometro al quarzo</tr><tr><td>Rack per strisce</td><td></td><td></td><td></td>di provette PCR</tr><tr><td>Rack per strisce</td><td></td><td></td><td></td>di provette RT-PCR</tr><tr><td>Esaminatori casuali&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Sistema genico del rotore PCR in tempo reale&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene termociclatore</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco refrigerata Inibitore</td><td></td><td></td><td></td></tr> della <tr><td>RNasi RiboLock&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Provette eppendorf da 1,5 mL senza RNasi Provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>con tappo a vite da 1,5 mL senza RNasi</td></tr><tr><td>Strisce di provette PCR prive di RNasi (0,2 mL) e tappi Acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>senza RNasi&nbsp;</td><td>Macchina Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR strisce di provette (0,1 mL) e tappi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 primer PCR forward (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 primer PCR inverso (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Spettrofotometro da 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio e pestello</td><td></td><td></td><td></td>in acciaio inox</tr><tr><td>Cuscinetti chirurgici</td><td>Fatto in casa un pannello di schiuma avvolto in un sottopiede</td><td></td><td></td>assorbente monouso</tr><tr><td>Forbici chirurgiche&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr>Miscelatore <td></td><td></td><td></td><td>a vortice</td></tr><tr><td>Spatola</td><td></td><td></td><td></td> di pesatura</tr></tbody></table>

accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del rna

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Rispetto ad altri tessuti, tessuto adiposo bianco ha un considerevolmente meno contenuto di RNA e proteine per applicazioni a valle come Real-Time PCR e Western Blot, poiché esso contiene principalmente i lipidi. Isolamento del RNA dai campioni di tessuto adiposo è impegnativo anche come passaggi aggiuntivi sono necessari per evitare questi lipidi. Qui, presentiamo una procedura per raccogliere tre tessuti adiposi bianchi anatomicamente diversi da topi, per elaborare questi campioni ed eseguire isolamento del RNA. Descriviamo ulteriormente la sintesi di cDNA e gene esperimenti di espressione mediante Real Time PCR. Il protocollo descritto dichiara permette la riduzione della contaminazione dell'animale capelli e sangue su cuscinetti adiposi, nonché la contaminazione incrociata tra diversi rilievi grassi durante la raccolta del tessuto. Esso è stato ottimizzato anche per garantire un'adeguata quantità e qualità del RNA estratto. Questo protocollo può essere ampiamente applicato a qualsiasi modello di topo dove campioni di tessuto adiposo sono necessari per gli esperimenti di routine come la PCR in tempo reale, ma non è inteso per l'isolamento da colture cellulari primarie adipocytes.

Seguendo la procedura di autopsia, tre tessuti adiposi bianchi sono stati raccolti e appesantiti da due gruppi di topi (N e HF topi dieta-federazione). Come previsto, i topi sulla dieta HF avevano aumentato peso corporeo finale e aumento di peso rispetto ai littermates sulla dieta N (tabella 1). Queste osservazioni sono state accompagnate da più di un aumento di 2 volte del peso della PGF, PRF e SCF in topi obesi rispetto a quelli sulla dieta N.
<p class="jove_content...

Lo scopo di questa carta è di presentare una procedura dettagliata per raccogliere diversi tessuti adiposi bianchi dai topi, trattare i campioni di grasso ed estrarre RNA.

Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di garantire un'adeguata raccolta di campioni di depositi di tessuto adiposo bianco da diversi topi e di isolare un'elevata quantità di RNA di buona qualità dal tessuto. Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi del metabolismo, della biochimica e della biologia molecolare che, ad esempio, riguardano l'espressione genica nel tessuto adiposo di topi trattati o geneticamente modificati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento di elevate quantità di RNA di buona qualità dal tessuto adiposo che in genere ha un basso contenuto di RNA.A dimostrare la procedura sarà Emilie Pepin, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Dopo l'eutanasia di un topo, tagliare la pelle sopra la linea alba secondo il protocollo di testo, quindi praticare due incisioni di circa due centimetri dal centro della gabbia toracica verso il braccio destro e vicino agli organi genitali sopra l'arto posteriore destro. Allungare un angolo della pelle aperta e utilizzare un ago calibro 22 per fissarlo sul tampone.Quindi, appunta l'altro angolo. Utilizzando le forbici chirurgiche posizionate contro la pelle il più piatta pos

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Riportiamo una procedura per isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi.

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.

Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

È stato sviluppato un protocollo di microdissezione di cattura laser (LCM) per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee. L'attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l'espressione genica nelle cellule di qualsiasi tessuto duro.

Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate

È stato sviluppato un metodo criogenico di polverizzazione per la trattamento delle zampe murine utilizzando un congelatore liquido congelatore di azoto per migliorare la resa e la qualità dell'RNA o delle proteine estratte dai tessuti e consentire l'analisi dei profili molecolari associati agli infiammatori Risposte.

Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili.

Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l'esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.

Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino

Questo protocollo descrive un metodo per isolare l'RNA da regioni istologiche definite di tessuto epatico di topo inserito nel composto di paraformaldeide e composto Optimal Cutting Temperature, utilizzando microdissezione a cattura laser, consentendo un'analisi mirata dell'espressione genica a valle.

Microdissezione da cattura laser del tessuto epatico di topo fissato con paraformaldeide per l'analisi dell'RNA

Impara a raccogliere il tessuto adiposo bianco del topo e a estrarre RNA di alta qualità per studi di espressione genica in metabolismo e biologia molecolare. Questo metodo è essenziale per la ricerca sui disturbi metabolici.

Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del RNA

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