Una fase di time-lapse, privo di etichetta, quantitativa Imaging Studio delle cellule tumorali umane dormienti e attivo

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare quantitativamente i fenotipi angiogenici e non angiogenici delle cellule di osteosarcoma umano in modo sistematico combinando analisi della morfologia, della proliferazione e della motilità cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per quanto riguarda l'insediamento e la progressione del cancro umano. In particolare, la fuga dalla dormienza tumorale e l'interruttore endogeno.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che i parametri multicellulari possono essere analizzati simultaneamente con questo metodo integrato ad alta diffusione. Ciò include l'area cellulare, lo spessore cellulare, il volume cellulare, il tasso di proliferazione, il tempo di raddoppio, la velocità di motilità, la migrazione e la motilità. Per iniziare, preriscalda il terreno di coltura a 37 gradi Celsius a bagnomaria.

Quindi rimuovere le fiale criogeniche di cellule di osteosarcoma umano angiogeniche e non angiogeniche dal serbatoio di azoto liquido. Immergere il fondo delle fiale in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e agitare delicatamente le fiale criogeniche per accelerare il processo di scongelamento. Non appena le cellule sono scongelate, spruzzare la fiala con etanolo al 70% e pulire la fiala per sterilizzarla.

Quindi aspirare immediatamente la sospensione cellulare dal flaconcino e sospenderla delicatamente in 10 millilitri di terreno di coltura riscaldato. Successivamente, centrifugare le sospensioni cellulari per cinque minuti per pellettare le cellule. Di nuovo nella cappa, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 millilitri di terreno di coltura riscaldato.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in un matraccio T75. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare più volte per disperdere uniformemente le cellule. Mettere il pallone in un'incubatrice e lasciare che le cellule si attacchino per almeno 12 ore.

Cambiare il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Quando le cellule raggiungono l'80-100% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura dal pallone e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS sterile senza calcio e magnesio. Quindi aggiungere un millilitro di una soluzione di EDTA Tripson allo 0,25% nel pallone e agitare brevemente il pallone.

Incubare il pallone per due o tre minuti e poi controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule siano arrotondate e staccate. Una volta staccate le cellule, utilizzare una pipetta per aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura e pipettare delicatamente il terreno su e giù più volte per rompere gli aggregati cellulari rimanenti. Dopo aver contato le cellule, seminarne due milioni in un nuovo pallone T75.

Posizionare il pallone in un incubatore e far crescere le cellule fino a una confluenza compresa tra l'80 e il 100% prima di seminare le cellule per l'esperimento di imaging di fase quantitativa. Raccogliere le cellule mediante digestione tripson e seminare cellule angiogeniche e non angiogeniche di osteosarcoma umano in piastre a sei pozzetti alla densità di 50.000-300.000 cellule per pozzetto. Coprire le cellule con un totale di cinque millilitri di terreno di coltura.

Quindi incubare le piastre per almeno 12 ore per dare il tempo alle cellule di attaccarsi. Sostituire il supporto con un supporto nuovo prima dell'imaging. Pulire un vetrino coprioggetto sciacquandolo più volte con acqua corrente deionizzata.

Quindi immergerlo in una soluzione di etanolo al 75% per 15 minuti. Posizionare il vetrino coprioggetto sterilizzato in una cappa a flusso laminare per asciugarlo. Quindi posizionare con cura il vetrino di copertura in una piastra a sei pozzetti, evitando bolle evidenti.

Mettere la piastra nell'incubatrice per equilibrarla per almeno 15 minuti. Se si forma della nebbia sul coperchio della piastra, utilizzare un batuffolo di cotone sterile per pulirla prima dell'imaging. Aprire il software di imaging di fase quantitativa e inizializzare il sistema.

Assicurarsi che i valori siano accettabili nell'autocalibrazione del tempo di esposizione, del contrasto del modello e del rumore dell'ologramma. Quindi, posizionare la piastra a sei pozzetti sul tavolino del microscopio a immagine di fase quantitativa. Tornando al software, fare clic su Live Capture.

Quindi vai al menu di messa a fuoco del software e seleziona manuale. Quindi vai al menu delle impostazioni del microscopio e metti a fuoco grossolanamente le immagini di fase delle celle regolando la distanza di lavoro per ottenere i contorni delle cellule nelle immagini di fase. Al termine, tornare al menu di messa a fuoco del software e modificare l'impostazione della messa a fuoco in automatica.

Ora fai clic su nuovo esperimento. Iniziare a selezionare le posizioni di acquisizione delle immagini utilizzando il mouse o i tasti freccia sul tastierino numerico. Fare clic su Memorizza dopo ogni selezione.

Una volta selezionate tutte le posizioni, vai alla sezione time lapse e imposta gli intervalli di imaging in modo che siano inferiori a cinque minuti e il periodo di tempo totale sia di 48 ore. Avvia l'esperimento facendo clic su Acquisisci. In questo modo le immagini verranno messe a fuoco e acquisite automaticamente nelle posizioni selezionate in ogni punto dell'intervallo.

Dopo l'acquisizione dell'immagine, analizzare la morfologia delle cellule facendo prima clic su identifica cellule. Regolare l'impostazione numerica per la soglia di sfondo in modo che le aree delle celle siano ben separate dal rumore di fondo. Quindi, regola il numero di impostazione per le dimensioni dell'oggetto per assicurarti che ogni cellula abbia un solo nucleo.

Modificare manualmente i segmenti di cella che non soddisfano questo requisito utilizzando le modifiche manuali. Quindi utilizzare la funzione di analisi dei dati nel software per analizzare le celle. Avviare una nuova analisi dei dati facendo clic su Nuova analisi.

Trascinate le immagini selezionate nella scheda dei fotogrammi sorgente e registrate i parametri della morfologia della cella, tra cui l'area della cella, lo spessore ottico e il volume per ogni singola cella. Al termine, scegli la modalità grafico a dispersione o istogramma ed esporta i dati come tabelle o figure. Selezionare almeno cinque immagini distanziate di 12 ore l'una dall'altra e registrare i numeri di cella forniti dal software.

Stimare il tasso di proliferazione delle cellule normalizzando con il numero iniziale di cellule e quindi tracciando il numero di cellule. Infine, stimare il tempo di raddoppio adattando i punti dati utilizzando una curva di crescita esponenziale. Per analizzare il movimento delle celle, utilizzare la funzione traccia celle nel software.

Inizia facendo clic su nuova analisi per avviare una nuova analisi dei dati. Quindi trascina una serie di immagini dal periodo di tempo di interesse nella scheda dei fotogrammi sorgente. Successivamente, nella modalità di selezione Aggiungi celle, scegli casualmente da 10 a 30 celle facendo clic su di esse.

Assicurati di rivedere il tracciamento nella serie di immagini. Nel caso in cui il sistema perda traccia di una cella o rintraccia la cella sbagliata, regolare manualmente la cella di tracciamento facendo clic su identifica per identificare le celle o andando in modalità di selezione e facendo clic su modifica posizione per modificare la posizione di una cella. Al termine, vai a tracciare il movimento e scegli il grafico delle righe delle traiettorie cellulari o vai a tracciare le caratteristiche e il grafico per gli altri parametri relativi al movimento, come la velocità di motilità, la motilità, la migrazione e la direzione della migrazione.

Esporta i dati come tabelle o figure. In questo protocollo, le immagini quantitative di fase sono presentate come olografi. Le cellule mostrate qui raffigurano la morfologia cellulare tipica delle cellule angiogeniche e non angiogeniche dell'osteosarcoma umano.

Lo spessore della cella è calcolato dall'indice di rifrazione e dalla lunghezza del percorso ottico ed è mostrato qui come un grafico a dispersione. I due tipi di fenotipo cellulare hanno mostrato diversi modelli di distribuzione e indicano che le cellule angiogeniche hanno aree cellulari più piccole e uno spessore cellulare maggiore rispetto alle cellule non angiogeniche. Il tasso di proliferazione cellulare dei due tipi di cellule può essere calcolato da immagini 2D come queste, che sono state segmentate e coprono il corso di due giorni.

Per questi specifici tipi di cellule, non sono state riscontrate differenze significative. Per determinare le caratteristiche del movimento cellulare per le cellule, le singole celle devono essere selezionate e tracciate nel tempo. Qui le celle tracciate sono delineate con colori diversi.

Ogni singola cella è stata tracciata nel corso di quattro ore con la traiettoria totale del percorso descritta qui, dove il punto zero e zero è la loro posizione di partenza e la loro posizione finale è indicata dal punto colorato. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'imaging di fase quantitativo per confrontare quantitativamente una serie di parametri morfologici e comportamentali cellulari. In questo caso, tra fenotipi cellulari angiogenici e non angiogenici.

Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare la fuga dalla dormienza tumorale e il ruolo dell'angiogenezia in questo processo. In una piattaforma continua e senza etichettatura. Non dimenticare che lavorare con linee cellulari umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale.