Studiare l'inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale

Qui presentiamo un protocollo per studiare il tasso di inizio della morte cellulare programmata mediante imaging continuo delle foglie inoculate dopo l'induzione della morte cellulare.

Per iniziare, trasferisci le piante di patate infette dal virus in una camera di crescita mantenuta a 22 gradi Celsius. Scegli una pianta per l'osservazione e usa del nastro adesivo per immobilizzare completamente la seconda foglia inoculata. Quindi, collegare il microscopio digitale al computer e avviare il software di acquisizione delle immagini.

Posizionare la foglia sotto il microscopio. Quindi utilizzare la manopola per mettere a fuoco la superficie della foglia. Per regolare le impostazioni della fotocamera, fare clic sul pulsante delle impostazioni.

Ora imposta la luminosità a 64, il contrasto a 14 e la tonalità a zero. Quindi, regola il bilanciamento del bianco, quindi imposta la saturazione su 47, la nitidezza su zero e la gamma su cinque. Fare clic sull'icona di acquisizione dell'immagine e selezionare l'opzione video time-lapse.

Quindi, imposta l'acquisizione dell'immagine ogni 15 minuti per un totale di 24 ore. Premere il pulsante di avvio per avviare l'acquisizione dell'immagine. Per salvare le immagini acquisite, selezionare tutte le immagini e fare clic sull'icona di salvataggio.

Ora scegli le opzioni di esportazione, quindi imposta i punti per pollice al massimo. Una volta salvate, elimina tutte le immagini dal programma. Per modificare le immagini, avvia un software di editing come ImageJ.

Fare clic su file, quindi selezionare Importa e scegliere Sequenza di immagini per importare le sequenze temporali di immagini da un singolo campo visivo. Incollare il percorso della directory delle immagini salvate e premere OK. Una volta completata la conversione, ImageJ avvierà automaticamente un lettore video interno che visualizza il video finito.

Fare clic su file, quindi salvare con nome e selezionare il formato AVI per esportare il file video. Quando si apre una piccola finestra, imposta la frequenza dei fotogrammi su 0,3 FPS, quindi premi OK per salvare il video come file AVI. Per l'analisi microscopica digitale sono state utilizzate piante di patate inoculate di tre o quattro settimane con almeno tre o quattro foglie completamente sviluppate.

La stessa area sulla foglia inoculata è stata osservata a intervalli di 15 minuti per determinare l'insorgenza della lesione e l'espansione nel tempo. A 14 ore di osservazione, nessuna lesione era visibile. Circa 90 minuti dopo, è stata registrata una lesione visibile.

La lesione ha iniziato ad espandersi due ore dopo e ha continuato ad espandersi nelle successive otto ore e mezza.