Name: Studiare linizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Scopri come studiare l'inizio della morte cellulare nelle piante di patata utilizzando un microscopio digitale per osservazione continua. Questo metodo permette di determinare con precisione il tempo di formazione delle lesioni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Barbara Jaklič per l'assistenza tecnica. Questa ricerca è stata finanziata dall'Agenzia slovena per la ricerca e l'innovazione (finanziamento principale della ricerca n. P4-0165 e progetto Z4-3217: Decifrare l'interconnessione di segnalazione redox-related nella resistenza della patata contro i virus).

NOTA: Le sezioni 1 e 2 descrivono un protocollo modificato per la preparazione del materiale vegetale basato sui metodi delineati da Lukan et al.7. In particolare, sono state apportate alcune modifiche alle condizioni ambientali controllate e alla preparazione dell'inoculo.
1. Coltivare piante di patate
<ol><li>Coltiva una patata sana cv. Piante di Rywal in coltura di tessuto del nodo del gambo8.</li>
	<li>Dopo 6-8 settimane, tagliare dieci espianti lunghi 1 cm contenenti nodi di piante di patata su carta sterile in condizioni sterili utilizzando una pinzetta sterile e un bisturi.</li>
	<li>Trasferiscili in scatole di plastica con terreno Murashige e Skoog (MS30) (Figura 1A) e coltivali in condizioni ambientali controllate (22 °C alla luce e 19 °C al buio con radiazioni di 250 μE o μmol/m2/s e un fotoperiodo di 16 ore, con un'umidità relativa del 55% ± 5%).</li>
	<li>Trasferiscili al terreno 2 settimane dopo la micropropagazione.<ol><li>Riempi i vasi (r = 10 cm) con terriccio. Usa un dito per creare un buco profondo 3-4 cm nel terreno al centro di un vaso, riempi il buco con acqua e attendi che si assorba.</li>
		<li>Metti una pianta per vaso nella buca, lasciando le foglie sopra la superficie. Coprite delicatamente le radici con il terriccio (Figura 1B). NOTA: Alcune piante potrebbero non sviluppare radici. Escludere tali piante dall'analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltivare le piante in terra in camera di crescita in condizioni ambientali controllate (22 °C alla luce e 19 °C al buio, con un'umidità relativa del 55% ± 5%, con una radiazione di 250 μmol/m2/s e un fotoperiodo di 16 ore).</li>
	<li>Dopo 3-4 settimane, le piante sono pronte. Usa queste piante per essere inoculato. NOTA: Le piante dovrebbero avere almeno 3-4 foglie completamente sviluppate con foglioline visibili (Figura 1C). Dovrebbero avere un aspetto sano, senza sintomi visibili (foglie gialle o marroni), che potrebbero essere scambiate per lesioni causate da PVY. Per ottenere risultati comparabili, le piante dovrebbero essere inoculate contemporaneamente (ad esempio, alle 9 del mattino) in tutti gli esperimenti per evitare possibili effetti del ritmo circadiano sulla risposta immunitaria della pianta e sulla formazione di lesioni 9,10,11.</li>
</ol>2. Preparazione dell'inoculo e inoculo della patata
<ol><li>Inoculare la pianta con PVY ceppo N-Wilga (PVYN-Wi; accession n. EF558545) inoculo come indicato di seguito. NOTA: È possibile inoculare più piante in parallelo se è disponibile più di un microscopio digitale. Le piante dovrebbero avere almeno tre foglie completamente sviluppate prima dell'inoculazione (Figura 1C). PVYN-Wi è moltiplicato e mantenuto in patata cv. Pentland.<ol><li>Preparare il tampone fosfato, integrato con dietilditiocarbammato di sodio (DIECA), per l'inoculazione: mescolare 1,3 mL di 0,2 M NaH 2 PO 4,8,7 mL di 0,2 M Na2HPO4 e 0,225 g di DIECA. Portare il volume a 100 mL con ddH20. Regolare il pH a 7,6 aggiungendo 1 M di NaOH o 1 M di soluzione di HCl.</li>
		<li>Raccogli 6-8 settimane di vita PVYN-Wi patata infetta cv. Piante di Pentland da coltura tissutale in sacchi di estrazione con rete filtrante (0,5 g per 6 piante) e aggiungere tampone fosfato integrato con DIECA (4x massa di materiale vegetale, rapporto massa/volume). Utilizzare un omogeneizzatore manuale per 1-2 minuti per ottenere una soluzione omogenea.</li>
		<li>Spolverare leggermente le prime tre foglie inferiori completamente sviluppate delle piante di patate di 3-4 settimane (dal punto 1.6) con polvere di carborundum. NOTA: Regolare la quantità di polvere di carborundum. Una quantità eccessiva può causare danni, mentre una quantità insufficiente potrebbe causare un'infezione inefficace. In modo ottimale, vengono utilizzati 0,1 mg/cm di polvere di carborundum, ovvero circa 1,5 mg di polvere per foglia di dimensioni medie (circa 15 cm2).</li>
		<li>Strofinare delicatamente le foglie con l'inoculo (~100 μL per foglia). Dopo 10 minuti, lavare accuratamente le foglie con acqua di rubinetto.<ol><li>Fai attenzione a non danneggiare le foglie. Non superare il tempo di incubazione. Regolare la quantità dell'inoculo in base alla dimensione della foglia - 6,5 μL/cm, che è di circa 100 μL per foglia di dimensione media (circa 15 cm2).</li>
		</ol></li>
		<li>Trasferire le piante in una camera di crescita e farle crescere in condizioni ambientali controllate (28 °C alla luce e 28 °C al buio ad un'umidità relativa del 55% ± 5%, con una radiazione di 250 μmol/m2/s e un fotoperiodo di 16 h) per 3 giorni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione delle piante e utilizzo del microscopio digitale per la registrazione dello sviluppo delle lesioni
<ol><li>Trasferire le piante inoculate dalla camera di crescita mantenuta a 28 °C a una camera di crescita a 22 °C 3 giorni dopo l'inoculazione, con le altre condizioni descritte al punto 1.5.</li>
	<li>Seleziona una pianta per l'osservazione. Immobilizzare la seconda foglia inoculata con del nastro adesivo (Figura 1D). Assicurarsi che la foglia desiderata sia completamente immobilizzata prima di iniziare con l'imaging (Figura 1D).</li>
	<li>Installare un'applicazione software per l'acquisizione di immagini sul computer portatile. Collegare il microscopio digitale al computer. Aprire il software. NOTA: Assicurarsi che l'impianto, il microscopio digitale e il laptop siano posizionati sul ripiano vicino alla presa per collegare il computer. La decisione sulla selezione delle foglie da monitorare potrebbe dipendere dalla questione biologica studiata, ad esempio il tipo di processo che porta alla formazione di una limitata morte cellulare programmata.</li>
	<li>Regolare il microscopio sopra la foglia immobilizzata. Mettere a fuoco utilizzando la manopola del microscopio digitale (mostrato nella Figura 1E).<ol><li>Assicurarsi che la linea di vista sia la più ampia possibile per aumentare le possibilità di catturare la formazione della lesione, ma comunque sufficientemente ingrandita per individuare l'aspetto della lesione (in genere, viene utilizzato un ingrandimento 25x).</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare le impostazioni della fotocamera. Fare clic sul pulsante Impostazioni nell'angolo in alto a destra dell'immagine (Figura 2A, parte 1 cerchiata) e regolare le impostazioni della fotocamera: Luminosità (60-70), Contrasto (10-15), Tonalità (0), Bilanciamento del bianco, Saturazione (45-50), Nitidezza (0), Gamma (5) (Figura 2B). Le impostazioni utilizzate in questo studio sono state le seguenti: Luminosità (64), Contrasto (14), Tonalità (0), Saturazione (47), Nitidezza (0), Gamma (5). NOTA: Le impostazioni della fotocamera devono essere regolate in base alla luce esterna per garantire la migliore qualità dell'immagine. Le impostazioni possono essere adattate in base alle condizioni dell'utente nella camera di crescita.</li>
	<li>Impostare le impostazioni di acquisizione dell'immagine facendo clic sull'icona per Acquisizione immagine (Figura 2C, parte 2 cerchiata). Fare clic sul pulsante Time-Lapsed Video e impostare Image Capture ogni 15 minuti per 24 ore (Figura 2C). NOTA: L'intervallo tra le immagini scattate e la durata dell'imaging è completamente flessibile e può essere adattato in base alle esigenze dell'esperimento. Nel tempo che intercorre tra l'acquisizione dell'immagine, la luce LED si spegne. La luce LED si accende automaticamente durante l'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dell'immagine facendo clic sul pulsante START (Figura 2C). NOTA: Dopo essere state trasferite da 28 °C a 22 °C, le piante dovrebbero iniziare a sviluppare lesioni entro 24 ore. In caso contrario, questo potrebbe essere un segno di inoculazione inefficace. Regolare la quantità di polvere di carborundum, assicurarsi che il tempo di incubazione dell'inoculo sulle foglie fosse corretto e determinare l'abbondanza del virus nell'inoculo mediante qPCR.</li>
	<li>Per salvare le immagini, selezionare tutte le immagini e fare clic sull'icona Salva (Figura 2B, parte 3 cerchiata). Impostare le opzioni di esportazione. Impostare DPI al massimo (300) (Figura 2D). Dopo il salvataggio, eliminare tutte le immagini nel programma.</li>
	<li>Per l'analisi delle immagini, è sufficiente qualsiasi programma per la visualizzazione/modifica delle immagini. L'uso del software gratuito per l'editing delle immagini, ImageJ, è spiegato di seguito.<ol><li>Importare la sequenza temporale di immagini da un singolo campo visivo (nell'angolo in alto a sinistra, fare clic su File, selezionare Importa, quindi Sequenza di immagini). Incollare il percorso della directory delle immagini salvate e premere il pulsante OK per avviare la conversione.</li>
		<li>Dopo la conversione, il software apre automaticamente un lettore video interno che mostra il video finale. Esporta il file video facendo clic su File >opzione Salva con nome e selezionando Formato AVI. Si apre una piccola finestra. Impostare la frequenza dei fotogrammi su 0,3 fps e premere OK per salvare il video come file video AVI. NOTA: Il tempo di sviluppo della lesione può anche essere determinato controllando manualmente tutte le immagini e trovando un'immagine in cui appare la lesione.</li>
	</ol></li>
</ol>

Quantificazione dell'inizio della morte cellulare attraverso l'imaging continuo

<ol><li>Karasev, A. V., Gray, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+emerging+challenges+of+potato+virus+y+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).</li>
<li>Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+Y%3A+A+major+crop+pathogen+that+has+provided+major+insights+into+the+evolution+of+viral+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).</li>
<li>Szajko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+gene+Ny-1+on+potato+chromosome+IX+confers+hypersensitive+resistance+to+Potato+virus+Y+and+is+an+alternative+to+Ry+genes+in+potato+breeding+for+PVY+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance.</a> Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).</li>
<li>Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ny-1+and+Ny-2+genes+conferring+hypersensitive+response+to+potato+virus+Y+%28PVY%29+in+cultivated+potatoes%3A+Mapping+and+marker-assisted+selection+validation+for+PVY+resistance+in+potato+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding.</a> Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).</li>
<li>Lukan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+is+not+sufficient+for+the+restriction+of+potato+virus+Y+spread+in+hypersensitive+response-conferred+resistance+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 168(2018).</li>
<li>Baebler, Š, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+an+indispensable+component+of+the+Ny-1+resistance-gene-mediated+response+against+Potato+virus+y+infection+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato.</a> Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).</li>
<li>Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virus+spread+around+the+cell+death+zone+at+spatiotemporal+resolution+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).</li>
<li>Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+in+vitro+culture+techniques+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Fruit%2C+Vegetable+and+Cereal+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potato in vitro culture techniques and biotechnology.</a> Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator).</a> Nature. 470, 110-115 (2011).</li>
<li>Roden, L. C., Ingle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lights%2C+rhythms%2C+infection%3A+The+role+of+light+and+the+circadian+clock+in+determining+the+outcome+of+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions.</a> Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).</li>
<li>Srivastava, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+circadian+rhythm+in+plant+system%3A+An+update+from+development+to+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response.</a> Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).</li>
<li>Mulaosmanovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+detection+and+quantification+of+lesions+on+leaf+scale+based+on+trypan+blue+staining+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis.</a> Plant Methods. 16, 62(2020).</li>
<li>Martinelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+plant+disease+detection.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of plant disease detection. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).</li>
<li>Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+of+detecting+plant+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426(2019).</li>
<li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Rowarth, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+reveals+potential+regulators+of+programmed+cell+death+and+leaf+remodelling+in+lace+plant+%28Aponogeton+madagascariensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis).</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 375(2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il protocollo dimostrato consente all'utente di determinare con precisione il tasso di inizio della morte cellulare mediante imaging continuo delle foglie inoculate nel tempo tra l'inizio della morte cellulare e la comparsa della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale. Anche se esistono numerosi modi per monitorare l'insorgenza di lesioni e malattie delle piante12,13,14,15, questo protocollo presenta il vantaggio di una misurazione indipendente dalla luce senza disturbare il ritmo circadiano della pianta, poiché la luce viene spenta tra una misurazione e l'altra.
Dopo l'inoculazione, le piante dovrebbero crescere a 28 °C per 3 giorni. Il gene di resistenza Ny-1 , che induce una risposta ipersensibile, è dipendente dalla temperatura e, nelle piante coltivate a temperature più elevate, porta all'aborto della resistenza, che si manifesta come mancanza di formazione di lesioni e diffusione sistemica del virus3. Dopo che le piante sono state trasferite a 22 °C, inizia la morte cellulare, quindi per risultati accurati, l'osservazione con un microscopio digitale dovrebbe iniziare il prima possibile dopo questo trasferimento. Un altro passaggio cruciale nella preparazione della pianta per l'imaging è l'immobilizzazione della foglia (Figura 1D), poiché la pianta continuerà a crescere durante l'imaging, il che potrebbe spostare la foglia osservata fuori fuoco, o tale configurazione non darà i risultati desiderati.
Se il protocollo descritto viene utilizzato su piante transgeniche con componenti alterate di interesse, che si ipotizza siano coinvolte nell'inizio della morte cellulare, il protocollo consente all'utente di determinare se il livello diminuito di un componente studiato influisce sul tasso di inizio della morte cellulare. In questo modo, i componenti coinvolti nell'inizio della morte cellulare possono essere identificati nei patosistemi, dove si verifica la morte cellulare programmata, utilizzando questo protocollo. Altri metodi per identificare questi componenti sono, ad esempio, l'analisi trascrittomica come l'RNA-seq o varie forme di microscopia, che possono essere costose e richiedere molto tempo16. Il metodo descritto in questo protocollo consente un'identificazione facile ed economica dei componenti coinvolti nell'inizio della morte cellulare, osservando le differenze nei tassi di inizio della morte cellulare tra piante transgeniche e di controllo. Idealmente, in una tale configurazione, devono essere utilizzate due fotocamere digitali, poiché una pianta transgenica dovrebbe essere analizzata in parallelo con una pianta di controllo all'interno dello stesso esperimento.
In questo protocollo è stato utilizzato il ceppo PVY N-Wilga; tuttavia, potrebbero essere utilizzati anche altri ceppi di questo virus, ad esempio il PVY marcato con GFP (PVY-N605(123)-GFP)7. Inoltre, altri patosistemi, che provocano lo sviluppo programmato della morte cellulare, potrebbero essere studiati utilizzando questo protocollo con piccole modifiche.

La patata è una delle colture alimentari più coltivate al mondo, al quarto posto dopo riso, grano e mais. Tuttavia, la produzione di patate può essere gravemente influenzata dal virus Y della patata (PVY), che è attualmente considerato il suo più importante patogeno virale 1,2. Nelle piante di patata cv. Rywal, diversi ceppi di PVY (tra cui il ceppo PVY N-Wilga) innescano una resistenza conferita dalla risposta ipersensibile (HR), in cui la restrizione del patogeno al sito di infezione si manifesta come lesioni necrotiche sulle foglie inoculate3. In questo patosistema, l'HR è mediata dal gene di resistenza Ny-1, che è dipendente dalla temperatura, in quanto le piante cresciute a temperature più basse sviluppano in modo efficiente lesioni necrotiche, mentre nelle piante cresciute costitutivamente a temperature elevate (28 °C), l'aborto della resistenza è dimostrato come mancanza di formazione di lesioni e diffusione sistemica del virus 3,4. Quando le piante vengono trasferite a una temperatura più bassa (22 °C), si innesca la morte cellulare, che può essere sfruttata per seguire il tasso di inizio della morte cellulare mediante imaging delle foglie inoculate nel tempo che intercorre tra l'inizio della morte cellulare e la comparsa della morte cellulare.
Questo protocollo dimostra un metodo semplice per la determinazione del tasso di inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale. Analizzando le foglie inoculate dopo aver trasferito la pianta da 28 °C a 22 °C, un microscopio digitale consente l'osservazione continua della foglia negli intervalli desiderati. A differenza dell'uso di altri metodi (ad esempio, la microscopia confocale o l'osservazione della formazione della lesione ad occhio nudo), questo consente di determinare il momento esatto di formazione della lesione e, quindi, il tasso di inizio della morte cellulare fino a minuti esatti, rispetto alle ore dei metodisopra menzionati 5,6. Anche l'uso del microscopio digitale è indipendente dalla luce e può quindi essere utilizzato sia di giorno che di notte. Questo protocollo può essere utilizzato anche per identificare i componenti coinvolti nell'inizio della morte cellulare o per determinare gli effetti di diversi componenti sul tasso di inizio della morte cellulare se le piante utilizzate sono transgeniche e hanno livelli alterati di componenti di interesse.

<table><tbody><tr><td>Bruciatore ad alcool</td><td>Mikro+Polo</td><td>SH-234002455</td><td>Per la sterilizzazione con pinzette e bisturi</td></tr><tr><td>Autoclave A-21 CAV</td><td>Kambi<img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/65824/65824eq01.jpg" style="margine: auto; "></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di carborundum</td><td>VWR Chemicals</td><td>22505297</td><td></td></tr><tr><td>DinoCapture 2.0 </td><td>Software Dino-Lite</td><td>versione 2.0</td><td>per microscopio digitale</td></tr><tr><td>Microscopio digitale Dino-Lite Edge AM7915MZTL</td><td>AnMo Electronics Corporation</td><td>AM7915MZTL</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 70%</td><td>Stella Tech</td><td>P94000</td><td>Per la sterilizzazione di pinzette e bisturi</td></tr><tr><td>Sacche di estrazione</td><td>Bioreba</td><td>420100</td><td></td></tr><tr><td>Camera di crescita FS-WI</td><td>Photon Systems Insturments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore manuale</td><td>Bioreba</td><td>400010</td><td></td></tr><tr><td>Hawita Substrato speciale</td><td>HAWITA Gruppe</td><td>2000000071701</td><td>Substrato pronto all'uso, realizzato con torba (H4-H6 e H6-H8)</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Merck</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Nastro per etichette</td><td>Sigma</td><td>L8144-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Computer portatile con DinoCapture 2.0 installato</td><td>HP</td><td>Z2V77EA#BED</td><td>Il computer deve essere trasferibile poiché l'esperimento prende parte a una camera di crescita</td></tr><tr><td>Murashige e Skoog medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M02220100</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Emsure</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Emsure</td><td>1064700250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetta  Misuratore</td><td>di pH da 0,5</td> mL <td>21500209</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>ML1601</td><td></td></tr><tr><td>Scatole di plastica </td><td>Cvetlice Dornig</td><td>VCG10.5</td><td>Raggio = 10.5 cm</td></tr><tr><td>Vasi in plastica </td><td>Lab Associates</td><td>DIS40003</td><td>Raggio = 11,5 cm (in alto), Raggio = 9,8 cm (in basso)</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Kemika d.d.</td><td></td><td></td>1800408</tr><tr><td>Dietilditiocarbammato di sodio (DIECA)</td><td>Sigma-Aldeich</td><td>228680</td><td>Dietilditiocarbammato di sodio triidrato, reagente ACS</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche sterili</td><td>Braun</td><td>Pinzette 4511733633</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td>BD033R</td><td></td></tr></tbody></table>

studiare l'inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

La resistenza conferita dalla risposta ipersensibile (HR) è un'efficace risposta di difesa che può essere determinata dai geni di resistenza N . L'HR si manifesta con la formazione di zone di morte cellulare sulle foglie inoculate. Qui, viene presentato un protocollo per studiare il tasso di inizio della morte cellulare mediante imaging delle foglie inoculate nel tempo tra l'inizio della morte cellulare e la comparsa della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale. Il microscopio digitale consente un processo di imaging continuo negli intervalli desiderati, che consente una determinazione accurata del tasso di inizio della morte cellulare fino a minuti esatti, rispetto alle ore dei metodi tradizionali. Anche l'imaging con il microscopio digitale è indipendente dalla luce e può quindi essere utilizzato sia di giorno che di notte senza disturbare il ritmo circadiano della pianta. Diversi patosistemi che portano allo sviluppo programmato della morte cellulare potrebbero essere studiati utilizzando questo protocollo con piccole modifiche. Nel complesso, il protocollo consente quindi un'identificazione semplice, accurata ed economica del tasso di inizio della morte cellulare.

Questo studio dimostra un protocollo passo-passo per studiare l'inizio della morte cellulare attraverso l'insorgenza di lesioni sul CV della patata. Rywal, con un microscopio digitale. Ciò consente di determinare l'ora esatta dell'inizio della morte cellulare programmata.
Le piante che hanno sviluppato radici sono state messe nel terreno 2 settimane dopo la cv della patata. Micropropagazione di Rywal (Figura 1A,B). Dopo 3-4 settimane di crescita nelle condizioni descritte, sono state utilizzate piante con almeno 3-4 foglie completamente sviluppate con foglioline visibili che sembravano sane, senza segni di abscissione, per ulteriori analisi (Figura 1C). Utilizzando un microscopio digitale come descritto in questo protocollo, abbiamo osservato la stessa area sulla foglia inoculata a intervalli di 15 minuti e abbiamo determinato l'insorgenza e l'espansione della lesione nel tempo (Figura 3). La lesione si è verificata alle 15 h 30 min (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione della pianta per l'analisi con un microscopio digitale . (A) Una scatola di plastica con MS 30 medium e cv di patata. Gli espianti di piante di Rywal contenenti nodi. (B) Patata cv. Pianta di Rywal in terra (2 settimane dopo la micropropagazione). (C) Patata cv. Pianta di Rywal, pronta per l'inoculo (4 settimane dopo essere stata messa in terra), avente almeno tre foglie completamente sviluppate. (D) Seconda foglia inoculata (freccia) di patata cv. Pianta di Rywal posizionata e immobilizzata (freccia) con nastro adesivo. (E) Pianta posizionata sotto il microscopio digitale con la freccia rivolta verso il quadrante utilizzato per la messa a fuoco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig02.jpg"> Figura 2: Impostazione del software digitale per la registrazione dello sviluppo della lesione. (A) Interfaccia software: cerchiate in rosso sono le opzioni del pulsante per (1) le impostazioni della fotocamera, (2) le impostazioni di acquisizione delle immagini e (3) il salvataggio delle immagini. (B) Finestra con le impostazioni della fotocamera, che si apre con un clic su (1) nel pannello A. Luminosità, Contrasto, Saturazione, Nitidezza e Gamma devono essere regolati correttamente. (C) Finestra con le impostazioni di acquisizione dell'immagine, che si apre con un clic su (2) indicato nel pannello A. (D) Finestra con le impostazioni di salvataggio dell'immagine, che si apre con un clic su (3) indicato nel pannello A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig03.jpg"> Figura 3: Formazione di lesioni sulla foglia inoculata osservata al microscopio digitale. Immagini della parte centrale della foglia di patata inoculata con PVY con un ingrandimento di 23,6x come si vede al microscopio digitale, prese a intervalli di 5 minuti. Le piante inoculate sono state messe a 28 °C per 3 giorni, e il terzo giorno, l'osservazione con un microscopio digitale a 22 °C è iniziata alle 7:00. (A) Alle 21:02, la lesione non è ancora visibile, (B) 90 minuti dopo, alle 22:32, la lesione è visibile. (C) L'espansione della lesione è stata osservata alle 01:02 e (D) alle 07:32 del mattino successivo. L'esperimento è stato ripetuto due volte e le lesioni si sono verificate rispettivamente 8 ore e 15 minuti e 12 ore dopo l'inizio della morte cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui presentiamo un protocollo per studiare il tasso di inizio della morte cellulare programmata mediante imaging continuo delle foglie inoculate dopo l'induzione della morte cellulare.

Studiare l'inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

Per iniziare, trasferisci le piante di patate infette dal virus in una camera di crescita mantenuta a 22 gradi Celsius. Scegli una pianta per l'osservazione e usa del nastro adesivo per immobilizzare completamente la seconda foglia inoculata. Quindi, collegare il microscopio digitale al computer e avviare il software di acquisizione delle immagini.Posizionare la foglia sotto il microscopio. Quindi utilizzare la manopola per mettere a fuoco la superficie della foglia. Per regolare le impostazioni della fotocamera, fare clic sul pulsante delle impostazioni.Ora imposta la luminosità a 64, il contrasto a 14 e la tonalità a zero. Quindi, regola il bilanciamento del bianco, quindi imposta la saturazione su 47, la nitidezza su zero e la gamma su cinque. Fare clic sull'icona di acquisizione dell'immagine e selezionare l'opzione video time-lapse.Quindi, imposta l'acquisizione dell'immagine ogni 15 minuti per un totale di 24 ore. Premere il pulsante di avvio per avviare l'acquisizione dell'immagine. Per salvare le immagini acquisite, selezionare tutte le immagini e fare clic sull'icona di salvataggio.Ora scegli le opzioni di esportazione, quindi imposta i punti per pollice al massimo. Una volta salvate, elimina tutte le immagini dal programma. Per modificare le immagini, avvia un software di editing come ImageJ.Fare clic su file, quindi selezionare Importa e scegliere Sequenza di immagini per importare le sequenze temporali di immagini da un singolo campo visivo. Incollare il percorso della directory delle immagini salvate e premere OK. Una volta completata la conversione, ImageJ avvierà automaticamente un lettore video interno che visualizza il video finito.Fare clic su file, quindi salvare con nome e selezionare il formato AVI per esportare il file video. Quando si apre una piccola finestra, imposta la frequenza dei fotogrammi su 0,3 FPS, quindi premi OK per salvare il video come file AVI. Per l'analisi microscopica digitale sono state utilizzate piante di patate inoculate di tre o quattro settimane con almeno tre o quattro foglie completamente sviluppate.La stessa area sulla foglia inoculata è stata osservata a intervalli di 15 minuti per determinare l'insorgenza della lesione e l'espansione nel tempo. A 14 ore di osservazione, nessuna lesione era visibile. Circa 90 minuti dopo, è stata registrata una lesione visibile.La lesione ha iniziato ad espandersi due ore dopo e ha continuato ad espandersi nelle successive otto ore e mezza.

studying-cell-death-initiation-using-a-digital-microscope

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vi presentiamo un protocollo semplice per visualizzare le regioni di morte cellulare programmata (PCD) in embrioni di topo e di differenziazione staminali embrionali (ES) colture cellulari utilizzando un colorante chiamato LysoTracker altamente solubile.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Qui si descrive un metodo efficace per lo studio delle dinamiche di gioco cellulare per...

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

L'attività citotossica della fenantridina PJ-34 in cellule tumorali in mitosi è stata documentata in tempo reale dai confocale vivo. PJ-34 sradicato cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule che ospitano in più-centrosomi nella mitosi. A differenza della normale mitosi bi-focale, l'extra-centrosomi non sono stati raggruppati in due poli del fuso in presenza di PJ-34.

Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere gli effetti della IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di uno stadio per valutare i modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic basata sulla morfologia di 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)-macchiato i nuclei visualizzati da microscopia di fluorescenza.

One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza

Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

Qui, presentiamo un protocollo per monitorare la sopravvivenza su una base di singola cellula e identificare le variabili che significativamente predicono la morte delle cellule.

Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per studiare e quantificare la morte cellulare negli organoidi del colon umano in risposta a perturbageni citotossici come le citochine. L'approccio impiega un colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), la microscopia a fluorescenza dal vivo e un software di analisi delle immagini open source per quantificare le risposte di singoli organoidi a stimoli citotossici.

Quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo

Questo protocollo descrive un metodo di imaging su cellule vive per monitorare la permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi, utilizzando sonde fluorescenti che rilevano cambiamenti nell'integrità e nell'acidificazione della membrana lisosomiale.

Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

Scopri come studiare l'inizio della morte cellulare nelle piante di patata utilizzando un microscopio digitale per osservazione continua. Questo metodo permette di determinare con precisione il tempo di formazione delle lesioni.

Studiare l'inizio della morte cellulare utilizzando un microscopio digitale

Esplora altri video