Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14⁺ umani

Cerchiamo di capire quali trattamenti immunomodulatori possono generare cellule dendritiche tollerate da cellule dendritiche già differenziate derivate da monociti, e questo è molto prezioso per la ricerca autoimmune e sui trapianti. Le autoterapie stanno diventando più pratiche grazie ai progressi nella produzione e le cellule dendritiche tollerogeniche si sono dimostrate promettenti negli studi preclinici. Possono generare tolleranza antigene specifico. Il più comune è per la citometria. Ciò fornisce un modo rapido e accessibile per analizzare le cellule tollerate. È difficile generare cellule dendritiche tollerogeniche che persistano in entrambe le funzioni in vivo. Questo è il motivo per cui non esistono terapie cellulari dendritiche clinicamente approvate per le tollerate. Abbiamo identificato nuove combinazioni di composti immunomodulatori da ampi studi di screening che mostrano un miglioramento della funzionalità tollerata delle cellule dendritiche. Progettiamo anche formulazioni di nanoparticelle tolleranti.

[Istruttore] Per iniziare, metti le provette da 15 millilitri contenenti monociti umani arricchiti e con cellule T in una centrifuga. Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta per aspirare il surnatante dalle provette. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura MODC al pellet di monociti, un millilitro di terreno di coltura per cellule T alla provetta con le cellule T e mescolare bene prima della conta cellulare. Quindi, aggiungere nove millilitri di terreno di coltura MODC caldo alla sospensione di monociti per ottenere il volume finale di 10 millilitri. Quindi pipettare 100 microlitri ciascuno di soluzioni madre GM-CSF e IL-4. Trasferire la sospensione in una piastra di Petri etichettata, contrassegnata come MODC, e incubare. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di congelamento delle cellule T alla sospensione delle cellule T. Dividere il composto in due fiale criogeniche da due millilitri. Posizionare le fiale criogeniche sigillate in una camera di congelamento con tubi di bilanciamento in pozzetti inutilizzati. Il quarto giorno, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura MODC fresco alla provetta dei monociti. Quindi pipettare 100 microlitri ciascuno di soluzioni stock GM-CSF e IL-4 sette e incubare fino al settimo giorno. Il settimo giorno, trasferire le cellule dendritiche differenziate derivate dai monociti, o MDOC, in una provetta da 50 millilitri e centrifugare come prima. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura MODC caldo al pellet cellulare e pipettare su e giù per mescolare bene. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione con terreno di coltura MODC caldo contenente GM-CSF e IL4 fino a ottenere la concentrazione cellulare desiderata. Erogare 100 microlitri della sospensione contenente 30.000 cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a fondo piatto da 96 pozzetti. Aggiungere un microlitro di farmaci immunomodulatori nei pozzetti designati e incubare. Il giorno successivo, centrifugare la piastra MODC a 300 G per cinque minuti. Dopo aver rimosso delicatamente il surnatante, aggiungere delicatamente 200 microlitri di HBSS caldo sul lato della piastra e centrifugare. Anche in questo caso, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura MODC caldo contenente GM-CSF e IL4 dopo l'aspirazione del surnatante. Se si utilizza l'immunostimolazione, aggiungere un microlitro di 100X stock di lipopolisaccaride ai pozzetti designati e incubare. L'ottavo giorno, scongelare due fiale criogeniche in un bagno di perle calde a 37 gradi Celsius fino a quando il contenuto inizia a sciogliersi. Una volta parzialmente scongelate, trasferire le fiale in una cappa per colture cellulari. Quindi aggiungere un millilitro di terreno di coltura di cellule T calde per scongelare rapidamente le cellule. Trasferire il contenuto in una provetta da 50 millilitri e sciacquare le fiale criogeniche con un ulteriore millilitro di terreno di coltura di cellule T per raccogliere tutte le cellule. Rabboccare la sospensione con una soluzione colorante a flusso fino a 15 millilitri e centrifugare. Risospendere il pellet in cinque millilitri di soluzione di colorazione a flusso e centrifugare nuovamente, quindi risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura di cellule T caldo dopo aver pipettato il surnatante. Aggiungere nove millilitri di terreno di coltura di cellule T calde per ottenere un volume finale di 10 millilitri. Trasferire la sospensione in una capsula di Petri etichettata come cellule T scongelate e incubare. L'ottavo giorno, centrifugare la piastra MODC a 300 G per cinque minuti. Dopo aver pipettato il surnatante, aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante a flusso in ciascun pozzetto e incubare. Quindi pipettare su e giù per rimuovere le cellule attaccate e la sospensione cellulare in una nuova piastra con fondo a V a 96 pozzetti prima di centrifugare nuovamente. Pipettare 50 microlitri di anticorpo inibitore del legame del recettore FC in ciascun pozzetto dopo aver aspirato il surnatante per bloccare il legame aspecifico. Dopo aver incubato la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti, aggiungere 50 microlitri del cocktail di anticorpi del pannello di convalida preparato in ciascun pozzetto. Mescolare 50 microlitri di perle di compensazione con 50 microlitri di ciascun anticorpo diluito in provette da 1,5 millilitri e incubare. Centrifugare la piastra a 300 g per cinque minuti. Risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione colorante a flusso per lavare le cellule. Dopo il lavaggio finale e la centrifugazione, risospendere le cellule in 110 microlitri di soluzione di colorazione a flusso per l'analisi citofluorimetrica. Per i MODC tolleranti, sostituire il cocktail di anticorpi con il cocktail del pannello di tolleranza. Il nono giorno, trasferire la capsula di Petri delle cellule T scongelata in una provetta da 50 millilitri e rabboccare la provetta con una soluzione di colorazione a flusso. Utilizzare la seconda provetta contenente cellule T non colorate per l'analisi trigonometrica. Centrifugare i tubi a 250 g per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule in terreni di coltura cellulare caldi. Conta le cellule T e assicurati di ottenere un minimo di 4 milioni di cellule. Centrifugare la piastra MODC a 300 G per cinque minuti. Dopo aver aspirato i surnatanti, aggiungere 200 microlitri di cellule T in ciascun pozzetto. Aggiungere cellule T non colorate per piastre di analisi trigonometriche. Aggiungere 25 microlitri per millilitro di cocktail di anticorpi anti-CD3/CD28 a tutti i gruppi, ad eccezione dei pozzetti di controllo negativi, per stimolare le cellule T e incubare fino al giorno 12. Quindi, trasferire tutte le sospensioni cellulari dalla piastra di coltura a 96 pozzetti in una piastra con fondo a V con soluzione di colorazione a flusso. Lavare le cellule due volte in 200 microlitri di soluzione colorante a flusso. Metti da parte alcune celle per i controlli di compensazione. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare la piastra. Quindi aggiungere 50 microlitri di anticorpo inibitore del legame del recettore FC diluito in ciascun pozzetto e incubare. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri del cocktail di anticorpi del pannello trigonometrico preparato in ciascun pozzetto. Per i controlli di compensazione, miscelare 50 microlitri di cellule di compensazione non colorate con 50 microlitri di ogni singolo anticorpo colorato. Incubare la piastra e i controlli di compensazione a quattro gradi Celsius per un'ora, quindi lavare con una soluzione colorante prima di centrifugare. Ora colorare le cellule con colorante vivo/morto nel vicino infrarosso diluito in HBSS a 200 microlitri per pozzetto prima dell'incubazione a freddo. Lavare e centrifugare la piastra prima di colorarla con Fox P3 e l'analisi citofluorimetrica. Il primo giorno, i monociti indifferenziati erano prevalentemente HLA-DR-minus con un piccolo CD14 meno, mentre i monociti differenziati del settimo giorno mostravano la maggior parte delle cellule come HLA-DR-plus, CD14 meno, CD1c-plus, CD141 plus. Il trattamento con rapamicina, sia con che senza lipopolisaccaride, ha ridotto significativamente le popolazioni DC-SIGN-plus CD1c-plus e ha inibito la sovraregolazione dei marcatori CD86 e CD40 osservata con il solo trattamento con LPS. Le popolazioni di cellule regolatorie T P3-plus di FOX sono aumentate quando le MDC erano in co-coltura con le cellule T. Ma non sono state osservate differenze significative tra i quattro gruppi di trattamento con MODC. La proliferazione delle cellule T è risultata ridotta sia nelle popolazioni di cellule T CD4-plus che CD8-plus dopo la co-coltura con MDOC trattati con Rapa. I campioni trattati con interleuchina-10 hanno aumentato significativamente la produzione di interleuchina-10 a 24 ore. Gli MDOC trattati con Dex hanno aumentato significativamente la produzione di interleuchina-10, ma solo dopo aver riposato per 72 ore. Il pretrattamento con desametasone ha ridotto la generazione media di TNF alfa dopo il trattamento con LPS a 24 ore. Aumenti significativi di PDL1-plus MDOCs sono stati osservati nei gruppi trattati con Dex plus LPS e Rapa a 72 ore. La soppressione dell'espressione di CD86 è stata osservata in tutti i gruppi trattati con immunomodulatore sia a 24 che a 72 ore. Gli MDOC trattati con immunomodulatore non hanno aumentato la proliferazione delle cellule T CD4-plus.