Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

Questa procedura descrive l'individuazione e isolamento di mouse leucociti TH17 che attivamente secernono IL-17 sulla stimolazione.

La tecnologia del saggio di secrezione di citochine max consente il rilevamento delle citochine secrete a livello di singola cellula e l'isolamento sensibile delle cellule secernenti citochine vitali al fine di marcare le cellule secernenti IL 17. Una sospensione a singola cellula di leucociti di topo viene preparata e stimolata a 37 gradi Celsius con lo ione PMA micina per indurre la secrezione di citochine per fermare la secrezione. Le cellule vengono quindi poste su ghiaccio dove vengono esposte al reagente di cattura IL 17.

Una volta che la secrezione viene riavviata aumentando la temperatura a 37 gradi Celsius, l'IL 17 viene intrappolato dal reagente di cattura. Un anticorpo bispecifico che si lega a CD 45 sulla superficie cellulare dei leucociti e a IL 17 quando viene secreto e catturato vicino alla secrezione della superficie cellulare viene quindi nuovamente fermato posizionando le cellule su ghiaccio per rilevare le cellule intrappolate Le cellule IL 17 vengono incubate con un secondo anticorpo specifico IL 17 coniugato alla biotina E un anticorpo anti-biotina PE le cellule possono ora essere analizzate direttamente mediante citometria a flusso o preparate per isolamento e arricchimento mediante successiva marcatura con microsfere coniugate anti PE. Ciao, mi chiamo Ellie Rankin, una delle scienziate della Mill Tenney Biotech.

Oggi vi mostrerò una procedura per isolare e rilevare i leucociti TH 17, che dopo la stimolazione secernono IL 17 IL 17 svolge un ruolo importante nell'immunità adattativa e nella risposta infiammatoria ed è anche importante nel guidare l'infiammazione autoimmune. Quindi lascia che ti mostri come viene eseguito il test. Per il protocollo odierno, dobbiamo prima creare un tampone contenente PBS con BSA e EDTA a due millimolari perché le bolle d'aria possono bloccare le colonne di separazione massima, il tampone deve essere degassato e conservato a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius prima dell'uso.

In secondo luogo, utilizziamo il terreno RPMI 1640 contenente il 5% di siero di topo. Il terreno di coltura non deve contenere BSA o FCS poiché questi composti alterano la specificità della stimolazione cellulare. Infine, avrai bisogno del kit per l'arricchimento e il rilevamento delle cellule del test di secrezione IL 17 di MIL 10 E Biotech.

Il kit contiene i seguenti componenti, il reagente catch IL 17, l'anticorpo di rilevamento IL 17, la biotina, l'anti biotina pe e le microsfere anti PE. Logicamente probabilmente eseguirai questo protocollo con un controllo negativo e positivo come un non stimolato, citi PLE e un colorante di contrasto per le cellule T. Per la nostra dimostrazione, ci concentreremo solo sulle cellule stimolate.

Questo protocollo sarà effettuato utilizzando una tecnica sterile. Il nostro protocollo inizia con una sospensione di una singola cellula di citi SP di topo isolati utilizzando l'associatore max delicato. La concentrazione di cellule deve essere predeterminata tramite il conteggio delle cellule.

Pellettare le celle a 200 Gs per 10 minuti a temperatura ambiente Dopo la centrifugazione, aspiriamo il super natin dal pellet utilizzando una pipetta. Non travasare il tubo per evitare la perdita del pellet. Ora le cellule dovrebbero essere risospese nel nostro terreno di coltura e poi aggiungerlo al terreno sufficiente per una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro e 5 milioni di cellule per centimetro quadrato.

Per stimolare una risposta immunitaria nelle nostre cellule risospese, aggiungiamo al campione gli ioni micina e PMA e mescoliamo la soluzione pipettando delicatamente su e giù. Quindi i pozzetti vengono etichettati di conseguenza. Ora ci incuberemo per tre ore a 37 gradi Celsius senza miscelazione per iniziare il periodo di stimolazione.

Procedere all'analisi IL 17 tre ore dopo l'inizio della stimolazione. Quindi pianifica di conseguenza. Qui vediamo cellule della milza di topo stimolate.

Si prega di notare la distinta morfologia e il raggruppamento cellulare delle cellule stimolate. Per chiarezza, seguiremo solo le cellule stimolate. Da qui in poi, per fermare la secrezione, raccogliamo le cellule stimolate pipettando delicatamente su e giù.

Con il tampone freddo, le celle vengono poi trasferite dal pozzetto a un tubo e lavate una seconda volta. Per assicurarsi che tutte le cellule siano raccolte, è una buona idea controllare il piatto al microscopio. Se le cellule rimangono ancora attaccate, è possibile raccogliere le cellule rimanenti risciacquando il piatto.

Con il tampone freddo, eventuali grumi di cellule nella sospensione cellulare possono essere rimossi utilizzando i filtri di pre-partecipazione. Una potenziale insidia di questa procedura è la contaminazione incrociata del reagente di cattura, che può verificarsi durante l'etichettatura. Quando l'anticorpo bispecifico si lega a una cellula T non secernente e intrappola l'IL 17 secreto da un linfocita vicino, generando così falsi positivi per aggirare questo problema, è fondamentale raffreddare le cellule prima della marcatura e lavorare con il tampone freddo per limitare la secrezione e rallentare la diffusione dell'IL 17 ed evitare questa contaminazione incrociata.

È fondamentale notare che la contaminazione crociata può verificarsi anche se è presente più del 2% delle cellule secernenti IL 17. Se si prevede che la concentrazione di cellule secernenti IL 17 sia superiore al 2%, regolare i volumi di conseguenza. Quindi, oltre a mantenere le cellule fredde, devono essere mantenute a una concentrazione definita.

Per iniziare la procedura di etichettatura utilizziamo 10 milioni di cellule in una provetta chiudibile da 15 millilitri. Se è necessario utilizzare un numero di celle più elevato, è sufficiente aumentare di conseguenza tutti i volumi. Una volta ottenuta la concentrazione ottimale delle cellule, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di tampone freddo.

Centrifugare ora le celle a 300 Gs per 10 minuti in una centrifuga refrigerata dopo la centrifugazione, aspirare completamente il surnatante utilizzando una pipetta. Non decantare il surnatante poiché ciò porterà alla perdita di cellule e a volumi imprecisi. Ripetere la fase di lavaggio che consiste nell'aggiungere 10 millilitri di tampone freddo, centrifugazione e aspirazione.

Ora che abbiamo un pellet della purezza desiderata, risospendere le cellule in qualsiasi microlitri di terreno di coltura a freddo per etichettarle. Aggiungeremo ora 20 microlitri di reagente di cattura IL 17 per topo. Incubare le cellule per cinque minuti con ghiaccio.

Dopo il periodo di incubazione di cinque minuti sul ghiaccio, rimuovere la provetta e diluire le cellule in 10 millilitri a 37 gradi Celsius. Caldo medio. Quindi fissare la provetta sul rotatore per provette max mix e incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 45 minuti.

In movimento continuo, l'aumento della temperatura a 37 gradi Celsius riavvierà la secrezione di citochine dopo il periodo di secrezione di 45 minuti a 37 gradi Celsius. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Questo fermerà la secrezione di citochine.

Da qui in poi è fondamentale mantenere le cellule in ghiaccio. Lavorare con il tampone freddo eviterà la contaminazione incrociata del reagente di cattura. Riempire la provetta con tampone freddo e centrifugare a 300 g da due a otto gradi Celsius per 10 minuti.

Aspirare completamente il superber natin. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta. Il Cell Pellet viene risospeso in 80 microlitri di tampone freddo e il tubo viene posto sul ghiaccio.

Per evitare il legame aspecifico dell'anticorpo, si consiglia l'aggiunta di 10 microlitri di reagente bloccante FCR e l'incubazione su ghiaccio per cinque minuti. Quindi aggiungiamo 20 microlitri di anticorpo di rilevamento IL 17 di topo che viene coniugato alla biotina e incubiamo per 10 minuti su ghiaccio. Ancora una volta, lavare le celle come abbiamo fatto prima aggiungendo 10 millilitri di tampone freddo e centrifugare a 300 Gs da due a otto gradi Celsius per 10 minuti.

Ora aspirare e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone freddo e aggiungere 20 microlitri del nostro anticorpo secondario. Anti biotina pe. Mescolare le cellule e la soluzione di anticorpi secondari e incubare nuovamente la provetta per 10 minuti con ghiaccio.

Una volta completata la seconda incubazione, lavare le cellule con tampone freddo da 10 millilitri e centrifugare. Il pellet può ora essere risospeso in 500 microlitri di tampone freddo. Se le celle devono essere separate per ulteriori analisi a valle, possono essere marcate magneticamente con microsfere anti PE e separate manualmente o automatizzate utilizzando colonne e separatori max.

Abbiamo ora completato la marcatura dei nostri citi SPLU e siamo pronti per l'analisi per la nostra analisi. Confronteremo i citi SP stimolati e non stimolati mediante citometria a flusso prima di correre. Fatti Le cellule vengono colorate con ioduro di propidio a 0,5 microgrammi per millilitro per eliminare le cellule morte.

Il citometro a flusso è stato caricato con 200.000 cellule per ogni campione e ora esamineremo i grafici di dispersione della reattività relativa degli anticorpi nei campioni. Due considerazioni importanti per l'analisi di cellule rare come le cellule positive all'IL 17 mediante citometria a flusso sono l'impostazione di un gate sui linfociti nel grafico di dispersione diretta rispetto a quella laterale e l'eliminazione della colorazione delle cellule morte con ioduro di propidio e cellule B che possono causare una colorazione di fondo non specifica. Al fine di migliorare ulteriormente la sensibilità di rilevamento.

Qui usiamo l'anticorpo PC CD quattro A per rilevare le cellule T nell'anticorpo CD 45 RB due 20 per CP. Per rilevare le cellule B, vediamo le proprietà di dispersione in avanti e lateralmente dei campioni e applichiamo un'andatura sulla relazione della popolazione linfocitaria. È stato applicato un secondo cancello per vedere le cellule morte colorate e le cellule B colorate sull'asse Y.

Queste cellule sono escluse dall'analisi delle cellule T. In questo esempio, che è essenzialmente il nostro controllo negativo, possiamo vedere che ci sono pochissimi IL 17 che secernono quattro cellule T positive in campioni non stimolati, circa lo 0,003%Osservando la popolazione di cellule T stimolate, possiamo vedere un numero sostanziale di cellule T positive CD quattro che secernono IL 17, circa lo 0,367% prima della separazione e 60 virgola 76% dopo la separazione magnetica con la tecnologia max. Vi abbiamo appena mostrato attraverso la documentazione video come utilizzare il test di secrezione IL 17 del topo mul 10 biotech per il kit di arricchimento e rilevamento cellulare utilizzando il pe.

La parte più importante di questa procedura è avere un'idea della frequenza delle cellule secernenti IL 17 che si hanno nella popolazione di partenza. La corretta concentrazione cellulare garantirà che la marcatura e il periodo di secrezione delle citochine abbiano una minore contaminazione incrociata, garantendo così risultati affidabili. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.