Name: Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Scopri come rilevare e isolare leucociti TH17 del topo che secernono IL-17 usando un saggio di secrezione di citochine. Questo metodo consente l'analisi a livello di singola cellula per studi di immunologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Preparazione dei reagenti <ol><li> Fai un buffer contenente PBS con BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Perché le bolle d&#39;aria in grado di bloccare colonne di separazione MACS, il buffer deve essere degassata e conservato a 2-8 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Noi usiamo RPMI 1640 medium contenente siero del mouse 5%. Il terreno di coltura non deve contenere BSA o FCS, in quanto questi composti alterano la specificità della stimolazione delle cellule. </li><li> L&#39;IL-17 mouse Assay secrezione - Arricchimento delle cellule e Detection Kit-da Miltenyi Biotec. Il kit contiene i seguenti componenti: l&#39;IL-17 reagente di cattura, la IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina), l&#39;anti-biotina-PE, e l&#39;Anti-PE microsfere. </li></ol> Stimolare il splenociti <ol><li> Questo protocollo è eseguita in presenza di un controllo negativo e positivo, come splenociti non stimolate e di contrasto per le cellule T. Questo protocollo è eseguita con tecnica sterile. </li><li> Preparare una sospensione singola cella di splenociti mouse che sono stati isolati utilizzando il dissociatore gentleMACS ™. La concentrazione di cellule devono essere predeterminati attraverso il conteggio delle cellule. Agglomerare le cellule a 200 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante fuori il pellet con una pipetta. Non decantare il tubo per evitare la perdita del pellet. </li><li> Ora, risospendere le cellule nel mezzo di coltura e quindi aggiungere ad un pozzo. Aggiungere mezzo sufficiente per una concentrazione di dieci milioni di cellule per mL e cinque milioni di cellule per centimetro quadrato. </li><li> Per stimolare una risposta immunitaria nelle nostre cellule risospese, aggiungiamo ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / ml) al campione e mescolare la soluzione pipettando gentilmente su e giù. Poi i pozzi sono debitamente etichettati. </li><li> Ora, noi incubare le nostre cellule per 3 ore a 37 ° C senza miscelazione per iniziare il periodo di stimolazione. Procedere alla IL-17 analisi 3 ore dalla comparsa dei stimolazione, in modo da pianificare di conseguenza. </li><li> Per interrompere la secrezione, le cellule sono immessi sul ghiaccio e raccogliamo le cellule stimolate pipettando gentilmente su e giù con il tampone a freddo. Le cellule sono poi trasferiti dal bene a un tubo e vengono lavati una seconda volta. </li><li> Per garantire che tutte le cellule vengono raccolte, è una buona idea controllare il vostro piatto al microscopio. Se le cellule sono ancora attaccato, è possibile raccogliere le cellule rimanenti risciacquando il piatto con il tampone a freddo. Eventuali grumi di cellule in sospensione cellulare può essere rimosso utilizzando il pre-separazione filtri. </li></ol> Etichettare le cellule con reagente Cattura <ol><li> E &#39;fondamentale notare che questo test funziona in modo ottimale se meno del 2% di IL-17-secernenti cellule sono presenti. </li><li> Se la concentrazione di IL-17 le cellule secernenti dovrebbe essere superiore al 2% regolare i volumi di conseguenza. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Un potenziale problema di questa procedura è la contaminazione incrociata dei reagenti Catch, che può verificarsi durante l&#39;etichettatura quando il bi-specifico anticorpo si lega ad un non-secernenti delle cellule T e le trappole IL-17 secreta da un linfocita vicini, generando falsi positivi. </li><li> Per aggirare questo problema, è fondamentale per le cellule raffreddare prima dell&#39;etichettatura e lavorare con tampone a freddo per rallentare la diffusione di IL-17 e di evitare la contaminazione incrociata. Oltre a mantenere le celle frigorifere, devono essere mantenuti ad una concentrazione definita. </li><li> Per iniziare la procedura di etichettatura, si usa 10.000.000 cellule in una provetta da 15 ml richiudibili. Se il numero di cellule superiore devono essere utilizzati, semplicemente scala di tutti i volumi di conseguenza. Una volta che la concentrazione cellulare ottimale è stata ottenuta, lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di tampone a freddo. </li><li> Spin giù le cellule a 300 × g per 10 minuti in una centrifuga refrigerata (2-8 ° C). </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante completamente con una pipetta. Non decantare il sopranatante come questo porterà alla perdita di cellule e volumi impreciso. Ripetere la fase di lavaggio, che consiste di aggiungere 10 ml di tampone a freddo, centrifugazione, e aspirazione. </li><li> Ora che abbiamo un pellet di purezza desiderato, risospendere le cellule in 80 ml di terreno di coltura a freddo. Etichettarli, noi ora aggiungere 20 ml di mouse IL-17 reagente Catch. </li><li> Incubare le cellule per 5 minuti in ghiaccio. </li><li> Dopo il periodo di incubazione di 5 minuti sul ghiaccio, rimuovere il tubo e diluire le cellule in 10 ml di 37 ° C di media caldi. Poi fissare il tubo sul Tubo Rotator MACSmix e incubare il tubo a 37 ° C per 45 minuti sotto continuo movimento. L&#39;aumento della temperatura a 37 ° C ripartirà secrezione di citochine. </li></ol> Etichettare le cellule con IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) e anti-biotina-PE <ol><li> Dopo il periodo di secrezione 45 minuti a 37 ° C, mettere il tubo immediatamente in ghiaccio. Questo fermerà la secrezione di citochine. Da qui in poi è fondamentale per mantenere le cellule in ghiaccio.Lavorare con tampone freddo evitare la contaminazione crociata dei reagenti Catch. </li><li> Riempire il tubo con tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante completamente. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Il pellet cellulare è risospeso in 80 ml di tampone a freddo e il tubo è posto su ghiaccio. </li><li> Per evitare il legame non specifico degli anticorpi, si consiglia l&#39;aggiunta di reagente FCR 10μl di blocco e incubare in ghiaccio per 5 min. Poi si aggiungono 20 l di mouse IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) che è coniugato con biotina e incubare per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Ancora una volta, lavare le cellule come abbiamo fatto prima con l&#39;aggiunta di 10 mL di tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. </li><li> Ora aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 80 ml di tampone a freddo. </li><li> Aggiungere 20 ml di nostro anticorpo secondario, anti-biotina-PE. </li><li> Mescolare le cellule e la soluzione di anticorpo secondario, incubare e di nuovo il tubo per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Una volta che questa seconda incubazione è completa, lavare le cellule con 10 mL di tampone fredda e centrifuga. </li><li> Il pellet può essere risospeso in 500 ml di tampone a freddo. </li><li> Se le cellule devono essere separati per ulteriori analisi a valle, possono essere magneticamente etichettati con Anti-PE-microsfere e separati manualmente o automatizzati con colonne MACS e separatori MACS. </li><li> Ora abbiamo completato l&#39;etichettatura del splenociti e sono pronti per l&#39;analisi. </li></ol> FACS analisi <ol><li> Per la nostra analisi, metteremo a confronto i splenociti stimolati e non stimolate mediante citometria a flusso. </li><li> Prima di citometria a flusso, le cellule sono colorate con ioduro di propidio a 0,5 mg / ml per escludere le cellule morte. L&#39;analizzatore MACSQuant ™ è stato caricato con 200.000 cellule per ogni campione e che ora stanno andando a guardare le trame dispersione di reattività anticorpale relativa nei campioni. Due considerazioni importanti per l&#39;analisi di cellule rare - come IL-17 cellule positive - mediante citometria di flusso sono: <ul><li> impostazione di un cancello sulla linfociti nel scatter in avanti rispetto a scatter plot lato </li><li> gating e fuori le cellule morte (colorate con ioduro di propidio) e B-cellule (che possono provocare colorazione aspecifica di fondo) per migliorare ulteriormente la sensibilità di rilevazione </li></ul></li><li> Abbiamo usato CD4-APC anticorpi per rilevare le cellule T e l&#39;anticorpo CD45R/B220-PerCP per rilevare le cellule B. Vediamo le proprietà scatter in avanti e laterale dei campioni e applicare un gate sulla popolazione linfocitaria. </li><li> Una seconda porta è stata applicata per vedere le cellule colorate le cellule morte e B colorate (asse Y). Queste cellule sono esclusi dall&#39;analisi delle cellule T. </li><li> In questo esempio, che è essenzialmente negativo del nostro controllo, possiamo vedere che ci sono pochissimi IL-17 CD4 cellule che secernono positivo T nei campioni non stimolata - circa il 0,003% (Figura 4). Guardando alla popolazione di cellule T stimolate, possiamo vedere un numero consistente di cellule T CD4 positive che secernono IL-17 - circa 0,367% (Figura 5A) prima della separazione e 60,76% dopo la separazione magnetica con MACS Technology (Figura 5B). </li></ol>

Tutti i protocolli e le schede tecniche sono disponibili presso www.miltenyibiotec.com. Avvertenze I reagenti contengono sodio azide. In condizioni di acidità sodio azide produce acido idrazoico, che è estremamente tossico. I composti devono essere diluiti con acqua corrente prima di smaltimento. Queste precauzioni sono raccomandate per evitare depositi nelle tubazioni che esplosivo può sviluppare.

Cellule TH17 giocano un ruolo fondamentale nel immunità adattativa e la risposta infiammatoria e sono una componente chiave nel guidare l&#39;infiammazione autoimmune. Questo video documenta come utilizzare il mouse Miltenyi di IL-17 Assay secrezione - Arricchimento cellulare e kit di rilevamento (PE). Nel fare questa procedura è importante avere una stima della frequenza di IL-17-cellule che secernono nella vostra preparazione delle cellule di partenza. La concentrazione cella appropriata durante l&#39;etichettatura e la secrezione di citochine periodo impedisce la contaminazione incrociata da altre cellule in sospensione e assicura risultati affidabili.

<table><tbody><tr><td>Kit per il saggio di secrezione di IL-17 da topo, arricchimento e rilevamento cellulare (PE)</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Mezzo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR, topo</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit per la rimozione delle cellule morte</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Agitatatore rotante per provette MACSmix</td><td>Strumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissociatore gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Strumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit iniziale autoMACS Pro</td><td>Strumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Colonne MACS</td><td>Attrezzo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Separatore MACS</td><td>Attrezzo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione e isolamento delle vitali del mouse il-17-cellule che secernono t

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

La secrezione delle citochine MACS tecnologia di analisi permette di individuare i citochine secrete a livello di singola cellula e l&#39;isolamento sensibile di valide cellule che secernono citochine. Al fine di etichetta IL-17-cellule che secernono, una sospensione singola cella di splenociti mouse è preparato e stimolato a 37 ° C con PMA / ionomicina per indurre la secrezione di citochine. Per arrestare la secrezione delle cellule vengono poi immessi sul ghiaccio e sono esposti al IL-17 reagente Catch a bi-anticorpo specifico che si lega al CD45 sulla superficie cellulare dei leucociti e di IL-17 come è secreta e catturato vicino alla superficie della cellula. Secrezione è poi ri-iniziata aumentando la temperatura a 37 ° C e IL-17 è intrappolato dal reagente Catch. Secrezione è poi fermato di nuovo, mettendo cellule su ghiaccio. Per rilevare l&#39;IL-17 intrappolati, le cellule vengono incubate con un secondo IL-17-anticorpo specifico coniugato con biotina e un anti-biotina-PE anticorpi. Le cellule possono ora essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso o preparati per l&#39;isolamento e l&#39;arricchimento per l&#39;etichettatura successive con Anti-PE microsfere coniugate.

Questa procedura descrive l&#39;individuazione e isolamento di mouse leucociti TH17 che attivamente secernono IL-17 sulla stimolazione.

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

La tecnologia MACS Cytokine Secretion Assay consente il rilevamento di citochine secrete a livello di singola cellula e l'isolamento sensibile di cellule vitali...

La tecnologia del saggio di secrezione delle citochine max consente la rilevazione delle citochine secrete a livello di singola cellula e l'isolamento sensibile di cellule vitali che secernono citochine, al fine di etichettare le cellule che secernono IL-17. Viene preparata una sospensione monocellulare di leucociti murini e stimolata a 37 gradi Celsius con PMA e ionomicina per indurre la secrezione delle citochine, che successivamente viene arrestata. Le cellule vengono quindi poste sul ghiaccio, dove vengono esposte al reagente di cattura per IL-17.Una volta che la secrezione viene riavviata aumentando la temperatura a 37 gradi Celsius, l'IL-17 viene trattenuta dal reagente di cattura. Un anticorpo bispecifico che si lega al CD45 sulla superficie cellulare dei leucociti e all'IL-17 mentre viene secreta e catturata vicino alla superficie cellulare interrompe nuovamente la secrezione posizionando le cellule sul ghiaccio; per rilevare le cellule con IL-17 trattenuta, queste vengono incubate con un secondo anticorpo specifico per l'IL-17 coniugato alla biotina e con un anticorpo anti-biotina PE. Le cellule possono ora essere analizzate direttamente mediante citometria a flusso oppure preparate per l'isolamento e l'arricchimento tramite etichettatura successiva con microsferette coniugate all'anti-PE. Ciao, mi chiamo Ellie Rankin, sono una delle scienziate di Mill Tenney Biotech.Oggi vi mostrerò un procedimento per isolare e rilevare i leucociti TH17, che una volta stimolati secernono IL-17. L'IL-17 svolge un ruolo importante nell'immunità adattativa e nella risposta infiammatoria ed è inoltre fondamentale nel promuovere l'infiammazione autoimmune. Lasciatemi quindi mostrare come si esegue il saggio. Per il protocollo di oggi, dobbiamo prima preparare un buffer contenente PBS con BSA ed EDTA 2 millimolare, poiché le bolle d'aria possono ostruire le colonne di separazione magnetica; il buffer deve essere sgrassato e conservato a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius prima dell'uso.In secondo luogo, utilizziamo un mezzo RPMI 1640 contenente il 5% di siero murino. Il mezzo di coltura non deve contenere BSA o siero fetale bovino (FCS), poiché questi composti altererebbero la specificità della stimolazione cellulare. Infine, sarà necessario il kit per il saggio di arricchimento e rilevamento delle cellule secernenti IL-17 murina di MIL 10 E Biotech.Il kit contiene i seguenti componenti: il reagente di cattura per IL-17, l'anticorpo di rilevamento per IL-17, biotina, l'anti-biotina PE e le microperle anti-PE. È logico che si esegua questo protocollo includendo un controllo negativo e uno positivo, come ad esempio cellule non stimolate, cellule PLE e una colorazione di contro per i linfociti T. Per la nostra dimostrazione, ci concentreremo esclusivamente sulle cellule stimolate.Questo protocollo verrà eseguito utilizzando una tecnica sterile. Il nostro protocollo inizia con una sospensione di singole cellule di citi SP di topo isolati mediante l'associatore gentle max. La concentrazione delle cellule deve essere determinata in anticipo tramite conteggio cellulare.Centrifugare le cellule a 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il sopranatante dal pellet utilizzando una pipetta. Non decantare il tubo per evitare la perdita del pellet. Ora le cellule devono essere risospese nel mezzo di coltura e quindi aggiungere un volume sufficiente di mezzo per ottenere una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro e 5 milioni di cellule per centimetro quadrato.Per stimolare una risposta immunitaria nelle nostre cellule ri-sospese, aggiungiamo ionomicina e PMA al campione e mescoliamo la soluzione pipettando delicatamente su e giù. Successivamente, le pozzette vengono etichettate in modo appropriato. Ora procederemo con un'incubazione di tre ore a 37 gradi Celsius senza mescolamento per iniziare il periodo di stimolazione.Procedere all'analisi dell'IL-17 tre ore dopo l'inizio della stimolazione. Pertanto, pianificare di conseguenza. Qui osserviamo cellule della milza di topo stimolate.Si noti la morfologia distinta e il raggruppamento cellulare delle cellule stimolate. Per chiarezza, seguiremo soltanto le cellule stimolate. A partire da questo punto, per arrestare la secrezione, raccogliamo le cellule stimolate pipettando delicatamente su e giù.Successivamente, con tampone freddo, le cellule vengono trasferite dalla pozzetta a un tubo e lavate una seconda volta. Per assicurarsi che tutte le cellule siano raccolte, è consigliabile controllare la piastra al microscopio. Se alcune cellule rimangono ancora attaccate, è possibile raccogliere le cellule residue risciacquando la piastra.Con un buffer freddo, eventuali aggregati cellulari nella sospensione cellulare possono essere rimossi utilizzando i filtri di pre-partecipazione. Un potenziale inconveniente di questa procedura è la contaminazione incrociata del reagente di cattura, che può verificarsi durante l'etichettatura. Quando l'anticorpo bispecifico si lega a un linfocita T non secernente e intrappola l'IL-17 secreta da un linfocita vicino, si generano falsi positivi; per evitare questo problema, è fondamentale raffreddare le cellule prima dell'etichettatura e utilizzare un buffer freddo per limitare la secrezione e rallentare la diffusione dell'IL-17 ed evitare tale contaminazione incrociata.È fondamentale notare che la contaminazione incrociata può verificarsi anche se è presente più del 2% di cellule secernenti IL-17. Se si prevede che la concentrazione di cellule secernenti IL-17 sia superiore al 2%, regolare i volumi di conseguenza. Pertanto, oltre a mantenere le cellule fredde, è necessario mantenerle a una concentrazione definita.Per iniziare la procedura di marcatura, utilizziamo 10 milioni di cellule in un tubo da 15 millilitri con chiusura ermetica. Se è necessario utilizzare un numero maggiore di cellule, aumentare proporzionalmente tutti i volumi. Una volta ottenuta la concentrazione cellulare ottimale, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di tampone freddo.Ora centrifugare le cellule a 300 G per 10 minuti in una centrifuga refrigerata; al termine della centrifugazione, aspirare completamente il soprannatante utilizzando una pipetta. Non decantare il soprannatante poiché ciò causerebbe perdita cellulare e volumi imprecisi. Ripetere il passaggio di lavaggio, che consiste nell'aggiungere 10 millilitri di tampone freddo, centrifugazione e aspirazione.Ora che abbiamo un pellet della purezza desiderata, risospendere le cellule in un qualsiasi volume in microlitri di mezzo di coltura freddo per etichettarle. Aggiungeremo ora 20 microlitri di reagente di cattura per IL-17 murina. Incubare le cellule per cinque minuti sul ghiaccio.Dopo il periodo di incubazione di cinque minuti sul ghiaccio, rimuovere il tubo e diluire le cellule in 10 millilitri di mezzo pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. Quindi fissare il tubo sul rotatore per tubi Max Mix e incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 45 minuti.Sotto movimento continuo, aumentare la temperatura a 37 gradi Celsius per riavviare la secrezione di citochine dopo il periodo di secrezione di 45 minuti a 37 gradi Celsius. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Questo fermerà la secrezione di citochine.Da questo punto in poi è fondamentale mantenere le cellule sul ghiaccio. L'uso di tampone freddo eviterà la contaminazione incrociata del reagente di cattura. Riempire il tubo con tampone freddo e centrifugare a 300 G a due-otto gradi Celsius per 10 minuti.Aspirare completamente il soprannatante. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta. Il pellet cellulare viene risospeso in 80 microlitri di tampone freddo e il tubo viene posto sul ghiaccio.Per evitare il legame non specifico dell'anticorpo, si consiglia di aggiungere 10 microlitri di reagente bloccante FCR e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, aggiungiamo 20 microlitri di anticorpo anti-mouse IL-17 coniugato alla biotina e incubiamo per 10 minuti sul ghiaccio. Ancora una volta, laviamo le cellule come fatto in precedenza aggiungendo 10 millilitri di tampone freddo e centrifugando a 300 Gs a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius per 10 minuti.Ora aspirare e risospendere il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone freddo e aggiungere 20 microlitri del nostro anticorpo secondario. Anti-biotina PE. Mescolare le cellule e la soluzione di anticorpo secondario e quindi incubare nuovamente il tubo per 10 minuti sul ghiaccio.Al termine della seconda incubazione, lavare le cellule con 10 millilitri di tampone freddo e centrifugare. Il pellet può ora essere risospeso in 500 microlitri di tampone freddo. Se le cellule devono essere separate per ulteriori analisi a valle, possono essere marcate magneticamente con microsfere anti-PE e separate manualmente o in modo automatizzato utilizzando colonne max e separatori max.Abbiamo ora completato la marcatura dei nostri spliociti e siamo pronti per l'analisi. Confronteremo gli spliociti stimolati e non stimolati mediante citometria a flusso prima dell'esecuzione. Le cellule morte vengono escluse mediante colorazione con ioduro di propidio a 0,5 microgrammi per millilitro.Il citofluorimetro &egrave; stato caricato con 200.000 cellule per ogni campione e ora andremo a esaminare i grafici di dispersione della reattivit&agrave; relativa degli anticorpi nei campioni. Due aspetti importanti nell'analisi di cellule rare, come le cellule positive per IL-17 mediante citofluorimetria, sono l'impostazione di una finestra (gate) sui linfociti nel grafico di dispersione forward rispetto a side scatter e l'esclusione mediante gating delle cellule morte marcate con ioduro di propidio e delle cellule B, che potrebbero causare una colorazione di fondo aspecifica. Al fine di aumentare ulteriormente la sensibilit&agrave; della rilevazione.Qui utilizziamo l'anticorpo CD four A PC per rilevare le cellule T nell'anticorpo CD 45 RB two 20 per CP. Per rilevare le cellule B, osserviamo le proprietà di scattering in avanti e laterale dei campioni e applichiamo un gating sulla popolazione di linfociti. Un secondo gating è stato applicato per visualizzare le cellule morte marcate e le cellule B marcate sull'asse Y.Queste cellule sono escluse dall'analisi dei linfociti T. In questo esempio, che rappresenta essenzialmente il nostro controllo negativo, si può osservare che vi sono pochissimi linfociti T CD4 positivi che secernono IL-17 nei campioni non stimolati, circa lo 0,003%. Osservando la popolazione di linfociti T stimolati, si nota un numero consistente di linfociti T CD4 positivi che secernono IL-17, circa lo 0,367% prima della separazione e il 60,76% dopo la separazione magnetica con tecnologia MACS. Vi abbiamo appena mostrato, tramite documentazione video, come utilizzare il kit per il saggio di secrezione di IL-17 da topo di Miltenyi Biotec per l'arricchimento cellulare e il rilevamento mediante PE.La parte più importante di questa procedura è avere un'idea della frequenza delle cellule secernenti IL-17 presenti nella popolazione iniziale. La concentrazione cellulare corretta garantirà che l'etichettatura e il periodo di secrezione della citochina subiscano meno contaminazioni incrociate, assicurando così risultati affidabili. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video illustra un metodo per isolare le cellule T natural killer invarianti, note anche come cellule iNKT. La procedura inizia con l'iniezione di un glicolipide sintetico in un topo per stimolare l'attivazione e la proliferazione delle cellule iNKT nella milza. Successivamente, le sospensioni di singole cellule vengono preparate dalla milza e incubate con complessi di riconoscimento delle cellule iNKT marcati con fluorofori, seguite da una separazione basata su biglie magnetiche, per...

Isolamento di cellule T Natural Killer invarianti da un modello murino

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

L'analisi in vitro della ricombinazione del cambio di classe nei topi è impegnativa a causa delle molecole IgE citofile legate ai recettori Fc sulla superficie delle cellule B.  Descriviamo un metodo per la rilevazione delle IgE utilizzando la scissione mediata dalla tripsina delle IgE legate alla superficie prima della fissazione e della permeabilizzazione per la colorazione a fluorescenza citoplasmatica.

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione.  La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Qui, descriviamo un protocollo per analizzare il fenotipo delle cellule T regolatorie (Treg) isolate da topi naïve e cronici infetti dal virus della coriomeningite linfatica. Inoltre, forniamo un processo per valutare l'attività soppressiva delle cellule Treg.

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Questo documento descrive i protocolli di valutazione della risposta Tfh e GC B nel modello di topo di infezione da virus influenzale.

Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2), implicate nell'infiammazione di tipo 2, partecipano principalmente alla risposta all'infezione da elminti, alle malattie allergiche, all'omeostasi metabolica e alla riparazione dei tessuti. In questo studio, viene dimostrata una procedura per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina e rilevare l'espressione di CD226.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

Questo protocollo descrive la differenziazione di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene in vitro. In particolare, se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica, è possibile ottenere una purezza del 90% delle cellule Th17 patogene da cellule T CD4+ naive utilizzando questo metodo di differenziazione.

Differenziazione in vitro di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene nel topo

L'attuale studio mostra protocolli per valutare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus e manipolare l'espressione genica in queste cellule.

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Scopri come rilevare e isolare leucociti TH17 del topo che secernono IL-17 usando un saggio di secrezione di citochine. Questo metodo consente l'analisi a livello di singola cellula per studi di immunologia.

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

Esplora altri video