Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre un metodo di colorazione dell'argento ottimizzato per un rilevamento rapido, facile e a basso costo dei marcatori SSR nei gel di poliacrilammide non denaturanti. La rapida genotipizzazione dei marcatori SSR può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca genetica e delle applicazioni, come l'analisi della diversità genetica e la selezione assistita da marcatori nei programmi di selezione molecolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facile da eseguire, richiede meno tempo e utilizza meno reagenti chimici rispetto ad altri protocolli per il rilevamento dei marcatori SSR.

Questo metodo evita il fissaggio, l'arresto e le diverse fasi di lavaggio presenti nei protocolli convenzionali. E richiede solo le due fasi principali di impregnazione e sviluppo. Utilizzando questo protocollo è possibile produrre immagini nitide in quanto non è possibile generare rumore di fondo per il rilevamento inequivocabile dei modelli di bande SSR.

Con questa tecnica è possibile eseguire lo screening di circa 800 campioni di DNA al giorno, che è stata utilizzata con successo nella ricerca sul tabacco e sul cavolo cinese in fiore. Dopo aver preparato i prodotti PCR e le soluzioni in gel secondo il protocollo di testo, utilizzare il detersivo in acqua di rubinetto per lavare un set di piastre di vetro e distanziatori, seguito da un risciacquo completo con acqua distillata. Metti le piastre in uno stendipiatti ad asciugare all'aria.

Disperdere un millilitro di soluzione di Bind-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro rettangolare e asciugarla per cinque minuti. Quindi disperdere un millilitro di Repel-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro dentata con un tampone e utilizzare una carta velina per rimuovere la soluzione in eccesso prima di lasciare asciugare la lastra all'aria per cinque minuti. Assemblare le lastre di vetro con distanziatori con la piastra dentata sulla parte superiore.

E usa i morsetti di colata per bloccare entrambi i lati del gruppo. Quindi, versare una quantità appropriata di soluzione di gel di poliacrilammide non denaturante al 6% in un becher per il set di piastre. Aggiungere 20 microlitri di TEMED e 200 microlitri di APS fresco al 20% e mescolare delicatamente.

Versare immediatamente e con cura la soluzione nelle lastre di vetro assemblate lungo il bordo della piastra dentellata, riempiendo lo spazio quasi fino in cima. E inserisci il pettine. Quindi aggiungere un piccolo volume di soluzione di gel sul pettine e lasciare che il gel si solidifichi a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quando il gel è completamente polimerizzato, rimuovere i morsetti di colata e posizionare la piastra impostata nell'unità serbatoio dell'elettroforesi con la piastra dentellata rivolta verso il serbatoio tampone superiore. Utilizzare morsetti grandi per fissare il set di piastre all'unità serbatoio. Versare un litro di tampone 0,5 X TBE in ciascuna delle camere superiore e inferiore.

Quindi rimuovere il pettine e utilizzare una pipetta o una siringa riempita di tampone per lavare accuratamente tutti i pozzetti. Per far funzionare il gel di poliacrilammide, caricare circa un microlitro di prodotto PCR in ciascun pozzetto. Inoltre, carica una scala del DNA su entrambe le estremità.

Quindi fissare il coperchio di sicurezza alla camera tampone superiore. Collegare i cavi all'alimentatore, facendo corrispondere il colore codificato rosso con il rosso e il nero con il nero. Far funzionare il gel a una tensione costante di 110 volt fino a quando il colorante raggiunge una posizione definita.

Normalmente, per circa 70 minuti. Dopo l'elettroforesi, aprire la valvola e scaricare il tampone dalla camera superiore in un grande becher. Staccare i morsetti laterali e rimuovere la piastra dall'apparecchio.

Quindi utilizzare una spatola per separare accuratamente la lastra di vetro dentellata lungo un lato e assicurarsi che il gel rimanga attaccato all'altra lastra di vetro rivestita con Bind-silano. Successivamente, preparare un litro di soluzione impregnante fresca sciogliendo 1,5 grammi di nitrato d'argento in un litro di acqua distillata. Quindi preparare un litro di soluzione di sviluppo fresca sciogliendo 10 grammi di idrossido di sodio in 900 millilitri di acqua distillata.

Aggiungere un millilitro di formaldeide al 37% e utilizzare acqua distillata per regolare un volume finale di un litro. Con abbondante acqua distillata, sciacquare accuratamente il gel e la lastra di vetro per rimuovere il tampone per elettroforesi. Quindi posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto in un vassoio di plastica e immergere il gel in un litro di soluzione impregnante.

Agitare delicatamente il vassoio su uno shaker a 60 giri/min per tre o quattro minuti. Trasferire la piastra dalla soluzione impregnante in un altro vassoio. Quindi utilizzare abbondante acqua distillata per sciacquare la soluzione impregnante residua dalla superficie della piastra e il gel due volte per tre o cinque secondi ciascuno.

La fase di lavaggio del gel dopo l'impregnazione è fondamentale. Un lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta della soluzione impregnante. E il risultato è uno sfondo scuro.

Posiziona il posto con il gel rivolto verso l'alto in un altro vassoio. Immergere la piastra in un litro di soluzione di sviluppo, quindi agitare delicatamente la vaschetta a 50 giri/min per circa tre minuti. Monitorare l'aspetto dei frammenti di DNA e arrestare lo sviluppo quando si osserva il rapporto più alto tra il segnale dei frammenti di DNA e il rumore di fondo.

Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passo fondamentale. Lo sviluppo eccessivo può portare a uno sfondo marrone scuro con un'immagine a basso contrasto di frammenti di DNA. Sciacquare due volte la piastra e il gel con abbondante acqua distillata e utilizzare carta velina per asciugare la piastra in gel.

Quindi utilizzare uno scanner e il software appropriato per scansionare il gel a 300 DPI e regolare la luminosità e il contrasto per ottenere una chiara visualizzazione delle bande di DNA. Infine, segna il modello di bande dei marcatori SSR in base alle dimensioni dei frammenti di DNA nell'immagine. Gli ampliconi PCR qui presentati sono stati prodotti utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in cavolo cinese e tabacco in fiore.

Dopo l'elettroforesi, i gel di poliacrilammide sono stati colorati utilizzando il protocollo di colorazione con argento dimostrato in questo video. Che ha rilevato in modo inequivocabile i modelli di bande dei marcatori SSR. Per confrontare l'efficienza di rilevamento di diversi protocolli di colorazione dell'argento, i prodotti PCR dei marcatori SSR sono stati separati utilizzando PAGE e visualizzati utilizzando cinque protocolli di colorazione dell'argento pubblicati e un sesto metodo dimostrato in questo video.

Il protocollo qui dimostrato aveva il rumore di fondo più basso e il più alto contrasto di frammenti di DNA in modo tale da produrre la massima nitidezza dell'immagine. Dei sei protocolli testati, il metodo qui dimostrato richiede il minor tempo possibile e il minor numero di reagenti chimici e fasi di processo. Infine, questa figura mostra la sensibilità del protocollo misurata utilizzando una diluizione seriale di un marcatore di DNA da 50 a 2000 bp su un gel di poliacrilammide non denaturante da 10 nanogrammi per banda nella corsia uno a 9,8 picogrammi per banda di DNA nella corsia 11.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prevenire la contaminazione incrociata delle soluzioni di impregnazione e sviluppo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per genotipizzare rapidamente i marcatori SSR.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare in modo semplice ed efficiente i marcatori SSR in un gel di poliacrilammide non denaturante utilizzando la colorazione con argento. Non dimenticare che lavorare con reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come i guanti, dovrebbero essere sempre indossate durante l'esecuzione di questa procedura.