Name: Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri un metodo di colorazione argentea ottimizzato per la rilevazione rapida dei marcatori SSR su gel di poliacrilammide non denaturante. Questa tecnica semplice ed economica richiede solo sette minuti e garantisce immagini di alta qualità senza rumore di fondo.

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Questo lavoro è stato finanziato il Natural Science Foundation di Guangdong (2015A030313500), la piattaforma di ricerca di Key International Cooperative provinciali e i principali scientifico ricerca progetto di Guangdong istruzione superiore (2015KGJHZ015), la scienza e Piano per le tecnologie di Guangdong amministrazione del monopolio del tabacco (201403, 201705), la scienza e la tecnologia piano di Guangdong, Cina (2016B020201001), il progetto di formazione nazionale di innovazione per gli studenti (201711078001). Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Ministero dell'agricoltura. USDA è un fornitore di pari opportunità e il datore di lavoro.

1. preparazione dei prodotti PCR di marcatori SSR
<ol><li>Preparare tutti i prodotti chimici e reagenti per reazioni di PCR, compreso il modello DNA (30 ng / µ l), 2 × mix PCR master (contenente 2 × PCR tampone, 0,4 mM di ogni dNTP, 3mm di MgCl2, 0,1 U / µ l di Taq DNA polimerasi e coloranti), 10 µM di ciascuno avanti e indietro gli iniettori e acqua distillata o deionizzata (dH2O). Nota: I marcatori SSR utilizzati nel presente studio sono stati PT51333 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e sequenza inversa primer: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' e invertire la sequenza primer: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') per il tabacco e CX-43 (trasmettere la sequenza primer: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' e reverse primer sequenza: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') e CX-157 (trasmettere la sequenza primer: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e invertire la sequenza primer: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') per fioritura cavolo cinese.</li>
	<li>Preparare 10 µ l di miscela di PCR per l'amplificazione aggiungendo 2 µ l di DNA campione, 5 µ l di 2 × PCR master mix, 0,2 µ l di ogni primer forward e reverse primer e 2,6 µ l di dH2O.</li>
	<li>Eseguire la reazione di amplificazione di PCR in un termociclatore con un passo iniziale di 94 ° C per 5 min, seguite da 38 cicli di 45 s a 94 ° C per denaturazione, 45 s a 55 ° C per la ricottura di primer e 1 min a 72 ° C per estensione e un passo di estensione finale di 10 min a 72 ° C; quindi memorizzare i prodotti di PCR a 4 ° C per un uso successivo.</li>
</ol>2. preparazione di soluzioni per poliacrilammide gel Casting
<ol><li>Preparare 1 L di buffer TBE 5 × 54 g di Tris base e 27,5 g di acido borico in dH2O di dissoluzione, aggiungendo 20 mL di EDTA 0.5 M (pH 8.0) e regolando la soluzione ad un volume finale di 1, 000 mL con dH2O. Nota: Tampone TBE può essere conservato a temperatura ambiente per mesi.</li>
	<li>Preparare 2 L di buffer di TBE 0,5 × aggiungendo 200 mL di buffer TBE × 5 dH2O ad un volume finale di 2 L e conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare una soluzione al 6% non-denaturante del gel di poliacrilammide sciogliendo 29 g di biologia molecolare grado acrilamide e 1 g di biologia molecolare grado N, N'-methylenebisacrylamide nel buffer TBE × 0,5 ad un volume finale di 500 mL. Coprire il flacone della soluzione con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per un uso successivo. Attenzione: Acrilamide è considerato una potente neurotossina e deve essere maneggiato con cura. Indossare sempre i guanti quando pesatura polveri e soluzioni per la movimentazione che lo contengono.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 20% ammonio persolfato (APS) sciogliendo 2 g di APS con dH2O ad un volume finale di 10 mL. Esso può essere conservato a-20 ° C per mesi. Nota: Per comodità, 10 mL di soluzione al 20% APS può essere aliquotati in 1,5 mL o 2 mL di provette da centrifuga per conservazione a-20 ° C. Scongelare e mescolare bene prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare una soluzione diluita di bind-Silano sciogliendo 3 µ l di binding-Silano in 0,997 mL di etanolo al 95% contenente 0.5% di acido acetico. Esso può essere conservato a 4 ° C per settimane. Attenzione: Bind-Silano è tossico, indossare guanti per maneggiare la soluzione e mantenere la camera ventilata.</li>
</ol>3. preparazione di gel di poliacrilammide per elettroforesi
<ol><li>Lavare una serie di lastre di vetro e distanziali con detergente in acqua di rubinetto, seguito da un risciacquo completo con dH2O. aria a secco le piastre impostandoli in una piastra stendino.</li>
	<li>Disperdere 1 mL di soluzione di bind-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro rettangolare e secco per 5 min. Nota: Se la soluzione di bind-silano non si diffonde uniformemente sulla superficie della piastra, il gel può essere staccata durante la colorazione e provocare un effetto di colorazione insoddisfacente.</li>
	<li>1 mL di respingere-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro dentellata con un tampone di disperdere, pulire respingere-Silano in eccesso con una velina e aria secca per 5 min. Nota: Se il repellere-silano non uniformemente rivestire la superficie della lastra di vetro, ciò potrebbe danneggiare il gel spelando parzialmente.</li>
	<li>Montare le lastre di vetro con distanziali con la piastra dentata sulla parte superiore ed entrambi i lati dell'Assemblea con casting morsetti di serraggio.</li>
	<li>Versare la quantità appropriata (40 mL) di soluzione non-denaturante gel di poliacrilammide al 6% in un bicchiere per il set di piatto di larghezza di 33 cm × 10 cm di altezza e distanziale spessore 1,5 mm, aggiungere 20 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 200 µLfresh 20% APS e mescolare delicatamente. Nota: La quantità appropriata (40 mL) di soluzione di gel è stata calcolata dal volume interno delle due piastre con uno spessore di distanziali (30 cm × 8,5 cm × 0.15 cm). Per quanto riguarda la quantità di TEMED e APS per la polimerizzazione del gel, c'è in un formato standard della soluzione di gel di TEMED e APS basato sul riferimento17. La soluzione di gel sopra descritta è conservata a 4° C. Se la soluzione di gel è conservato a temperatura ambiente, 20 µ l di TEMED e 100 µ l del 20% APS deve essere utilizzato. Mescolare delicatamente la miscela di soluzione di gel con un bastoncino di vetro per evitare bolle d'aria nella soluzione.</li>
	<li>Versare la soluzione immediatamente e accuratamente nelle lastre di vetro assemblate lungo il bordo della piastra dentellata, riempire lo spazio quasi al top e inserire il pettine. Aggiungere un piccolo volume di soluzione di gel sopra il pettine. Nota: Tenere le piastre di vetro orizzontale per impedire la fuoriuscita del gel. Rimuovere tutte le bolle con un gancio di bolla, se necessario.</li>
	<li>Lasciare che il gel da impostare per 30 min a temperatura ambiente. Nota: Il tempo di polimerizzazione cambiano le temperature della soluzione di gel e ambiente.</li>
	<li>Dopo il gel è completamente polimerizzazione, rimuovere i morsetti di colata e posizionare la piastra impostata nella centralina di carro armato di elettroforesi con il piatto dentellato rivolto verso il serbatoio tampone superiore e usate grande fascette per fissare la piastra con impostazione in serbatoio.</li>
	<li>Versare 1 L di 0,5 × TBE buffer in ciascuna della tomaia e le camere inferiori. Togliere il pettine e lavare abbondantemente tutti i pozzetti con buffer utilizzando una pipetta o siringa. Nota: Assicurarsi che il sandwich di gel nella parte inferiore della piastra è completamente imbevuto nel buffer senza eventuali bolle.</li>
</ol>4. running gel
<ol><li>Caricare circa 1 µ l di prodotto di PCR in ogni pozzetto del gel di poliacrilammide. Caricare una scaletta di formato di DNA ad entrambi i lati del gel insieme con i campioni dei prodotti di PCR. Fissare il coperchio di sicurezza per l'alloggiamento superiore del buffer.</li>
	<li>Collegare i cavi dell'alimentazione, di corrispondenza il codice colore rosso con rosso e nero al nero. Esegua il gel a una tensione costante di 110 V, fino a quando il colorante raggiunge una posizione definita, normalmente per ~ 70 min. Nota: Il tempo di tensione e corrente può essere regolato in base alle dimensioni dei prodotti di PCR.</li>
</ol>5. colorazione per la rilevazione di marcatori SSR in un Non-poliacrilammide Gel argento
<ol><li>Dopo l'elettroforesi, svuotare il buffer dalla camera superiore in un grande bicchiere tramite la valvola. Staccare i morsetti laterali, rimuovere le piastre dall'apparecchio, attentamente separare la lastra di vetro dentellata lungo un lato con una spatola e assicurarsi che i gel rimane attaccato a altra piastra di vetro rivestito con bind silano.</li>
	<li>1 L di soluzione di impregnazione fresco sciogliendo 1,5 g di AgNO3 in 1 L di dH2O. preparare 1 L di soluzione di sviluppo fresco sciogliendo 10 g di NaOH in 900 mL di dH2O, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% e regolare ad un volume finale di 1 L utilizzo dH2O. Nota: Indossare guanti e gestire i prodotti chimici e le soluzioni con cura sopra. Non è necessario mantenere le soluzioni e i passaggi corrispondenti con le soluzioni al buio.</li>
	<li>Risciacquare accuratamente la piastra gel e vetro con ampio dH2O per rimuovere il tampone di elettroforesi, quindi posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto su un vassoio di plastica e immergere il gel in 1 L di soluzione di impregnazione. Reinserire il vassoio su un agitatore.</li>
	<li>Agitare delicatamente il vassoio a 60 giri/min per 3-4 min. Nota: Tempo di agitazione può essere regolata secondo lo spessore del gel e la concentrazione di nitrato di argento nella soluzione di impregnazione.</li>
	<li>Spostare la piastra dalla soluzione di impregnazione e metterlo su un altro vassoio. Risciacquare la soluzione residua impregnazione fuori dalla superficie della piastra e il gel utilizzando un ampio dH2O due volte per 3-5 s ciascuno.</li>
	<li>Posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto su un altro vassoio, immergere la piastra in 1 L di soluzione di sviluppo, quindi agitare delicatamente il vassoio a 50 giri/min per un minimo di ~ 3 Monitor l'aspetto del DNA frammenti e fermare lo sviluppo quando il più alto rapporto del segnale del DNA frammenti al rumore di fondo è osservato (questo passaggio prende ~ 3 min).</li>
	<li>Sciacquare la piastra e il gel con un ampio dH2O due volte e asciugare la lastra di gel con una velina.</li>
	<li>Scansione il gel utilizzando uno scanner appropriato. Una risoluzione di 300 dpi dà una chiara visualizzazione dei frammenti del DNA. Il gel può essere fotografato anche utilizzando una macchina fotografica.</li>
	<li>Il disegno a strisce di marcatori SSR possa essere segnato basato su frammenti di DNA nell'immagine.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+GL+%22Plant+breeding+from+laboratories+to+fields%22">Plant breeding from laboratories to fields</a>. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).</li>
<li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/1360138596868981">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li>
<li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genic+microsatellite+markers+in+plants%3A+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li>
<li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSR+markers%3A+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+%28Myrtaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li>
<li>Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li>
<li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li>
<li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).</li>
<li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li>
<li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li>
<li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li>
<li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Data%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li>
<li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="https://scholars.opb.msu.edu/en/publications/a-low-cost-high-throughput-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sys-3">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li>
<li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il lavaggio del gel dopo l'impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l'efficienza colorazione d...

Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento1. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l'individuazione di genotipi eterozigoti2. Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economicamente importanti3,4.
I prodotti di PCR di marcatori SSR comunemente sono separati mediante elettroforesi dell'agarosi o gel di poliacrilammide e poi visualizzati con la macchiatura d'argento o sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio. Macchiatura d'argento di frammenti di DNA in gel di poliacrilammide è più sensibile rispetto al altri colorazione metodi5,6 ed è stato ampiamente utilizzata per rilevare i frammenti di DNA ad esempio SSR marcatori7.
Come molte tecniche di laboratorio biologico, macchiatura d'argento del gel di poliacrilammide è costantemente migliorato dal suo primo segnalato come una tecnica di visualizzazione frammento nel 19798. La tecnica è stata inizialmente modificata per il rilevamento dei frammenti del DNA da Bassam et al. 6 nel 1991 e poi migliorato da Sanguinetti e colleghe9 nel 1994. Il metodo è stato ulteriormente ottimizzato nelle ultime pochi decenni6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Tuttavia, la maggior parte di queste versioni aggiornate dei protocolli hanno ancora alcuni svantaggi, come alta richiesta tecnica e lungo tempo per la fissazione di elaborazione e montaggio6, che limitano l'applicazione di questi protocolli7, 11. Un protocollo ottimale che combina basso costo ad alta efficienza di rilevazione del frammento del DNA è urgente per applicazioni di routine d'argento che macchia nella ricerca biologica.
Inoltre, gel di poliacrilammide può essere diviso in gel di poliacrilammide denaturante e non-denaturante, ed entrambi possono essere utilizzati per l'individuazione di marcatori SSR usando l'argento che macchia il metodo. L'effetto e la risoluzione delle quali non differiscono significativamente, ma non-denaturante del gel di poliacrilammide sono più facile da processo e prendere meno tempo16.
Sulla base della precedente ricerca15, lo scopo di questo studio è di descrivere un argento ottimizzato protocollo dettagliatamente per rilevazione veloce, facile e basso costo di SSR markers in un non-denaturante del gel di poliacrilammide di colorazione.

<table><tbody><tr><td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, Cina</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>#170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 Marcatore DNA</td><td>Takara Bio Inc., Giappone</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Cina</td><td>#77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Cina</td><td>#10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-NA2</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, Cina</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Cina</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metilene-bis-acrilammide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Cina#</td><td>110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Cina</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr>Fabbrica di reagenti chimici per <td>persolfato di</td><td>ammonio Guangzhou, Cina</td><td>#7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-silano</td><td>Solarbio Pechino, Cina</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Sinopharm reagente chimico Beijing Co., Ltd, Cina</td><td>#7761-88-8</td><td></td></tr><tr>Fabbrica di <td>reagenti chimici Formaldeide Tianjin DaMao, Cina</td><td>#50-00-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fabbrica</td> di <td>reagenti chimici NaOH Guangzhou, Cina</td><td>#1310-73-2</td><td></td></tr><tr>Fabbrica di <td>reagenti chimici di</td> <td>Canton per acido acetico</td>, Cina<td>#64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fabbrica di reagenti chimici Tianjin DaMao, Cina</td><td>#497-19-8</td><td></td></tr><tr>Fabbrica di reagenti chimici<td>per etanolo</td><td>Guangzhou, Cina</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, Cina</td><td>#7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3.5H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Cina#</td><td>10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome black T (EBT)</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di plastica</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,</td> <td>China-TS-1</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu,</td> <td>China-BenQ</td> M800 Scanner BenQ, China-DYY-6C <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory,</td> <td>China-High</td><td></td></tr> <tr><td>in tutti i sistemi di gel verticali, JY-SCZF</td><td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Cina</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori ssr utilizzando un non-denaturante del gel di poliacrilammide

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d'argento è un metodo ampiamente usato per l'individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d'argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l'efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d'argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.

Gli ampliconi PCR sono state prodotte utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in fioritura cavolo cinese e tabacco. Dopo l'elettroforesi, il gel di poliacrilammide erano macchiate usando l'argento di cui sopra che macchia protocollo, che senza ambiguità rilevate i disegni a strisce di marcatori SSR (Figura 1).
Per confrontare l'efficienza di rivelazione d'argento diverso protocolli di col...

Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell'analisi genetica.

Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre un metodo di colorazione dell'argento ottimizzato per un rilevamento rapido, facile e a basso costo dei marcatori SSR nei gel di poliacrilammide non denaturanti. La rapida genotipizzazione dei marcatori SSR può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca genetica e delle applicazioni, come l'analisi della diversità genetica e la selezione assistita da marcatori nei programmi di selezione molecolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facile da eseguire, richiede meno tempo e utilizza meno reagenti chimici rispetto ad altri protocolli per il rilevamento dei marcatori SSR.Questo metodo evita il fissaggio, l'arresto e le diverse fasi di lavaggio presenti nei protocolli convenzionali. E richiede solo le due fasi principali di impregnazione e sviluppo. Utilizzando questo protocollo è possibile produrre immagini nitide in quanto non è possibile generare rumore di fondo per il rilevamento inequivocabile dei modelli di bande SSR.Con questa tecnica è possibile eseguire lo screening di circa 800 campioni di DNA al giorno, che è stata utilizzata con successo nella ricerca sul tabacco e sul cavol

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Dopo la separazione con metodi elettroforetica, le proteine ​​in un gel può essere rilevato da diversi metodi di colorazione. La colorazione delle proteine ​​con Coomassie Blue, colorazione Silver, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sono dimostrate in questo video.

Colorazione proteine ​​in gel

Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda...

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

In questo video, dimostriamo un metodo di colorazione dell'argento di gel di poliacrilammide per la visualizzazione della proteina totale utilizzando sonde fluorogeniche.

Colorazione fluorescente dell'argento: una tecnica per visualizzare le proteine totali nei gel di poliacrilammide

In questo video, dimostriamo una procedura per la colorazione combinata del blu di Alcian e dell'argento di frammenti di oligosaccaridi di glicosaminoglicani solfatati. Questa tecnica di colorazione combinata amplifica significativamente le bande di polimeri di glicosaminoglicani di diverse lunghezze nei gel di poliacrilammide.

Colorazione con argento di glicosaminoglicani solfatati: un metodo di colorazione per la visualizzazione di glicosaminoglicani solfatati in gel di poliacrilammide

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Analisi del contenuto intestinale più comune di macroinvertebrati sono visive. Che richiedono intensa conoscenza diversità morfologica degli organismi di preda, essi perdere morbido corposo preda e, grazie alla forte comminuzione della preda, sono quasi impossibile per alcuni organismi, tra cui anfipodi. Forniamo dettagliati, romanzo approcci genetici per macroinvertebrati preda identificazione nella dieta di anfipodi.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag+-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.

Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Questo rapporto descrive le tecniche per isolare e purificare i glicosaminoglicani solfati (GAG) da campioni biologici e un approccio di elettroforesi su gel di poliacrilammide per approssimarne le dimensioni. I GAG contribuiscono alla struttura dei tessuti e influenzano i processi di segnalazione attraverso l'interazione elettrostatica con le proteine. La lunghezza del polimero GAG contribuisce alla loro affinità di legame per i ligandi affini.

Rilevazione di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione dell'argento

Scopri un metodo di colorazione argentea ottimizzato per la rilevazione rapida dei marcatori SSR su gel di poliacrilammide non denaturante. Questa tecnica semplice ed economica richiede solo sette minuti e garantisce immagini di alta qualità senza rumore di fondo.

Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide (Video) | JoVE Journal

Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

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