Generazione e l'isolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con Karyotypes complessi

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice per generare e isolare cellule con arresto del ciclo cellulare con cariotipi complessi. Questo metodo può fornire risposte a domande chiave nel campo della ricerca sulle aneuploidie, come l'interazione del sistema immunitario con le cellule aneuploidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genera una popolazione cellulare che ospita solo cariotipi complessi.

Per iniziare la sincronizzazione delle cellule hTERT RPE-1, utilizzare cellule appena scongelate e distribuirle in una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri utilizzando otto millilitri di terreno di crescita standard. Quindi, usa un emocitometro per determinare il numero di cellule. Quindi, incubare le cellule durante la notte.

Il giorno seguente, sostituire il terreno di coltura standard con un terreno contenente cinque millimolari di timidina. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius per sincronizzare le cellule al bordo G1S. Dopo 24 ore, lavare le celle tre volte con PBS.

Quindi, aggiungere un terreno di coltura standard alle cellule lavate e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Per prima cosa, lavare le celle con 10 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un terreno contenente 500 nanomolari di inibitore Mps1 reversina.

Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le celle tre volte con PBS. Quindi, aggiungere il terreno di coltura standard e rimettere le piastre nell'incubatrice.

Circa 72 ore dopo la prima mitosi aberrante, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un terreno contenente 330 nanomolari di nocodazolo. Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, aspirare il terreno nocodazolico. Quindi aggiungere tre millilitri di PBS al piatto e picchiettare il lato del piatto per scrollarsi di dosso le cellule mitotiche. Ruotare la piastra tra un tocco e l'altro per consentire una rimozione uniforme delle cellule mitotiche.

Dopo lo shake-off iniziale, aspirare il liquido che ha aderito al coperchio e al bordo della piastra. Quindi, controllare la lastra al microscopio con un ingrandimento di 10X. Quindi lavare le cellule con cinque millilitri di PBS.

Quindi, aggiungere il terreno contenente 330 nanomolari di nocodazolo. Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius. Dopo lo shake-off finale, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura standard.

Incubare le cellule per 12-24 ore a 37 gradi Celsius prima di eseguire i saggi. Le cellule che rimangono sulla piastra sono indicate come cellule arrestate con cariotipo complesso o cellule ArCK. Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare le cellule ArCK e diverse caratteristiche specifiche delle cellule ArCK vengono analizzate per confermarne l'isolamento.

Le cellule ArCK mostrano livelli aumentati di inibitori del ciclo cellulare p53, p21 e p16 nell'analisi immunoblot, mentre le cellule euploidi e aneuploidi non lo fanno. Inoltre, le cellule ArCK sono positive per la beta-galattosidasi associata alla senescenza, che si colora di blu-verde, mentre le cellule di controllo euploidi non lo sono. I grafici di segmentazione rivelano che le cellule ArCK sono aneuploidi, caratterizzate da guadagni cromosomici multipli e casuali e perdite cromosomiche.

I grafici di segmentazione mostrano il numero di copie di singole cellule dal cromosoma uno a X, rispetto a una scala del log di riferimento euploide due. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi di rimuovere tutte le cellule mitotiche durante ogni scuotimento. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi delle citochine.

Questi saggi aiuteranno a rispondere a ulteriori domande, come la capacità delle cellule ArCK di interagire con le cellule del sistema immunitario. Non dimenticare che il nocodazolo è pericoloso. Durante l'utilizzo di questo reagente devono essere indossati dispositivi di protezione individuale adeguati.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per isolare in modo efficiente le cellule ArCK in vitro. Questa procedura può essere eseguita in sette giorni se eseguita correttamente.