Name: Generazione e lisolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con Karyotypes complessi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Scopri un metodo per isolare cellule ArCK con cariotipi complessi arrestate nel ciclo cellulare. Questa tecnica utilizza sincronizzazione con timidina e nocodazolo per studiare l'aneuploidia e le interazioni con il sistema immunitario.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal sostegno Istituto Koch (nucleo) Grant P30-CA 14051 dal National Cancer Institute, dal National Institutes of salute Grant (CA206157-22 e GM118066) e Curt marmo Cancer Research Fund di Angelika Amon. Angelika Amon è anche un investigatore di Howard Hughes Medical Institute e Glenn Foundation per la ricerca biomedica. S. S. è stata sostenuta dall'americano italiano cancro Foundation (AICF), di una borsa di studio nella ricerca sul cancro da azioni Marie Curie e l'associazione italiana per la ricerca cancro (AIRC) e di una borsa di ricerca cancro quinquennali KI. E.M. è stato sostenuto da una borsa di studio da Howard Hughes Medical Institute.

Condizione di cultura
Linea cellulare RPE-1 hTERT è stato coltivato in per volta Eagle Medium di Dulbecco (Tabella materiali) completate con 10% siero bovino fetale, 2 mM L-Glutammina e 100 U/ml di penicillina/streptomicina. Le cellule sono state incubate a 37 ° C con 5% CO2 in un ambiente umidificato. Il protocollo descritto di seguito è stato sviluppato utilizzando piatti 10 cm e tutti i dati tecnici riportati si riferiscono a quei piatti. Se utilizzando diversi piatti, scala verso l'alto o verso il basso di conseguenza.
1. sincronizzazione delle cellule RPE-1
<ol><li>Utilizzare appena scongelate cellule che non hanno subito più di 15 passaggi per tutti gli esperimenti. Il giorno 1, scongelare e dispensare ~2.5 - 5,0 x 10 celle di hTERT5 RPE-1 in un piatto di coltura del tessuto di 10 cm. Aggiungere 8 mL di terreno di coltura standard e incubare per una notte. Determinare il numero di cellulare utilizzando un contatore di cella standard (ad esempio un emocitometro). Nota: Densità cellulare si riferiscono a condizioni di crescita delle cellule RPE-1. Condizioni di crescita potrebbero variare tra diverse linee cellulari; si consiglia di regolare loro conseguenza.</li>
	<li>Il giorno 2, è necessario sincronizzare celle al bordo di G1/S ad aspirazione normale crescita medio e aggiungendo mezzo 8 mL contenente timidina 5 mM. Nota: Timidina concentrazione e durata del trattamento può variare in diverse linee cellulari. Si consiglia di eseguire esperimenti pilota per determinare le migliori condizioni per le righe di cella essere testato.</li>
	<li>Il giorno 3, 24 h dopo l'aggiunta della timidina medio (punto 1.2), rilasciare dal blocco di timidina aspirando medio e lavando le cellule tre volte con PBS 1X. Aggiungere 8 mL di medium di crescita regolare e restituire le piastre nell'incubatore.</li>
</ol>2. generazione di Aneuploid cellule tramite interferenza con l'attività della chinasi mitotica Mps1
<ol><li>Il giorno 3, 6 h dopo il rilascio dal blocco di timidina (passo 1.3; si tratta di circa 3-6 h prima celle immettere mitosi), aspirare medio, lavare una volta con PBS 1X e sostituire con mezzo contenente 500 nM reversine (l'inibitore Mps1). Nota: Le cellule RPE-1 immettere mitosi 9-12 h dopo timidina sbiaditura10,11. Tuttavia, la cinetica del ciclo cellulare variano tra differenti linee cellulari. Pertanto, è cruciale per determinare quelli cinetica in esperimenti pilota eseguendo analisi del ciclo cellulare di metodi consolidati (ad es., misurando l'analisi del DNA contenuto via FACS). Inoltre, la concentrazione di lavoro ottimale di Mps1 inibitore può variare tra linee cellulari. Precedenti esperimenti usando le cellule RPE1 hanno avuto successo usando reversine ad una concentrazione di lavoro di 500 nM10,11,12. Si consiglia di eseguire esperimenti pilota per determinare la concentrazione ottimale per la linea cellulare essere testato.</li>
	<li>Il giorno 4, 12 h dopo il trattamento reversine (circa 6 h dopo erano cellule in mitosi), aspirare reversine medio e lavare le cellule tre volte con PBS 1X. Aggiungere 8 mL di terreno di crescita regolare alla piastra e restituire le cellule nell'incubatore.</li>
</ol>3. rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta e di arricchimento della popolazione ArCK
<ol><li>Il giorno 6, circa 72 h dopo celle immettere la prima mitosi (passaggio 2.2; si tratta di circa 66 h dopo reversine wash-out, che corrisponde a circa 2-3 cicli cellulari), aspirare medio, lavare una volta con PBS 1X e sostituire con mezzo contenente 300 nM nocodazole. Nota: Lavoro recente ha dimostrato che cellule RPE-1 che harboring i karyotypes aneuploidi sono genomically instabile e arrestano la loro proliferazione circa 2-3 cicli cellulari dopo i primi10di mitosi difettoso. Tuttavia, questa cinetica potrebbe variare tra diverse linee cellulari. Di conseguenza, è fondamentale eseguire esperimenti pilota per determinare il corretto timing per la rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta.</li>
	<li>Il giorno 7, 12 h dopo il trattamento nocodazole, aspirare medio e aggiungere 3 mL di 1X PBS alla piastra. Scrollarsi di dosso le cellule mitotiche toccando il lato della piastra. Ruotare la piastra tra ogni rubinetto per consentire anche la rimozione di cellule mitotiche.</li>
	<li>Per garantire la completa rimozione di cellule mitotiche, ripetere il processo di shake-off per più turni (3 - 5 volte consigliati), aspirando e aggiungere 3 mL di 1X PBS tra ogni round.</li>
	<li>Dopo shake-off, delicatamente aspirare tutto il liquido che ha aderito il coperchio o il bordo della piastra. Brevemente, controllare la piastra con un microscopio a ingrandimento 10x. Assicurare che siano osservate alcune cellule mitotiche. Se più di cinque cellule mitotiche sono visti sotto obiettivo 10x, ripetere un altro giro di shake-off. Nota: Cellule mitotiche sembrerebbero arrotondate e possono essere parzialmente disconnesso dopo shake-off. È fondamentale garantire la completa rimozione di cellule mitotiche prima esposizione delle cellule al turno successivo del trattamento nocodazole. Non farlo può portare alla morte cellulare mitotica e/o causare la generazione di cellule tetraploidi.</li>
	<li>Dopo shake-off finale, lavare le cellule una volta con 5 mL di PBS 1X. Aggiungere 8 mL di terreno contenente 330 nM nocodazole nella piastra ed incubare per 12 h.</li>
	<li>Ripetere nocodazole trattamento/shake-off (passaggi 3.1-3.5) ogni 12 h fino a nessun cellule mitotic sono state osservate dopo incubazione. Di solito, sono consigliati 4-5 cicli di trattamento/shake-off. Nota: Le informazioni qui fornite si riferiscono alle cellule RPE-1. Il numero di giri del trattamento/shake-off potrebbe variare tra diverse linee cellulari. Per evitare l'esposizione prolungata e inutile a nocodazole è cruciale per determinare accuratamente, in un esperimento pilota, il numero di giri richiesto per rimozione completa ed efficiente di cellule aneuploidi in bicicletta.</li>
	<li>Dopo 4-5 giri di nocodazole trattamento/shake-off (passaggi 3.1-3.6), aggiungere 10 mL di medium di crescita regolare e incubare. Consentire alle cellule di riposare per 12-24 h prima dell'uso futuro di manipolazione o saggio. Nota: Dopo shake-off finale, cellule residue sulla piastra sono ciclo cellulare arrestato e, come recentemente dimostrato10, harbor karyotypes complessi. Queste cellule si riferiscono a come cellule di ArCK (arrestato con Karyotype complesso). Si consiglia di effettuare saggi sulle popolazioni di ArCK entro una settimana di isolamento.</li>
	<li>Facoltativamente, per valutare la percentuale di cellule arrestate con karyotypes complessi, raccogliere e contare le celle da ogni shake-off utilizzando un contatore di cella standard.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Figura 1: nel complesso schematico del metodo utilizzato per generare e isolare cellule aneuploidi con karyotype complesso (ArCK) e immagini rappresentative. (A) schematico di ArCK cellule protocollo di isolamento e di generazione. (B) immagini rappresentative delle cellule di hTERT RPE-1 in ogni fase del trattamento. L'ultimo pannello (evidenziato in rosso) rappresenta le cellule isolate di ArCK. Scala bar 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. caratterizzazione della popolazione ArCK
<ol><li>Confermare successo isolamento della popolazione ArCK eseguendo i seguenti saggi.<ol>
<li>Asini della beta-galattosidasi che macchia (l'indicatore della senescenza) utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi tabella materiali).</li>
		<li>Misurare la secrezione di citochine pro-infiammatorie, quali CCL2, impiegando Kit commercialmente disponibili (Vedi tabella materiali).</li>
		<li>Confermare i livelli aumentati del ciclo cellulare inibitori p53, p21, p16 mediante Western Blot. Nota: Per controllare correttamente queste analisi, ArCK popolazioni devono essere confrontati con cellule ciclanti sia euploide e aneuploidi. Il primo è basso passaggio, hTERT RPE-1 selvaggio-tipo cellule in crescita esponenziale. Quest'ultimo può essere ottenuto inducendo mis-segregazione del cromosoma in RPE-1 hTERT e raccolta delle cellule 72 h dopo la prima mitosi aberrante. A tale scopo, seguire il protocollo descritto sopra dal passaggio 1.1 e raccolto le cellule destra prima del primo trattamento nocodazole (punto 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire il sequenziamento di singola cellula per valutare il karyotype delle cellule arrestati. Nota: Il sequenziamento di cella singola è un metodo ben consolidato per determinare cambiamenti cromosomici e sub-cromosomici fra una popolazione di cellule al livello unicellulare13. Procedure dettagliate per come eseguire la sequenziazione di singola cellula possono essere trovate altrove10.</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li>
<li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress%2C+senescence+and+cell+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li>
<li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668(2015).</li>
<li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754(2016).</li>
<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo nuovo metodo per generare e arricchire di cellule arrestato con karyotypes complessi (ArCK) consente lo studio delle cellule che hanno più del cromosoma guadagni o perdite e smettono di dividersi. Il metodo setup è stato progettato per facilitare l'isolamento di cellule ArCK in modo rapido e affidabile.
La fase più critica in questo test è rigorosamente il controllo timeline di trattamento farmacologico e, soprattutto, la rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta. Per risultati ottimali, i tempi di trattamento nocodazole e shake-off sono di particolare importanza per garantire che le cellule ciclanti sono rimosse dalla piastra mentre sono ancora arrotondati e mitotica, impedendo la possibilità di morte cellulare mitotica o slittamento in G1, potenzialmente creando una popolazione tetraploide. Non è consigliabile che i tempi di shake-off devia più di due ore dall'incubazione consigliato 12-h nocodazole.
Gli studi futuri su ArCK cellule hanno il potenziale per facilitare una più profonda comprensione di come complesso karyotypes influisce sulla fisiologia cellulare. In particolare, uno studio recente ha dimostrato che le cellule del sistema immunitario sono in grado di interagire con e grilletto clearance immuni di ArCK cellule10. Il metodo qui descritto fornisce un ottimo punto di partenza per ulteriore caratterizzazione delle cellule di ArCK, compreso il chiarimento dei meccanismi molecolari che liquidazione immuni in cellule non trasformate e lo studio della trasformazione come oncogeni può ignorare questo meccanismo di sorveglianza, una questione cruciale nel campo14,15.

Errori nel processo di segregazione del cromosoma causare aneuploide, una condizione caratterizzata da un numero di cromosoma che non è un multiplo del aploide complemento1,2,3,4. Aneuploid karyotypes stress di replica di trigger che genera ulteriore instabilità genomica5,6,7,8,9,10, aumenta complessità del cariotipo e in ultima analisi porta ad arresto del ciclo cellulare di una sottopopolazione di cellule10. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di generare e separare tali una sottopopolazione dal riciclaggio delle cellule. Utilizzando tecniche di coltura del tessuto economico, questo protocollo facilita l'isolamento e la caratterizzazione di cellule aneuploidi ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi. Queste cellule sono denominate cellule ArCK (arrestato con Karyotype complesso) e le loro controparti in bicicletta euploide come controlli.
Questo protocollo è il primo ad essere istituito a tale scopo e permette l'isolamento e un ulteriore approfondimento delle linee di ArCK inclusi, ma non limitato a, loro indotta senescenza e il fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP), loro pro-infiammatorie caratteristiche e la loro capacità di impegnarsi con le cellule immunitarie. Il metodo presentato qui è stato sviluppato in cellule umane immortalizzate, non trasformate, ma non è ancora stato testato nelle linee del cancro. Alcune cellule trasformate possono essere insensibili all'arresto del ciclo cellulare a causa della soppressione di uno o più percorsi; di conseguenza, ulteriore convalida deve essere eseguita in altre linee cellulari.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Aquila modificata media)&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 anticorpo</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Senescenza b-Galattosidasi Kit di colorazione</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler Kit array di citochine umane&nbsp;</td><td>R& Sistemi D</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione e l'isolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Mis-segregazione del cromosoma conduce ad aneuploide, una condizione in cui cellule del porto un numero cromosomico squilibrato. Parecchie linee di prova indicano fortemente che aneuploide innesca instabilità genomica, in ultima analisi, generare cellule con karyotypes complessi che arrestano la loro proliferazione. Isolamento e caratterizzazione di cellule che harboring i karyotypes complessi sono cruciali per studiare l'impatto di un numero di cromosoma squilibrato sulla fisiologia cellulare. Ad oggi, non sono stati stabiliti metodi per isolare in modo affidabile tali cellule aneuploidi. Questo documento fornisce un protocollo per l'arricchimento e l'analisi di cellule aneuploidi con karyotypes complessi utilizzando tecniche di coltura del tessuto standard, poco costoso. Questo protocollo può essere usato per analizzare le diverse caratteristiche di cellule aneuploidi con karyotypes complessi inclusi indotta senescenza-collegata di fenotipo secretivo, proprietà pro-infiammatorie e capacità di interagire con le cellule immunitarie. Perché le cellule tumorali spesso porto gli squilibri nel numero dei cromosomi, è fondamentale decifrare come aneuploide impatti fisiologia cellulare in cellule normali, con l'obiettivo finale di scoprire entrambi suoi pro - e anti - tumorigenic effetti.

Questo metodo utilizza un sistema di coltura di tessuti in vitro per isolare cellule aneuploidi con karyotypes complessi che arrestano la loro proliferazione. Questa popolazione viene riferita come celle di ArCK (arrestato con Karyotypes complessi). Figura 1A Mostra lo schema dell'esperimento. Cellule di hTERT ciclismo RPE-1 wild-type sono sincronizzate al bordo di G1/S con timidina e trattate con un inibitore di Mps1 per indurre mis-segregazione del cromosoma. Il nocodazole veleno dell'alberino è aggiunto alle cellule 72h dopo induzione di mis-segregazione del cromosoma. 12 h dopo il trattamento nocodazole, le cellule aneuploidi che sono ancora in grado di proliferare immettere mitosi e sono intrappolati in questa fase del ciclo cellulare a causa dell'interferenza con la polimerizzazione dei microtubuli. Questi intrappolato le cellule vengono poi rimossi facilmente dal delicato shake-off. Il processo di shake-off è ripetuta 3 - 5 volte per garantire la completa rimozione del riciclaggio delle cellule. Figura 1B Mostra le immagini rappresentative delle cellule RPE-1 in ogni fase del trattamento.
ArCK celle visualizzare i livelli aumentati di inibitori del ciclo cellulare, quali p53, p21 e p16 rispetto al euploide e aneuploid riciclaggio delle cellule, come mostrato nella Figura 2A. Inoltre, la Figura 2B Mostra positiva β-galattosidasi macchiatura in cellule di ArCK rispetto alle cellule di controllo euploide, un indicatore ben consolidato per la senescenza cellulare.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Figura 2: risultati rappresentativi che utilizzano cellule di ArCK. (A) valutazione dei livelli dell'inibitore ciclo cellulare in euploide aneuploid ciclismo e cellule di ArCK macchia occidentale. I livelli di p53, p21 e p16 sono stati determinati mediante analisi western blot. Actina servito come un controllo di carico. (B) β-galattosidasi macchiatura valutazione del livello di senescenza in cellule di ArCK. Attività di β-galattosidasi senescenza-collegata (β-gallone) è stata determinata in euploide e cellule di ArCK. Scala bar 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo arresto del ciclo cellulare è una caratteristica prominente di cellule aneuploidi con karyotypes complessi, come indicato dall'analisi del cariotipo rappresentativo da unicellulare sequenziamento in Figura 3, in cui le cellule ArCK visualizzano multipli, random del cromosoma guadagni e perdite. Questa scoperta è in pieno accordo con precedenti rapporti10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Figura 3: rappresentanza unicellulare sequenziamento delle cellule di ArCK. Segmentazione diagrammi che mostrano il karyotype del rappresentante ArCK sei celle. Segmentazione grafici mostrano il numero di copie di tutti i cromosomi da 1 a X rispetto a un riferimento euploide su una scala di2 log (tipo selvaggio RPE-1 è una linea di cellula diploide di origine femminile). Cromosoma guadagni sono evidenziati in rosso, perdite di cromosoma in verde. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Aneuploide conduce all'instabilità del genoma, che alla fine produce le cellule ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi. Questo documento fornisce un metodo semplice e conveniente per isolare cellule aneuploidi con karyotypes complessi che non smettono di dividersi.

Generazione e l'isolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con Karyotypes complessi

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice per generare e isolare cellule con arresto del ciclo cellulare con cariotipi complessi. Questo metodo può fornire risposte a domande chiave nel campo della ricerca sulle aneuploidie, come l'interazione del sistema immunitario con le cellule aneuploidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genera una popolazione cellulare che ospita solo cariotipi complessi.Per iniziare la sincronizzazione delle cellule hTERT RPE-1, utilizzare cellule appena scongelate e distribuirle in una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri utilizzando otto millilitri di terreno di crescita standard. Quindi, usa un emocitometro per determinare il numero di cellule. Quindi, incubare le cellule durante la notte.Il giorno seguente, sostituire il terreno di coltura standard con un terreno contenente cinque millimolari di timidina. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius per sincronizzare le cellule al bordo G1S. Dopo 24 ore, lavare le celle tre volte con PBS.Quindi, aggiungere un terreno di coltura standard alle cellule lavate e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Per prima cosa, lavare le celle con 10 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un terreno contenente 500 nanomolari di inibitore Mps1 reversina.Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le celle tre volte con PBS. Quindi, aggiungere il terreno di coltura standard e rimettere le piastre nell'incubatrice.Circa 72 ore dopo la prima mitosi aberrante, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un terreno contenente 330 nanomolari di nocodazolo. Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, aspirare il terreno nocodazolico. Quindi aggiungere tre millilitri di PBS al piatto e picchiettare il lato del piatto per scrollarsi di dosso le cellule mitotiche. Ruotare la piastra tra un tocco e l'altro per consentire una rimozione uniforme delle cellule mitotiche.Dopo lo shake-off iniziale, aspirare il liquido che ha aderito al coperchio e al bordo della piastra. Quindi, controllare la lastra al microscopio con un ingrandimento di 10X. Quindi lavare le cellule con cinque millilitri di PBS.Quindi, aggiungere il terreno contenente 330 nanomolari di nocodazolo. Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius. Dopo lo shake-off finale, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura standard.Incubare le cellule per 12-24 ore a 37 gradi Celsius prima di eseguire i saggi. Le cellule che rimangono sulla piastra sono indicate come cellule arrestate con cariotipo complesso o cellule ArCK. Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare le cellule ArCK e diverse caratteristiche specifiche delle cellule ArCK vengono analizzate per confermarne l'isolamento.Le cellule ArCK mostrano livelli aumentati di inibitori del ciclo cellulare p53, p21 e p16 nell'analisi immunoblot, mentre le cellule euploidi e aneuploidi non lo fanno. Inoltre, le cellule ArCK sono positive per la beta-galattosidasi associata alla senescenza, che si colora di blu-verde, mentre le cellule di controllo euploidi non lo sono. I grafici di segmentazione rivelano che le cellule ArCK sono aneuploidi, caratterizzate da guadagni cromosomici multipli e casuali e perdite cromosomiche.I grafici di segmentazione mostrano il numero di copie di singole cellule dal cromosoma uno a X, rispetto a una scala del log di riferimento euploide due. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi di rimuovere tutte le cellule mitotiche durante ogni scuotimento. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi delle citochine.Questi saggi aiuteranno a rispondere a ulteriori domande, come la capacità delle cellule ArCK di interagire con le cellule del sistema immunitario. Non dimenticare che il nocodazolo è pericoloso. Durante l'utilizzo di questo reagente devono essere indossati dispositivi di protezione individuale adeguati.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per isolare in modo efficiente le cellule ArCK in vitro. Questa procedura può essere eseguita in sette giorni se eseguita correttamente.

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Cariotipo è una tecnica semplice e utile ampiamente utilizzato per la rilevazione di alterazioni genetiche. Qui si descrive un passo dal protocollo passo per la preparazione diffusione cromosoma di cellule staminali embrionali umane per monitorare lo stato cromosomico di queste cellule mantenute in coltura.

Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l'uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l'introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Scopri un metodo per isolare cellule ArCK con cariotipi complessi arrestate nel ciclo cellulare. Questa tecnica utilizza sincronizzazione con timidina e nocodazolo per studiare l'aneuploidia e le interazioni con il sistema immunitario.

Generazione e l'isolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con Karyotypes complessi

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