Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule vegetali, come ad esempio il modo in cui le cellule vegetali che crescono in punta penetrano le barriere fisiche cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di acquisire immagini ad alta risoluzione che ricostruiscono il processo di deformazione di una cellula alla fessura su scala micrometrica sotto un microscopio convenzionale. Per realizzare un dispositivo per l'esame dei tubi pollinici in crescita e dei protonemi di muschio, prima fai circa 11 grammi di un PDMS e caricalo in uno stampo da quattro pollici.

Quindi, degasare lo stampo per 20 minuti in una camera a vuoto. Quindi, polimerizzare lo stampo a 65 gradi Celsius per 90 minuti. Una volta indurito, staccare lo strato PDMS dallo stampo e aprire i fori di accesso al canale all'interno del PDMS utilizzando uno strumento di punzonatura per biopsia.

Quindi, esporre il PDMS e il piatto di vetro da cinque centimetri al plasma ad aria per 50 secondi. Per sigillare la rete microfluidica, premere lo strato PDMS sul piatto di vetro e polimerizzarlo per 30 minuti a 65 gradi Celsius. Per realizzare un microdispositivo progettato per l'esame dei peli delle radici, vengono caricati e polimerizzati due stampi.

Quando si perforano i fori del canale, utilizzare un punzone da due millimetri. Dopo aver esposto entrambi gli strati al plasma d'aria per 50 secondi, unirli insieme, compreso un vetrino coprioggetti, sotto uno stereomicroscopio. Usa lo strumento di allineamento su misura per ottenere questo risultato.

Polimerizzare l'assemblaggio per 30 minuti in forno per sigillare la rete microfluidica. Dopo l'indurimento, rimuovere il vetrino coprioggetti dal dispositivo e trasferirlo in un piatto di vetro di cinque centimetri. Prima di utilizzare il microdispositivo del tubo pollinico, degassarlo in una camera a vuoto per 20 minuti.

Aggiungere il terreno di coltura all'ingresso del pistillo utilizzando una micropipetta a punta fine. Caricare gli altri pozzetti con lo stesso fluido. Attendi qualche minuto affinché i canali si riempiano.

Nel frattempo, metti un tovagliolo di carta umido nel piatto per aiutare a mantenere l'umidità locale. Ora, raccogli i granelli di polline da un fiore blu e bianco di T.fournieri. Trasferire i grani sullo stigma utilizzando un ago da dissezione.

Quindi, tagliare uno stilo impollinato lungo un centimetro nel senso della lunghezza, quindi inserire lo stilo tagliato nell'ingresso del dispositivo microfluidico. Quando lo stile di taglio viene inserito nell'ingresso del dispositivo microfluidico con una pinzetta, è importante non tenere lo stile molto stretto perché potrebbe danneggiare lo stile. Quindi, fissare un coperchio sul piatto con del nastro adesivo e trasferire il piatto in un'incubatrice a 28 gradi Celsius dove deve rimanere al buio per cinque o sei ore.

Lavorando sotto una cappa a flusso laminare, iniziare sterilizzando i semi transgenici di A.thaliana Columbia. Immergili nella soluzione detergente per cinque minuti. Quindi, sciacquare accuratamente i semi in acqua sterilizzata in autoclave.

Una volta sterilizzati, conservare i semi a quattro gradi Celsius al buio per 48 ore. Qualche giorno dopo, degassare il microdispositivo per 20 minuti prima di utilizzarlo. Quindi, caricare il terreno di coltura appropriato nei pozzetti del dispositivo utilizzando una pipetta con punta fine e attendere alcuni minuti affinché la soluzione venga aspirata attraverso tutti i canali.

Inoltre, carica un tovagliolo di carta umido sul piatto per mantenere l'umidità. Ora, trasferisci un seme preparato nell'ingresso del dispositivo. Quindi, fissare il coperchio con del nastro adesivo e trasferire il piatto in un'incubatrice a 22 gradi Celsius con luce continua.

Prima del suo utilizzo, sterilizzare il microdispositivo sotto UV durante la notte. Il giorno seguente, degassare il microdispositivo per 20 minuti. Una volta degassati, caricare i micropozzetti con il terreno di coltura appropriato.

Mentre i canali si riempiono gradualmente, circonda il microdispositivo con un po' di acqua sterilizzata in autoclave per mantenere l'umidità. Trasferire un piccolo pezzo di tessuto protonemata di muschio all'ingresso del microdispositivo. Ora, coltiva il dispositivo a 25 gradi Celsius sotto luce continua.

Dopo due o tre settimane di crescita, scattare immagini in campo chiaro dei risultati al microscopio. Le cellule vegetali che crescono a punta incontrano una serie di barriere fisiche lungo i loro percorsi di crescita in vivo, come nel tratto di trasmissione e nel micropilo, per non parlare del percorso dei peli radicali nel terreno. Le piattaforme di coltura cellulare microfluidica in vitro presentate consentono l'esame del processo di crescita delle punte in tre tipi di cellule vegetali, tubi pollinici, peli radicali e protonemi di muschio.

La visualizzazione avviene attraverso fessure di un micron nei dispositivi. Poiché i micro-spazi di queste dimensioni sono fragili, a volte si chiudono, soprattutto dopo un uso ripetuto. Pertanto, è importante verificare che gli spazi vuoti siano intatti prima di eseguire gli esperimenti.

Per lo studio del tubo pollinico, l'imaging delle cellule vive è stato utilizzato per monitorare i cambiamenti morfologici nella regione apicale dei tubi pollinici, nonché nel nucleo vegetativo e negli spermatozoi in risposta all'incontro con uno spazio estremamente piccolo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule vegetali per esplorare la capacità di allungamento delle cellule vegetali che crescono sulla punta, come i tubi pollinici, i peli delle radici e i protonemi di muschio in uno spazio estremamente piccolo.