Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti
22 maggio 2018
Descriviamo un metodo per indagare la capacità di crescita punta di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, allunga attraverso lacune estremamente strette (~ 1 µm) in un dispositivo microfluidico.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule vegetali, come ad esempio il modo in cui le cellule vegetali che crescono in punta penetrano le barriere fisiche cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di acquisire immagini ad alta risoluzione che ricostruiscono il processo di deformazione di una cellula alla fessura su scala micrometrica sotto un microscopio convenzionale. Per realizzare un dispositivo per l'esame dei tubi pollinici in crescita e dei protonemi di muschio, prima fai circa 11 grammi di un PDMS e caricalo in uno stampo da quattro pollici.
Quindi, degasare lo stampo per 20 minuti in una camera a vuoto. Quindi, polimerizzare lo stampo a 65 gradi Celsius per 90 minuti. Una volta indurito, staccare lo strato PDMS dallo stampo e aprire i fori di accesso al canale all'interno del PDMS utilizzando uno strumento di punzonatura per biopsia.
Quindi, esporre il PDMS e il piatto di vetro da cinque centimetri al plasma ad aria per 50 secondi. Per sigillare la rete microfluidica, premere lo strato PDMS sul piatto di vetro e polimerizzarlo per 30 minuti a 65 gradi Celsius. Per realizzare un microdispositivo progettato per l'esame dei peli delle radici, vengono caricati e polimerizzati due stampi.
Quando si perforano i fori del canale, utilizzare un punzone da due millimetri. Dopo aver esposto entrambi gli strati al plasma d'aria per 50 secondi, unirli insieme, compreso un vetrino coprioggetti, sotto uno stereomicroscopio. Usa lo strumento di allineamento su misura per ottenere questo risultato.
Polimerizzare l'assemblaggio per 30 minuti in forno per sigillare la rete microfluidica. Dopo l'indurimento, rimuovere il vetrino coprioggetti dal dispositivo e trasferirlo in un piatto di vetro di cinque centimetri. Prima di utilizzare il microdispositivo del tubo pollinico, degassarlo in una camera a vuoto per 20 minuti.
Aggiungere il terreno di coltura all'ingresso del pistillo utilizzando una micropipetta a punta fine. Caricare gli altri pozzetti con lo stesso fluido. Attendi qualche minuto affinché i canali si riempiano.
Nel frattempo, metti un tovagliolo di carta umido nel piatto per aiutare a mantenere l'umidità locale. Ora, raccogli i granelli di polline da un fiore blu e bianco di T.fournieri. Trasferire i grani sullo stigma utilizzando un ago da dissezione.
Quindi, tagliare uno stilo impollinato lungo un centimetro nel senso della lunghezza, quindi inserire lo stilo tagliato nell'ingresso del dispositivo microfluidico. Quando lo stile di taglio viene inserito nell'ingresso del dispositivo microfluidico con una pinzetta, è importante non tenere lo stile molto stretto perché potrebbe danneggiare lo stile. Quindi, fissare un coperchio sul piatto con del nastro adesivo e trasferire il piatto in un'incubatrice a 28 gradi Celsius dove deve rimanere al buio per cinque o sei ore.
Lavorando sotto una cappa a flusso laminare, iniziare sterilizzando i semi transgenici di A.thaliana Columbia. Immergili nella soluzione detergente per cinque minuti. Quindi, sciacquare accuratamente i semi in acqua sterilizzata in autoclave.
Una volta sterilizzati, conservare i semi a quattro gradi Celsius al buio per 48 ore. Qualche giorno dopo, degassare il microdispositivo per 20 minuti prima di utilizzarlo. Quindi, caricare il terreno di coltura appropriato nei pozzetti del dispositivo utilizzando una pipetta con punta fine e attendere alcuni minuti affinché la soluzione venga aspirata attraverso tutti i canali.
Inoltre, carica un tovagliolo di carta umido sul piatto per mantenere l'umidità. Ora, trasferisci un seme preparato nell'ingresso del dispositivo. Quindi, fissare il coperchio con del nastro adesivo e trasferire il piatto in un'incubatrice a 22 gradi Celsius con luce continua.
Prima del suo utilizzo, sterilizzare il microdispositivo sotto UV durante la notte. Il giorno seguente, degassare il microdispositivo per 20 minuti. Una volta degassati, caricare i micropozzetti con il terreno di coltura appropriato.
Mentre i canali si riempiono gradualmente, circonda il microdispositivo con un po' di acqua sterilizzata in autoclave per mantenere l'umidità. Trasferire un piccolo pezzo di tessuto protonemata di muschio all'ingresso del microdispositivo. Ora, coltiva il dispositivo a 25 gradi Celsius sotto luce continua.
Dopo due o tre settimane di crescita, scattare immagini in campo chiaro dei risultati al microscopio. Le cellule vegetali che crescono a punta incontrano una serie di barriere fisiche lungo i loro percorsi di crescita in vivo, come nel tratto di trasmissione e nel micropilo, per non parlare del percorso dei peli radicali nel terreno. Le piattaforme di coltura cellulare microfluidica in vitro presentate consentono l'esame del processo di crescita delle punte in tre tipi di cellule vegetali, tubi pollinici, peli radicali e protonemi di muschio.
La visualizzazione avviene attraverso fessure di un micron nei dispositivi. Poiché i micro-spazi di queste dimensioni sono fragili, a volte si chiudono, soprattutto dopo un uso ripetuto. Pertanto, è importante verificare che gli spazi vuoti siano intatti prima di eseguire gli esperimenti.
Per lo studio del tubo pollinico, l'imaging delle cellule vive è stato utilizzato per monitorare i cambiamenti morfologici nella regione apicale dei tubi pollinici, nonché nel nucleo vegetativo e negli spermatozoi in risposta all'incontro con uno spazio estremamente piccolo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule vegetali per esplorare la capacità di allungamento delle cellule vegetali che crescono sulla punta, come i tubi pollinici, i peli delle radici e i protonemi di muschio in uno spazio estremamente piccolo.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per investigare la capacità di allungamento delle cellule vegetali in crescita apicale, come i tubi pollinici e i protonemati di muschio, attraverso strette fessure in un dispositivo microfluidico. La tecnica consente un'imaging ad alta risoluzione dei processi di deformazione cellulare a scala micrometrica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare Vegetale
- Microfluidica
- Meccanica Cellulare
Background
- Le cellule vegetali in crescita apicale svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo delle piante.
- Comprendere come queste cellule penetrino le barriere fisiche è essenziale per far progredire la biologia vegetale.
- I dispositivi microfluidici possono simulare ambienti ristretti per lo studio cellulare.
- Le tecniche di imaging ad alta risoluzione sono vitali per osservare i processi cellulari.
Obiettivo dello Studio
- Investigare la capacità delle cellule vegetali in crescita apicale di allungarsi attraverso strette fessure.
- Fornire informazioni sui meccanismi di penetrazione cellulare attraverso le barriere.
- Sviluppare un metodo affidabile per studiare la deformazione cellulare in ambienti controllati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un dispositivo microfluidico PDMS.
- Sgassaggio dello stampo in una camera di vuoto.
- Polimerizzazione del PDMS a 65 gradi Celsius.
- Creazione di fori di accesso nel PDMS utilizzando uno strumento di biopsia a pugno.
Risultati Principali
- Il metodo consente con successo l'osservazione dei tubi pollinici e dei protonemati di muschio.
- Le immagini ad alta risoluzione rivelano i processi di deformazione delle cellule.
- Le cellule possono allungarsi attraverso fessure piccole quanto 1 µm.
- La tecnica fornisce dati preziosi per comprendere il comportamento cellulare in spazi confinati.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la comprensione delle cellule vegetali in crescita apicale.
- Offre un nuovo approccio per studiare la meccanica cellulare nella biologia vegetale.
- I risultati potrebbero avere implicazioni per la ricerca agricola e biologica.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how physical constraints influence tip growth dynamics and subcellular reorganization in live cells.
- Operational Value: Provides a reproducible platform to correlate gap size with elongation success rates across cell types.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether cytoskeletal or nuclear positioning changes are required for barrier transit.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on penetration efficiency and morphological changes under controlled micron-scale confinement.
- Operational Value: Standardizes gap dimensions (e.g., ~1 µm) to ensure assay consistency across experiments and laboratories.
- Scalability: Permits parallel testing of multiple cell lines or genetic variants in identical microfluidic networks.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects cellular responses to physical stress with potential biomarkers of growth adaptation or failure.
- Operational Value: Enables time-lapse tracking of fluorescently labeled components (e.g., nucleus, sperm cells) to correlate structural changes with functional outcomes.
- Predictive Confidence: Offers a disease-relevant system analog for studying how cells navigate restrictive microenvironments, analogous to extracellular matrix penetration in mammalian systems.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how mechanical confinement alters tip growth kinetics and intracellular trafficking.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs on cell deformation and transit success for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of elongation rates, nuclear displacement, and shape recovery as dependent variables for condition comparison.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system to model how cells adapt to spatial constraints, supporting extrapolation to invasive growth phenotypes.
- Enterprise Reuse: Reusable PDMS-glass platforms allow longitudinal studies and cross-project standardization in mechanobiology screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces ambiguity in linking physical stimuli to cellular responses by enabling direct observation of deformation processes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, plasma bonding, and gap verification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by clarifying whether observed growth defects stem from intrinsic capacity or extrinsic barrier resistance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on their resilience to mechanical stress in confined microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to vacuum degassing equipment, plasma treatment systems, and precision punch tools for channel formation.
- Necessitates standardized protocols for gap integrity verification prior to each experiment to prevent false-negative results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system between pollen tubes, root hairs, and moss protonemata due to differing growth rates and medium needs.
- Limited by the fragility of sub-micron gaps, which may deform or close after repeated use, requiring routine inspection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:28
Fabricating the PDMS Microdevices
2:11
In Vitro Culturing of T. fournieri Pollen Tubes in the Microdevice
3:31
In Vitro Culturing of A. thaliana Root Hairs in the Microdevice
4:40
In Vitro Culturing of P. patens (moss) Protonemata in the Microfluidic Device
5:31
Results: Microfluidic Device Design and Time-lapse Imaging of Pollen Tube Growth
6:37
Conclusion
